PLoS ONE: Linkage Specifik fucosylering af Alpha-1-antitrypsin i levercirrose og kræftpatienter: Konsekvenser for en biomarkør for hepatocellulært carcinom

Abstrakt

Baggrund

Vi har tidligere rapporteret forhøjede niveauer af protein-koblet fucosylering med udvikling af leverkræft og identificeret mange af de proteiner, der indeholder de ændrede glykanstrukturer. Et sådant protein er alpha-1-antitrypsin (A1AT). For at fremme disse undersøgelser, vi udførte N-bundet glycan analyse af de fem store isoformer af A1AT og gennemført en omfattende undersøgelse af glycosyleringen af ​​A1AT findes i raske kontrolpersoner, patienter med hepatitis C- (HCV) induceret levercirrose, og hos patienter inficeret med HCV med en diagnose af hepatocellulært carcinom (HCC).

Metodologi /vigtigste resultater

Patienter med skrumpelever og leverkræft havde forhøjede niveauer af triantennære glycan-holdige ydre arm (α-1, 3) fucosylering. Stigninger i kerne (α-1,6) fucosylering blev kun observeret på A1AT fra patienter med cancer. Vi udførte en lektin fluorophor-linked immunosorbentassay bruge

Aleuria aurantia

lektin (AAL), specifik for kerne og ydre arm fucosylering i over 400 patienter med leversygdom. AAL-reaktivt A1AT kunne detektere HCC med en følsomhed på 70% og en specificitet på 86%, hvilket var større end den observeret med den aktuelle markør for HCC, alpha-fetoprotein. Glycosylering analyse af de falske positiver blev udført; resultater viste, at disse patienter havde stigninger i ydre arm fucosylering men ikke i kernen fucosylering, tyder på, at kernen fucosylering er kræft specifik.

Konklusioner /Betydning

Denne rapport beskriver den trinvise ændring i glycosyleringen af A1AT med progression fra skrumpelever til kræft og identificerer centrale fucosylering på A1AT som HCC særlig modifikation

Henvisning:. Comunale MA, Rodemich-Betesh L, Hafner J, Wang M, Norton P, Di Bisceglie AM, et al. (2010) Linkage Specifik fucosylering af Alpha-1-antitrypsin i levercirrose og kræftpatienter: Konsekvenser for en biomarkør for hepatocellulært carcinom. PLoS ONE 5 (8): e12419. doi: 10,1371 /journal.pone.0012419

Redaktør: Wang-Shick Ryu, Yonsei University, Republikken Korea

Modtaget: Juni 15, 2010; Accepteret: 22 Juli 2010; Udgivet: 25 August, 2010

Copyright: © 2010 Comunale et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud R01 CA120206-01 fra National Cancer Institute (NCI), give UO1 CA084951-06 fra NCI Tidlig Research Detection Hepatitis B Foundation Network (EDRN), og en bevilling fra The Commonwealth of Pennsylvania. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Infektion med hepatitis B virus (HBV) eller hepatitis C-virus (HCV) er den væsentligste ætiologi hepatocellulær cancer (HCC) [1] – [4]. Både HBV og HCV forårsager akut og kronisk lever- infektioner, og mest kronisk inficerede individer forbliver asymptomatisk i mange år [5]. Omkring 10% til 40% af alle kroniske HBV-bærere tiden udvikle leverkræft, og det anslås, at over en million mennesker verden over dør på grund af HBV og HCV-associeret levercancer [2], [6], [7]. Faktisk er HBV og HCV-infektioner er forbundet med over 80% af alle tilfælde af HCC verdensplan og kan være så højt som 96% i regioner, hvor HBV er endemisk [3].

progression af leversygdom til leverkræft primært overvåget ved serumniveauer af den onkoføtalt glycoprotein, alfa-fetoprotein (AFP), eller kernen fucosyleret glycoform af AFP, AFP-L3. AFP kan dog blive produceret i mange tilfælde, herunder i forhold til andre leversygdomme [8] – [10] og er ikke til stede i alle dem med HCC [11]. Derfor har sat spørgsmålstegn brugen af ​​AFP som en primær skærm for HCC [12], og der er behov for mere følsomme serum biomarkører for HCC.

glycosyleringen af ​​proteiner er celle specifik. Den N-bundet glycosylering af et protein afspejler ændringer, der fandt sted i den celle, hvorfra det kom [13]. Glycosylering af det samme protein secerneres fra sygt væv, maligne celler eller normale celler kan, og ofte gør, adskiller [14]. Vi, og andre har observeret ændringer i N-bundet glycosylering med udvikling af cirrose og HCC [15] – [19]. Specifikt mængden af ​​kernen fucosylerede N-bundet glycan hidrørende fra de samlede proteinpræparater isoleret fra serum fra individer kronisk inficerede med HCV og fra dem med en diagnose af HCC var konsekvent større end hos raske patienter eller hos patienter med HCV og “inaktiv “sygdom [19].

Brug fucose-specifikke lectiner til at identificere de proteiner, der bliver fucosylerede hos patienter med leversygdom, der er konstateret vi mere end 100 glycoproteiner fra patienter med HCC og /eller cirrose, der indeholdt øget fucosylering [19 ]. Et af disse proteiner var alfa-1-antitrypsin (A1AT). Vi analyserede N-bundet glycosylering af de fem store isoformer af A1AT og opdagede, udover øget kerne fucosylering, signifikante stigninger i ydre arm fucosylering med udviklingen af ​​leverkræft. Ved hjælp af en lectin-baseret assay målte vi ændringen i over 400 patienter med leversygdom og fundet AAL reaktiv A1AT kunne detektere HCC med en følsomhed på 70% og en specificitet på 86% under anvendelse af en afskæring på 5 relative enheder. Glycan analyse af de falske positiver identificeret ydre arm fucosylering som værende årsag til falsk positivitet. I modsætning hertil blev der stigninger i core fucosylering kun findes hos patienter med cancer. Årsagerne til denne ændring og den kliniske anvendelighed af denne ændring diskuteres.

Materialer og metoder

Etik Statement

Både Drexel University College of Medicine og Saint Louis University Institutional Review Boards godkendte forsøgsprotokollen, der var i overensstemmelse med de standarder fastsat af Helsinki-erklæringen af ​​1975. skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver deltager.

Patienter

Serumprøver blev opnået fra Saint Louis University School of Medicine (Saint Louis, MO). Demografiske og kliniske oplysninger sammen med en blodprøve blev indsamlet fra hver deltager i et serum separator rør. Prøven blev spundet i løbet af 2 timer, og serummet blev opbevaret ved -80 ° C indtil test. Patienterne blev indskrevet i Saint Louis University leverkræft Clinic og HCC blev diagnosticeret ved hjælp af de samme kriterier, for HALT-C forsøg [20]. Deltagerne havde HCC identificeret ved biopsi, med en ny hepatisk defekt viser vaskulær forbedring på én imaging modalitet (ultralyd [US], magnetisk resonans [MR], eller computertomografi [CT]) med AFP-niveauer 1000 ng /ml, eller af formodet HCC. Deltagerne blev formodes at have HCC hvis de havde en diskret hepatisk defekt på USA med AFP-niveauer 1000 ng /ml og enten to andre scanninger (MRI, CT, angiografi) indikerer malignitet med mindst en af ​​følgende egenskaber: hypervaskularitet, arteriel at portåren shunts, portal venetrombose nær defekten, tumor i portalen vene, eller en anden scanning (MRI eller CT) viser funktioner karakteristiske for HCC og enten en stigning i størrelse over tid efter indledende opdagelse (mindst en fordobling, hvis mindre end 1 cm) eller en stigning i niveauet af AFP til 200 ng /ml. Tumor iscenesættelse blev bestemt ved anvendelse af Forenede Netværk af Organ Sharing-modificeret (UNOS) TNM for HCC. For skrumpelever gruppen blev patienter med hepatitis C og biopsi-verificeret skrumpelever tilmeldt. Alle cirrotiske kontroller blev screenet for HCC bruger USA, CT eller MR før indskrivning. Patienter, som var HBsAg + (med eller uden HBV DNA blev klassificeret i HBV-gruppen. Tilsvarende patienter, som var HCV-RNA positive, uden tegn på cirrose, blev klassificeret i HCV gruppe. Patienter med andre ikke viral leversygdom men uden cirrose var klassificeret i den anden leversygdom gruppe (OLD). Styr patienterne var raske patienter rekrutteret i undersøgelsen til at fungere som kontroller.

todimensionale (2-D) gelelektroforese

i alt 7 pi serum blev fortyndet i 330 pi solubiliseringsbuffer indeholdende 7 M urinstof, 2 M thiourinstof, 4% CHAPS, 65 mM DTT, 5 mM tributylphosphin, og en blanding 0,4% af bærer-ampholytter (Servalyt pH 2-4, pH 3 -10, pH 9-1, 01:02:01). prøver blev hvirvlet periodisk i 1 time og påført en 18-cm pH 3-7 NL immobiliseret pH-gradient (IPG) strimler (Amersham, Piscataway, NJ, USA) . Gel rehydrering blev udført i 14 timer ved 50 V og fokuseret ved hjælp af IPGPhor (Amersham) isoelektrisk fokusering apparat. efter fokusering, gelstrimler blev først reduceret alkyleres derefter i 6 M urinstof, 2% SDS, 30% glycerol, 50 mM Tris, pH 6,8, og enten 30 mM DTT eller 75 mM iodacetamid i 10 minutter hver. Den anden dimension blev løst med en 8% til 18% acrylamid-0,8% PDA gradient gel på en Protean II xi Cell (Biorad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA) med de driftsforhold indstillet til 20 mA /gel i 20 min og 40 mA /gel i 4 timer. Geler blev fikseret og farvet med kolloid Coomassie. Geler blev afbildet ved hjælp af Odyssey Infrared Imaging System (Li-Cor Biosystems, Lincoln, Nebraska) og analyseret ved hjælp af ikke-lineær dynamik Progenesis Workstation gel imaging software (ikke-lineær Durham, NC, USA).

Matrix-Assisted Laser Desorption /ionisering-Time of Flight (MALDI-TOF) massespektrometri

Protein pletter blev udskåret fra kolloid Coomassie blå farvede geler, affarvet, og fordøjet med trypsin. Nyttiggjorte peptider blev opkoncentreret og afsaltet ved anvendelse ZipTip C18 (Millipore, Bedford, MA, USA) i overensstemmelse med producentens anvisninger og forberedt til MALDI-TOF-massespektrometri ved blanding 0,5 ml peptidblanding med 0,5 ml 10 mg /ml α-cyan- 4-hydroxykanelsyre og 1% myresyre i 50% acetonitril og lade dråben til tørre på MALDI plade. Peptidmasse kort blev opnået ved anvendelse af en Voyager-DE Pro massespektrometer (Applied Biosystems, Life Biotechnologies, Carlsbad, CA) anvendes i positiv ion reflectron mode. Proteiner blev identificeret fra peptid masse kort ved hjælp af MASCOT online database (www.matrixscience.com) for at søge den redundante protein database.

Glycan Analyse

2DE gel pletter blev udskåret og affarvet hjælp 40% methanol 7% eddikesyre. Gelen stikpropper blev dehydreret med acetonitril, blev acetonitrilen fjernet, og 25 mM DTT fik lov til at absorbere i proppen. Proppen blev opvarmet til 100 ° C i 5 minutter, fik lov til at afkøle, og alkyleres i mørke i 30 minutter med 75 mM iodacetamid. Gelen stikpropper blev vasket under anvendelse af to gentagelser af acetonitril dehydrering og 20 mM ammoniumbicarbonat rehydrering. Efter en sidste dehydrering blev gel stikpropper tørret i en Speed ​​Vac. Peptide:N-glycosidase F (PNGase F) blev fortyndet med 20 mM ammoniumbicarbonat, pH 7 og får lov at adsorbere i gelen stik. Gelen stikket blev derefter dækket med den samme opløsning og fik lov at inkubere natten over ved 37 ° C. Glycanerne blev elueret fra gelen stik ved lydbehandling i Milli-Q-vand tre gange; elueringsmidlet blev samlet, tørret ned, og mærket med en 2AB farvestof (Ludger, Oxford, UK) ifølge producentens instruktioner. Glycanerne blev derefter renset ved hjælp af papirchromatografi og filtreret med et 0,22 um sprøjtefilter. Fluorescensmærkede glycaner blev efterfølgende analyseret ved anvendelse af Waters Alliance HØJTRYKSVÆSKEKROMATOGRAFI system med en normal fase-søjle (TSK amid 80 kolonner) suppleret med en Waters fluorescensdetektor og kvantificeret under anvendelse Millennium Kromatografi Manager (Waters Corporation, Milford, MA). Den mobile fase bestod af opløsningsmiddel A (50 mM ammoniumformiat, pH 4,4) og opløsningsmiddel B (acetonitril). Den anvendte gradient var som følger: lineær gradient fra 20% til 58% opløsningsmiddel A ved 0,4 ml /minut i 152 minutter efterfulgt af en lineær gradient fra 58% til 100% opløsningsmiddel A til den næste 3 min. Strømningshastigheden blev forøget til 1,0 ml /minut; søjlen blev vasket i 100% opløsningsmiddel A i 5 min. Efter vasketrinet blev søjlen ækvilibreret i 20% opløsningsmiddel A i 22 min i forberedelse til den næste prøve. Glykanstrukturer blev identificeret ved at beregne glukoseoptagelse værdi og exoglycosidase fordøjelse, som tidligere beskrevet [21].

lectin-fluorofor-bundet immunosorbentassay (FLISA)

indfangende antistof (mus antihuman A1AT , ABD Serotec, Raleigh NC, USA), blev inkuberet med 10 mM natriumperiodat i 1 time ved 4 ° C. Denne behandling sikrer lectin ikke er i stand til at reagere med glycosylering af antistoffet og ikke påvirker antistof substratbinding. Et tilsvarende volumen af ​​ethylenglycol blev tilsat, og det oxiderede antistof blev bragt til en koncentration på 10 ug /ml med natriumcarbonat, pH 9,5. Antistof (5 ug /brønd) blev tilsat til pladen og efter inkubation blev vasket med 0,1% Tween 20 mM phosphatbufret saltvand, pH 7,4. Pladen blev blokeret natten over med 3% bovint serumalbumin /phosphatpufret saltvand. Til analyse blev 5 pi serum fortyndet i 95 pi blokerende reagens i heterofile Blokering Tubes

tm (Scantibodies Laboratory, Inc. Santee, CA, USA) og blev inkuberet ved stuetemperatur i 1 time. Efterfølgende prøver blev tilsat til pladerne i 2 timer og vasket 5 gange i lectin inkubationsbuffer (10 mM Tris pH 8,0, 0,15 M NaCl, 0,1% Tween 20). Fucosylerede A1AT blev påvist med et biotin-konjugeret

Aleuria aurantia

lectin (AAL) (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Bundet lectin blev påvist under anvendelse IRDye 800 konjugeret streptavidin; signalintensiteten blev målt ved anvendelse af Odyssey infrarøde billeddannende system (LI-COR Biotechnology, Lincoln, Nebraska). I alle tilfælde blev signalintensiteter sammenlignet med de for signaler detekteres med kommercielt købt humant serum (Sigma Chemicals). Det lectin-FLISA registrerer mængden af ​​fucosylering stede på en tilsvarende mængde molekyler indfanget fra hver patientprøve og udføres på en måde, uafhængig af den totale mængde af protein i en given patient.

Statistisk analyse

Beskrivende statistik for iscenesatte patienter blev sammenlignet med scatter plots, der omfattede de outliers. Alle værdier blev rapporteret som middelværdier plus eller minus standardfejlen medmindre andet er angivet. Da dataene ikke fulgte typiske Gauss-fordeling, en nonparametrical test (to-halet, 95% sikkerhed, Mann-Whitney-test) blev anvendt til bestemmelse statistisk forskel mellem grupperne. For at bestemme den optimale cutoff værdi for hver markør, blev modtageren drift karakteristiske kurver konstrueret ved hjælp af alle mulige cutoffs for hver analyse. Arealet under Receiver Operating karakteristiske kurve blev konstrueret og sammenlignes som tidligere beskrevet. En to-halet P-værdi på 0,05 blev anvendt til at bestemme statistisk signifikans. Alle analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism (San Diego, CA, USA).

Resultater

Niveauer af A1AT og Grad af Sialyation i patienter med levercirrose og HCC

Pooled sera fra raske patienter (n = 20), patienter med levercirrhose (n = 20) og patienter med HCC med en baggrund af cirrose (n = 20) blev resolveret via 2-D gelelektroforese (2DE) (tabel 1). Figur 1A viser en repræsentativ 2-DE på normalt humant serum og figur 1B, 1C og 1D viser et fokus på de 5 isoformer (M1, M2, M4, M6 og M7) af A1AT fra de tre patientgrupper. Tre større og to mindre A1AT isotyperne er almindeligt ses, når humant serum er isoelektrisk fokuseret og køre på en 2-D gel [22], [23], og disse er ikke ændret i de tre patientgrupper. De A1AT koncentrationer i hver patientgruppe var sammenlignelige (figur 1 E-1G) og faldt inden for normale serumkoncentrationer. Dette resultat blev bekræftet ved at analysere A1AT et enzymbundet immunsorbentassay (ELISA), hvorved A1AT niveauer var 3,2 mg /ml i kompositten fra raske patienter, 3,3 mg /ml i kompositten fra cirrosepatienter, og 3,3 mg /ml i kompositten fra HCC-patienter.

Sera fra puljer af raske kontroller (A, B, E) og cirrose (C, F) og cancer (D, G) patienter blev fokuseret ved hjælp IPGPhor 3-7 NL første dimension strimler efterfulgt af SDS-PAGE separation på 8% til 18% acrylamidgeler. Den pI af udvalgte gel pletter er M1 = 4,91, M2 = 4,95, M4 = 5.00, M6 = 5,05, og M7 = 5.10. Paneler E, F og G viser den relative forekomst af hver gel plet.

Vi udførte glycan analyse af M1, M2, M4, M6 og M7-isotyper fra puljer af sera fra normale deltagere og cirrose og HCC patienter (figur 1B-1D) og undersøgte sialyleringen mønstre af hver isotype. Figur S1 viser et repræsentativt glycan profil for M4 isotypen fra kontrollerne. I overensstemmelse med resultaterne af tidligere undersøgelser [24], den biantennær glycan er de mest udbredte arter. Figur S1-B viser niveauet for sialyated biantennær og triantennære glycan forbundet med hver isoformer fra hver patientgruppe. Som S1-B viser, at niveauet af sialyation på bi-anntennery glycan (A2G2S1 eller A2G2S2) var ens i de forskellige patientgrupper. Tilsvarende blev niveauet for sialyation ikke ændret på triantennære glycan. Imidlertid var der en stigning i niveauet af tri-sialyated α-1,3 bundet fucosylerede ydre arm -fucosylerede glycan (A3F (3) 1G3S3) om A1AT fra cancerpatienter, sammenlignet med de raske og cirrotiske patienter. Disse top er angivet i figur S1A B med en stjerne.

forhøjede niveauer af Core og Ydre Arm fucosylering observeres på A1AT fra patienter med HCC

For at teste, om det øgede niveau af tri-sialyated α-1,3 tilknyttede fucosylerede ydre arm -fucosylerede glycan (A3F (3) 1G3S3) var resultatet af en stigning i sialyation eller en stigning i den samlede mængde af forælder glycan blev sialsyre fjernet enzymatisk og prøven re-analyseret. Figur 2 viser det forenklede desialyleret glycoprofile af de fem store isoformer for hver af patientgruppe efter behandling med neuraminidase (

Arthrobacter bacter ureafaciens

). Tre toppe af interesse, der er markeret med en stjerne i figur 2, er reproducerbart ændres i M1, M2, og M4 isoformer som den syge lever skrider fra skrumpelever til kræft. Sekventiel exoglycosidase fordøjelse (data ikke vist) viste disse toppe skal en kerne fucosylerede biantennær glycan (F (6) A2G2), en triantennær glycan (A3G3), og en triantennær glycan med en enkelt α 1,3 koblet ydre arm fucose rest ( A3F (3) 1G3). Figur 3A viser en repræsentativ desialyleret profil med den tilsvarende glycan struktur identificeret for hver top. Tabel 2 er en kvantificering af hver glycan struktur til stede på de fem store isoformer for hver patientgruppe. Specifikke ændringer i glykosylering er observeret i de A1AT isoformer med progression til skrumpelever og HCC. På M6, isoformen med meget lidt tri og tetra-antennære strukturer, den biantennær kerne -fucosylerede glycan (F (6) A2G2), udgør 4,48% i normale patienter, 4,37% hos patienter med cirrose, og 7,04% hos patienter med cancer, en tendens set over hver isoformer (tabel 2, glycan 3). Den procentvise ændring mellem sunde og cirrose og mellem skrumpelever og kræft er givet i figur 3C og viser, at denne struktur ændrer sig med kræft kun. I M4, de triantennære glycan med en ydre arm fucose rest (A3F (3) 1G3) stiger fra 4,34% i normale deltagere til 6,78% hos patienter med skrumpelever, og 13,18% hos patienter med skrumpelever plus kræft. Igen er denne tendens ses i hver af de isoformer, med undtagelse af M6 skyldes den totale mangel på triantennære strukturer (tabel 2, glycan 8). Den relative stigning i hver af disse fucosylerede glykanstrukturer som en funktion af sygdom er vist i figur 3B og viser, at dette strukturer ændringer i både levercirrose og HCC. Stigningen i det ydre arm fucosylering var også forbundet med et fald i den forælder N-bundne glycan. Det vil sige, at stigningen i den ydre arm -fucosylerede triantennære glycan, A3F (3) 1G3, var forbundet med et fald i triantennær glycan A3G3. (Tabel 2, glycan 6).

De store toppe, der er ændret, er angivet med en stjerne og er (fra venstre til højre) en kerne fucosylerede bianntennary glycan (F96) A2G2), en trianntennary N-koblet glycan og et trianntennary N-koblet glycan med en enkelt ydre arm fucose-rest (A3F [3] 3). Procenten af ​​hver af disse toppe i forskellige isoformer og i de forskellige patientgrupper er vist i tabel 2.

(A) Et repræsentativt N-bundet glycan profil fra en normal kontrol patient. De 11 store glykanstrukturer identificerede er angivet og får et nummer. Dette nummer bruges i tabel 2 med struktur betegnelser. Den relative ændring i niveauet af trianntennary N-koblede glycan med en enkelt ydre arm fucose-rest (A3F [3] G3) (B) og kernen fucosylerede bianntennary glycan (F [6] A2G2) (C) i normalt at cirrotisk og cirrose i HCC er vist som procent ændring. Som Denne figur viser, er stigninger i det ydre arm fucosylering forbundet med både skrumpelever og HCC, mens øget kerne fucosylering kun observeret med HCC.

Analyse af -fucosylerede A1AT af Lectin-FLISA i en kohorte af 458 patienter

for yderligere at undersøge, om ændringer i både kerne og ydre arm fucosylering kunne ses i de enkelte patienter og potentielt bruges som en diagnostisk markør for kræft, vi analyserede en patient kohorte bestående af 458 patienter til niveau af fucosylerede A1AT anvendelse af en lectin-FLISA baseret assay. I dette assay blev A1AT taget med et monoklonalt antistof og niveauet af fucosylering blev bestemt under anvendelse af fucose-bindende AAL. AAL genkender både ydre arm og kerne fucosylerede glycan. Tyve patienter uden tegn på leversygdom blev brugt som kontrol; 33 patienter inficeret med HBV havde en ukendt grad af leverfibrose; 215 patienter inficeret med HCV havde en ukendt niveau af leverfibrose; 65 patienter havde levercirrose; 62 patienter havde andre leversygdomme; og 63 patienter havde levercancer (tabel 1). Figur 3A viser det relative niveau af fucose lectin-reaktivt A1AT i de seks patientgrupper. Værdier er angivet som fold forøgelse i forhold til niveauet i kommercielt købt “normal” sera. Gennemsnittet og 95% konfidensinterval på middelværdien er vist for hver gruppe. Vi fandt en klar statistisk forskel mellem HCC-gruppen og alle andre grupper (P 0,0001) og mellem den syge gruppe og kontrolgruppen (P = 0,0173), men ikke mellem andre grupper (figur 3A). Gennemsnitshøjden af ​​lectin-reaktivt A1AT var 1,4 gange (± 0,80) ovenfor sigma i kontrolgruppen, 1,7 gange (± 0.1.8) i gruppen inficeret med HBV, 1,9 gange (± 1,8) i gruppen inficeret med HCV, 2,6-fold (± 2,3) i gruppen med skrumpelever, 2,6 gange (± 2,0) i gruppen med andre leversygdomme, og 7,70 gange (± 4,45) i gruppen med HCC. Overraskende, var der ingen forskel i den gennemsnitlige niveau af AAL-reaktivt A1AT i HCC patienter i forhold til den fase af HCC (data ikke vist). Det er patienter med stadium 1 HCC, som defineret som en enkelt læsion på mindre end 2 cm [11], havde en 9,1 gange (± 4,70) stigning i niveauet af AAL reaktiv A1AT mens patienter med stadium 4 HCC (dem med flere læsioner 6cm i diameter) havde et gennemsnit på 6,7 fold (± 5,54), hvilket ikke var anderledes end observeret i fase 1 patienter (

s

= 0,114)

i denne kohorte, fucosylerede. A1AT kunne skelne mellem HCC og ikke-HCC sager med et område under modtageren operatør kurven (AUROC) på 0,871. Når man sammenligner kun HCC versus skrumpelever, den diskriminerende evne var 0,867. Ved hjælp af en cut-off af 5 relative enheder AAL reaktiv A1AT kunne skelne HCC fra skrumpelever med en følsomhed på 70% og en specificitet på 86%. I modsætning hertil AFP, når de analyseres i denne kohorte, havde en AUROC af 0,764 og kunne skelne HCC fra skrumpelever med en følsomhed på 59% og en specificitet på 93% ved hjælp af en cut-off på 20 ng /mL.

Falske positiver har forhøjede niveauer af Ydre Arm fucosylering betragtninger Core fucosylering er specifik for HCC

Nogle patienter har ikke kræft, men har forhøjede niveauer af lektin-reaktivt A1AT (figur 4A). Fordi vi observerede ændringer i det ydre arm fucosylering på A1AT fra patienter med cirrose, var det af interesse at bestemme, om personer med falske positive resultater havde kerne eller ydre arm fucosylering. Figur 4A viser resultaterne af glycan analyse fra oprenset A1AT fra tre cirrotiske patienter (ud af ni) og tre patienter med trin 1 eller 2 HCC (ud af ni) og analyseres som før. Resultaterne fra disse patienter er vist i figur 4A, og en repræsentant glycan profil af en af ​​disse patienter er vist i figur 4B, sammen med niveauet af 4 store glykanstrukturer angivet. Som Figur 4B viser, i overensstemmelse med de resultater, der præsenteres i tabel 2 og i figur 3A-3C, de tre cirrosepatienter har niveauer af core fucosylering (F (6) A2G2) svarer til dem observeret hos raske kontroller. Men disse patienter har betydelige stigninger i ydre arm fucosylering, (A3F (3) 1G3), svarende til det højeste niveau set hos patienter med HCC. Det vil sige, niveauet af ydre arm fucosylering hos disse patienter varierede fra 10% til 17%, hvilket svarer til niveauet observeret i patienter med HCC (13%). I modsætning hertil havde tre patienter med HCC, som havde meget stærke positive resultater fra lectinet FLISA test øget kernen og det ydre arm fucosylering. For eksempel kernen -fucosylerede bianntennary glycan udgjorde 9,55% på A1AT oprenset fra patient H27. Ligeledes denne glycan udgjorde mere end 9% på A1AT oprenset fra patienter H18 og H23. Stigninger i den ydre arm fucosylering spænder fra 14,03% til 15,97% af de samlede glycan på A1AT blev også observeret hos disse patienter. Figur 4D viser resultaterne af alle 18 patienter med fokus på niveauet af ydre arm (α-1,3) og kerne (α-1,6) fucosylering. Ved behandlingen alle 9 cirrotiske falske positiver det gennemsnitlige niveau af centrale fucosylering var 3,77% ± 0,25, og den gennemsnitlige niveau af ydre arm fucosyalation var 11,88% ± 2,79. I tilfældet med de kræftformer Middelværdien var niveauet af kerne fucosylering 8,62% ± 1,2 og gennemsnitshøjden af ​​ydre arm fucosylering var 14.26% ± 1,9. Der var statistisk forskel mellem niveauet af centrale α-1,6 fucosylering mellem disse ni cirrose og ni HCC patienter (p 0,0001), men ikke med α-1,3 koblet fucosylering (p = 0,07). Vigtigt er det, det maksimale niveau af centrale fucosylering observeret i de falsk positive cirrose var 4,01%, svarende til hvad der blev observeret hos raske kontroller (3,62%).

(A) Niveauet af lektin-reaktivt A1AT hos patienter med HCC, HBV-infektion, HCV-infektion eller andre leversygdomme (OLD) og i kontrol. Den faste linie repræsenterer middelværdien. X-aksen repræsenterer patientgruppe. Y-akse viser fold stigning i lectin-reaktive A1AT sammenlignes med den i kommercielt indkøbt serum. (B) Glycan analyse af A1AT isoform M4 fra patient 21. (C) Kvantificering af glycan analyse fra tre cirrosepatienter (01,21 og 27) og tre patienter med stadie 1 eller 2 HCC (HCC-23, HCC 27 og HCC 18 ). Niveauerne af 4 store glykanstrukturer er vist. Da dette tal viser i cirrotiske falske positiver, er der en stigning i det ydre arm, men ikke core fucosylering. I overensstemmelse med data vist i figur 2 og 3, blev stigninger i core fucosylering på AAT kun observeret fra patienter med HCC. (D) Scatter plot af niveauet for α-1,3 eller a 1,6 koblet fucose fra 9 cirrotiske falske positiver og 9 patienter med enten trin 1 eller 2 HCC.

Diskussion

De seneste rapporter har indikeret, at øget kerne og ydre arm fucosylering kunne observeres efter glycomic analyse af enten total human serum eller serum udtømt af immunglobulin [18], [19], [25]. Vi undersøgte glycosyleringen af ​​et enkelt protein, A1AT, som en funktion af levercirrose og leverkræft. Til dette formål, fandt vi nogle ændringer, der var i overensstemmelse med vores tidligere resultater, såsom en stigning i kerne fucosylering samt ændringer i det ydre arm fucosylering.

Den iagttagelse, at ændringer i både kerne og ydre arm fucosylering forekomme kan give et fingerpeg om den molekylære basis for denne ændring. Det vil sige, selv om de nøjagtige mekanismer for øget kerne fucosylering i HCC er ukendte, er de formodes at involvere stigninger i både niveauerne af enzymet og substraterne, der er involveret i kernen fucosylering [17].

Det er også muligt at disse markører afspejler en vis ændring i Golgi-apparatet. Nylige rapporter har antydet, at i forhold til leveren, fucosylering af proteiner er involveret i protein sortering til galden [26]. Således er det tænkeligt, at forekomsten af ​​fucosylerede proteiner i serummet kan afspejle en fælles defekt i protein sortering. Det er interessant at bemærke, at glycosyleringen af ​​A1AT i serum fra patienter med levercancer (figur 2, 3 og 4) er af samme størrelsesorden som i galden hos raske individer [26].

Det er også interessant at bemærke, at lectin reaktivitet var større end den samlede ændring observeret i fucosylering. F.eks patient 27 havde enten kernen eller ydre arm fucose på 22.82% af sine N-forbundne glycaner. I modsætning hertil A1AT fra et rask individ havde fucose (kerne eller ydre arm) på 9% af de N-forbundne glycaner. Derfor bruger lectinet FLISA, bør vi har observeret tættere på en 2,5 gange stigning og ikke den 11-gange stigning, der blev opnået. Denne forskel kan være en artefakt af lectin-FLISA, resultatet af andre proteiner bundet til A1AT, forhøjet eller modificeret O-glycosylering, eller øget tilgængelighed af lectin til fucoserester. Alle disse mulige scenarier er under efterforskning.

Det er også vigtigt at bemærke, at øget ydre arm fucosylering blev observeret både hos patienter med cirrose og hos patienter med HCC. Dette resultat indebærer, at den ydre arm fucosylering ikke var specifik for cancer, men snarere var sandsynligvis associeret med inflammation, først fra levercirrose og derefter fra tilstedeværelsen af ​​HCC læsion. Faktisk kan niveauet af ydre arm fucosylering være en mere specifik markør for inflammation og kan være prædiktiv for kræft udvikling [27], [28]. I modsætning hertil er stigninger i core fucosylering kun observeret hos patienter med HCC, hvilket tyder på, at denne ændring er kræft specifik.

Som figur 4A viser, mange patienter i de ikke-HCC grupper har forhøjede niveauer af lektin-reaktivt AAL . Analyse af tre patienter med forhøjede AAL-niveauer fra skrumpelever gruppen viste, at de havde ændringer primært i det ydre arm fucosylering, ikke i kernen fucosylering. Med henblik herpå kan kerne fucosylering være en mere specifikt mål for påvisning af kræft [29].