PLoS ONE: Kultur ved en højere temperatur Mildt Hæmmer Cancer Cell Growth men Forbedrer Kemoterapeutiske effekter ved at hæmme celle-celle Samarbejde

Abstrakt

Akutte febrile infektioner har historisk været anvendt til behandling af kræft. For at udforske den underliggende mekanisme, studerede vi kroniske virkninger af feber på cancercellevækst og kemoterapeutisk virkning i cellekultur. Vi fandt, at dyrkning cancerceller ved 39 ° C mildt inhiberede cellevæksten med standse cellerne ved G1-fasen af ​​cellens cyklus. Når celler blev podet i dyrkningsskåle ved en lavere densitet, f.eks omkring 1000-2000 celler pr 35 mm skål, vækstinhiberingen var meget større, manifesteret som mange færre cellekolonier i de 39 ° C retter, sammenlignet med resultaterne ved en højere tæthed podning, f.eks 20.000 celler pr skål, hvilket antyder, at celle-celle samarbejde som Allee virkning i cellekultur inhiberes ved 39 ° C. Tilbagetrækning af celler fra serum forbedret G1 arrest ved 39 ° C, og for nogle cellelinier, såsom A549 lungecancerceller, serum genopfyldning ikke hurtigt drive cellerne fra G1 til S og G2-M-faser. Terapeutiske virkninger af flere kemoterapeutiske midler, herunder fed bud ekstrakter, ved flere cancercellelinier var mere potent ved 39 ° C end ved 37 ° C, især når cellerne blev podet ved en lav densitet. For nogle cellelinjer og nogle agenter, dette ekstraudstyr er langvarig, dvs. fortsatte efter ophør af behandlingen. Kollektivt antyder disse resultater, at hypertermi kan hæmme kræft cellevækst med G1 standsning og ved hæmning af celle-celle-samarbejdet, og kan forøge effektiviteten af ​​flere kemoterapeutiske midler, en virkning, som kan vare ved efter afslutning af kemoterapi.

Henvisning: Zhu S, Wang J, Xie B, Luo Z, Lin X, Liao DJ (2015) Kultur ved en højere temperatur Mildt Hæmmer Cancer Cell Growth men Forbedrer Kemoterapeutiske effekter ved at hæmme celle-celle-Collaboration. PLoS ONE 10 (10): e0137042. doi: 10,1371 /journal.pone.0137042

Redaktør: Arun Rishi, Wayne State University, USA

Modtaget: 9. juni 2015; Accepteret: 20 Juli 2015; Udgivet: 23. oktober 2015

Copyright: © 2015 Zhu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Akutte febrile infektioner af forskellige patogener har i århundreder været anset for at spille en rolle i kræft profylakse [1,2] og i kræft spontan regression [3-7], som revideret før af os [8] og andre [ ,,,0],9]. Faktisk forskellige patogener, som kan forårsage akut feber, såsom bakterier og malaria-forårsager parasitiske protozoer, blev allerede anvendes til behandling af cancere over et århundrede siden [5,10]. I 1866-1867, Busch i Tyskland inficerede patienter med sarkom med erysipelas bakterier, hvilket resulterede i ikke bare høj feber, men også tumorremission inden for to uger, og iterationer af fremgangsmåden forhindrede genvækst af tumoren [4,11,12] . I 1882, Fehleisen bekræftede Busch terapi og identificeret

Streptococcus pyogenes

som erysipelas bakterier [13]. I 1887 Bruns helbredt også et tilbagevendende melanom med erysipelas og sammenfattet 14 rapporterede tilfælde med fuldstændig eller stabil remission [14]. I løbet af 1891-1936, Coley i New York indsprøjtet en bakteriel blanding af

S pyogenes

Serratia marcescens

[15] i patienter med sarkomer eller visse epitelial kræft [10]. Omkring 500 af de 1000 patienter, så behandles med Coley og andre viste tumor regression [15-18]. Sandsynligt, denne bakteriel blanding, døbt som “Coley vaccine” eller “Coley s toksin”, ikke kun er en immunterapi [15], men også virker gennem hypertermi (HT), fordi dens virkning i vid udstrækning afhænger af, om patienterne reagerede med højere feber [10 , 16]. Faktisk HT terapi af cancere virker hovedsagelig ved at stimulere immunforsvaret, herunder aktivering af dendritiske celler, naturlige dræberceller og immunreaktion T-celle [19-21]. Desuden har mange kræftpatienter åbenbart hypotermi eller føler “kolde” under kemoterapi, muligvis fordi kroppen fejl kemo lægemiddel til et toksin og dermed sænker temperaturen til at begrænse dens “toksicitet” [22]. Hvis denne formodning er korrekt, kan hæve kropstemperaturen gendanne kemo virkningsfuldhed.

To vigtige papirer offentliggjort i midten af ​​1980’erne har fastslået, at en temperatur på 42 ° C i en time kan dræbe kræftceller og samtidig skåne normale celler [23,24], og dermed har sat en termisk mål til 42-43 ° C i HT terapi for kræft i de fleste nyere undersøgelser [25,26]. Mange enheder er siden blevet udviklet og anvendt klinisk til behandling af kræft, der sigter mod at hæve kroppens kernetemperatur til 43-45 ° C med en varighed fra 15 minutter til 6 timer [27]. Denne udformning af “en kort periode med høj temperatur” er også udtænkt fordi det ikke er praktisk at holde patienterne i enheden i lang tid og for mange gentagne eksponeringer. Imidlertid har klinisk praksis vist sig, at disse enheder har svært ved at fremskaffe tumoren temperaturen til 42 ° C. Da der er dybest set ingen patienter, der viser en feberagtig temperatur højere end 42 ° C, 39-42 ° C bliver målet i nogle undersøgelser [26]. Stevens et al rapporterede, at kultur af COLO-357 humane bugspytkirtelkræftceller ved 42 ° C øger kromosom fragmentering, en nyligt identificeret mitotisk celledød, og induktion sker inden for 24 timer [28].

Udover en direkte termisk dræbe cancerceller, har HT også vist sig at forbedre radio- og kemo-behandlinger af mange cancere, især terapier med cisplatin [29-31]. Mekanismerne for disse effekt forbedringer varierer mellem forskellige kemoterapeutiske midler. For cisplatin, HT øger permeabiliteten cellemembranen og fluiditet, der resulterer i cellulær akkumulering af cisplatin, og øger platin-DNA adduktdannelse, mens inhiberer reparationen af ​​cisplatin forårsagede DNA-beskadigelse [29-31].

Bestemmelse en mild virkning af en faktor på cellevækst in vitro er teknisk vanskelig. MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) analyse eller lignende kolorimetriske metoder, der registrerer de levedygtige celler ved at bestemme reduktionen af ​​MTT eller et beslægtet tetrazoliumsalt kan kun registrere cellelevedygtighed for en periode på flere dage. Dette skyldes, at i en plade med 96 brønde de ubehandlede celler inkluderet som kontroller vil vokse til konfluens i et par dage, manifesteret som et plateau af den optiske tæthed af reduceret MTT. Vedrørende undersøgelser af HT, idet celler ved en HT temperatur og deres 37 ° C kontroller podes i to forskellige 96-brønds plader til dyrkning i to forskellige inkubatorer, variation er større sammenlignet med den rutinemæssige MTT assay, hvor den testede gruppe og dens kontrol er i den samme plade. Colony vækst assay kan detektere en meget længere periode af cellevækst og give oplysninger om trinvis vækst af hver oprindeligt seedet celle. Imidlertid behøver cellerne, der skal podes på et meget mindre antal i dyrkningsskålen for at undgå fusion af kolonierne. For de fleste cellelinjer, behøver de celler, der skal podes på et bestemt antal eller densitet, fordi cellerne behøver at samarbejde med hinanden for at overleve eller vokse, hvilket betragtes som cellekulturen version af Allee virkning [32,33]. Derfor til en vis grad kolonivækst assay udvælger disse subpopulationer af celleoverlevelse og vækst, som er mindre afhængige af celle-celle samarbejde, selv om dette Allee effekt

per se

kan også være en parameter til at vurdere en behandling.

Materialer og metoder

Humane cellelinjer og reagenser

Hela livmoderhalskræft cellelinie, A549 og H1650 ikke-småcellet lungecancer cellelinier, HCT116 kolorektal cancer cellelinje, samt som HEK293T (T large antigen udtrykker human embryonisk nyre) cellelinien blev oprindeligt erhvervet fra American Type Cell Culture (ATCC) og anvendt i undersøgelsen. Tørre fed knopper blev købt fra en kinesisk købmand. For at gøre sin ethanolekstrakt blev 1 gram fed knopper tilsat til 5 ml 95% ethanol i en 15-ml falcon-rør og ekstraktion lodes i to uger ved stuetemperatur [34]. Ethanolen blev derefter overført til et nyt rør og betragtes som en ekstrakt 100% til brug. Desuden blev en ren æterisk olie af kryddernellike knopper købt fra nu fødevarer Bloomingdale, IL 60108, USA, og blev fortyndet med absolut ethanol. Ethanol blev anvendt som den ubehandlede kontrol. Cisplatin og 5-fluorouracil (5-FU) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com) og fortyndet med saltvand eller DMSO, henholdsvis.

Cellekultur

celler blev dyrket i to vand-jakke inkubatorer med temperaturen indstillet til 37 ° C og 39 ° C. For at sikre nøjagtigheden og stabiliteten af ​​temperatur blev et termometer sat i inkubatorerne at overvåge den aktuelle temperatur. De væksthuse blev leveret med 5% CO

2, der blev rekalibreret nu og da for at sikre nøjagtigheden. Under udskiftning af mediet blev dyrkningsskålene tegnes af stykvis fra inkubatoren at minimere tiden ved stuetemperatur. Den friske medium blev forvarmet i den tilsvarende inkubator.

MTT assay

Celler i den logaritmiske fase blev høstet og podet i en 96-brønds plade med en tæthed på 8 x 10

3 per brønd, efterfulgt af dyrkning natten over for at tillade fastgørelse. For at bestemme virkningen på 37 ° C og 39 ° C kulturer blev cellerne lov at vokse i yderligere 72 timer. MTT blev derefter tilsat til brønden, og 3 timer senere blev 200 pi DMSO tilsat for at opløse formazan ved stuetemperatur i 30 minutter. Den optiske densitet af den reducerede MTT blev målt under anvendelse af et Multiskan-spektrum instrument med et fast program for MTT-assayet som rapporteret før [35,36]. At bestemme virkningerne af kemoterapeutiske lægemidler, efter natten over fastgørelse af cellerne blev behandlet med et medium indeholdende cisplatin, 5-FU eller nellikeekstrakt ved den angivne koncentration i 72 timer i 37 ° C eller 39 ° C inkubator, med relevant opløsningsmiddel som ubehandlede kontroller.

Crystal violet farvning

Celler blev podet ved en angivet antal pr skål og dyrket i 37 ° C og 39 ° C inkubatorer med en RPM-1640 medium indeholdende 5% føtalt bovint serum og streptomycin. Medium blev ændret hver 3-4 dage, eller når dets farve vendte svagt gul. For lægemiddelbehandling, blev et medium indeholdende en angivet koncentration af cisplatin, 5-FU eller fed ekstrakt tilføjet. Før farvning med krystalviolet blev mediet fjernet, og skålen blev forsigtigt vasket med PBS. En fiksativ (methanol-eddikesyre ved 3: 1-forhold) blev tilsat til fikseres cellerne i 30 minutter. Fiksativ blev kasseret, og skålen fik lov til at lufttørre fuldstændigt, efterfulgt af farvning af cellerne med en 0,1% krystalviolet vandopløsning i 15 minutter. Efter tilbageværende krystalviolet blev vasket væk med deioniseret vand, skålen blev lufttørret og fotograferet med et digitalt kamera.

Cellecyklusanalyse Salg

Celler blev dyrket i 60 mm skåle, indtil de nåede 70 ~ 80% konfluens. Cellerne blev høstet ved forsigtig trypsin fordøjelse, vasket med kold PBS, og derefter fikseret med 70% ethanol i PBS i 30 minutter. Cellerne blev sorteret ved anvendelse af en Becton Dickinson FACS Calibur flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA). Efter at cellerne var gated i FSC /SSC plot at udelukke små rester blev populationer af celler på forskellige stadier af cellecyklen kvantificeret ved anvendelse af en ModFit LT software (Verity Software House, Inc., Topsham, ME), som tidligere beskrevet [35,37,38]. I hvert forsøg blev hver gruppe sat det meste i triplet og dataene blev udtrykt som middelværdi ± SD (standardafvigelse).

Statistisk analyse

De fleste data varierede meget mellem forskellige gentagelser af forsøgene og blev således analyseret under anvendelse af Wilcoxon rank-sum test. De anvendte metoder var angivet i de tilsvarende tal.

Resultater

HT kan forårsage artefakter i MTT-assays

Vi plejer observeret færre celler eller lavere celletætheder under mikroskop, og opdaget færre cellekolonier under anvendelse krystalviolet-farvning, i de 39 ° C retter end i deres 37 ° C modstykker, men MTT-assay gav ofte anledning til en modsat resultat (fig 1A). MTT assay bestemmer reduktion af MTT, som forekommer i cytosolen, mitokondrier og endda nucleus [39]. Da en højere temperatur normalt forbedrer kemiske reaktioner, er vi tilbøjelige til at konkludere, at “højere cellelevedygtighed” ved 39 ° C påvist ved en MTT assay skyldes en øget aktiviteter nogle MTT-reducerende enzymer og dermed er en artefakt. Støtte denne slutning, dyrkningsmediet ved 39 ° C blev gul hurtigere end ved 37 ° C og behov ændres oftere, hvilket indikerer en højere stofskifte ved 39 ° C. Da andre kolorimetriske metoder til påvisning af cellelevedygtighed faktisk afsløre metaboliske aktiviteter samt [40-42], i de fleste tilfælde med et tetrazoliumsalt som substrat [39], der i øjeblikket mangler vi stadig en pålidelig og praktisk gennemførlig fremgangsmåde til at kvantificere virkningen af ​​HT i kultur

A:. Den optiske densitet af MTT ofte er højere i cellerne ved 39 ° C end ved 37 ° C, selv når færre celler ved 39 ° C observeres under mikroskop, hvilket indikerer, at cellelevedygtighed kan være overvurderet ved 39 ° C, når der anvendes MTT assay. B, C og D: Behandling af Hela, A549 og HCT116 celler med 1 pM cisplatin (CDDP), 4 uM 5-FU eller 0,05% fed bud ethanolekstrakt signifikant nedsætter cellelevedygtigheden sammenlignet med den ubehandlede kontrol ved samme temperatur (

en

i C, B og D, s 0,05;.

t

test), mens sammenligning mellem 37 ° C og 39 ° C ikke anbefales

celler ved 39 ° C vokse lidt langsommere

ved hjælp af en MTT-analyse, hvor celler ved 37 ° C og 39 ° C blev udsået i separate 96-brønds plader, vi ikke registrere åbenlyse forskel i levedygtighed Hela, A549, HCT116, H1650 og HEK293T celler mellem de to temperaturer (ikke vist), til dels på grund af den tekniske begrænsning af MTT-assayet beskrevet ovenfor. Imidlertid celledensitet visualiseret ved krystalviolet-farvning var faktisk lavere i de 39 ° C retter end i de 37 ° C dem (fig 2 og 3; kontrolpaneler)

Cellerne blev derefter behandlet med 1 pM cisplatin. eller 2 uM 5-FU i 3 dage, og efter lægemidlet blev trukket tilbage, blev fortsat på kulturen i yderligere 3 dage, så de cellekolonier vokse til synlige størrelser. Bemærk, at cellerne i opløsningsmiddel-behandlet kontrol viser også en lavere densitet ved 39 ° C end ved 37 ° C

Topplade:. Omkring 20.000 HCT116-celler blev podet i en 35 mm skål og fik lov at vokse i 3 dage ved 37 ° C eller 39 ° C. Cellerne blev derefter behandlet med angivne agent i 3 dage, efterfulgt af farvning af levedygtige celler med krystalviolet. Bundplade: Cellerne blev behandlet som ovenfor, men fik lov til at vokse i yderligere 3 dage efter den 3-dages behandling med den angivne middel blev afsluttet. Bemærk, at forskellen i celledensitet mellem 37 ° C og 39 ° C blev udvidet for cisplatin og fed-behandlede celler sammenlignet med modstykket på toppanelet. Men denne post-behandlingseffekt ikke spores i 5-FU behandlede celler ved 39 ° C.

For at bestemme en langsigtet effekt på 39 ° C på cellevækst, vi kun seedet 1000-2000 celler i en 35 mm skål, så cellekolonier ikke ville smelte sammen. Overraskende blev mange færre kolonier af synlige størrelser spores i de 39 ° C retter end i de 37 ° C dem efter 6, 9, 12 og 15 dage efter kultur (fig 4 og 5). Men under mikroskop der stadig var kolonier, der var mindre end den synlige størrelse i de 39 ° C retter, selv om antallet af disse små kolonier var stadig mindre i forhold til de 37 ° C retter. Disse forskelle, som var mere indlysende for HCT116 celler (Fig 3), viser, at mange celler i de 39 ° C retter var døde, mens de stadig i live, havde været vækst-anholdt. Vi konkluderer, at cellerne har brug for at samarbejde med hinanden for at overleve og replikation, som er den såkaldte Allee effekt i skålen, og dette samarbejde hæmmes ved 39 ° C. Imidlertid er faldet i antallet af levedygtige celler ved 39 ° C, på grund af enten forøget celledød og /eller inhiberes cellereplikation, er så minimalt at det ikke kunne skelnes i de første tre dages dyrkning.

Bemærk, at der er færre kolonier af synlige størrelser i 39 ° C skål end i 37 ° C en. A549-celler danne større kolonier end Hela-celler ved de senere tidspunkter, især ved 37 ° C.

Vækst er meget langsommere ved 39 ° C end ved 37 ° C, men cellerne er stadig i live, som observeret under mikroskop (pile i 6-dages fad).

under lup, kunne Hela celler replikerede i tre dimensioner, dvs. også hober sig op sammen, hvilket gjorde udvidelsen af ​​kolonierne mindre udtalt i to dimensioner. De sfæriske kolonier let løber ud under krystalviolet-farvning, hvilket kun efterlader en periferi af kolonierne i skålen (figur 6). I modsætning hertil A549 celler dannet meget større kolonier, fordi disse celler er større i cellulær størrelse og voksede kun i to dimensioner uden hober sig op sammen, selv om de voksede meget langsommere end Hela-celler (Fig 4)

Venstre panel.: Hela-celler vokser sædvanligvis i tre dimensioner i skålen for at danne sfæriske kolonier, som, efter at være steget over 9 dage, let løber ud under krystalviolet farvning, forlader skålen med kun periferien af ​​kolonierne, især i 37 ° C skålen hvori kolonier er meget større. Højre panel: Seks dage efter at cellerne var podet individuelle celler podet med en tæthed på omkring 20.000 celler pr 35 mm skål udvikler til større kolonier, sammenlignet med kolonierne i skålen, hvori celler blev podet ved en densitet på 2000 celler. Celler ved 37 ° C udvikle større kolonier end ved 39 ° C.

Effekter af kemoterapeutiske midler forstærkes og langvarig ved 39 ° C

I forhold til den tilsvarende ubehandlede kontrol, behandling med en lav koncentration af cisplatin (1 um) i tre dage faldet lidt levedygtighed Hela-celler, men ikke fra A549 og HCT116-celler ved 37 ° C; dog forekom fald til alle tre cellelinier ved 39 ° C, som detekteret ved MTT-assays (fig 1B, 1C og 1D). Farvning af cellerne i retter med krystalviolet viste, at alle tre cellelinier behandlet med cisplatin viste en nedsat celledensitet ved 37 ° C og, mere udpræget, ved 39 ° C (fig 2 og 3). Mikroskopisk observation havde også den samme konstatering (ikke vist). Kollektivt, disse resultater bekræfter, at 39 ° C potenserer virkningen af ​​cisplatin. Salg

MTT-assays påvises nedsat levedygtighed Hela og A549-celler behandlet med en lav koncentration (4 uM) 5-FU (fig 1B, 1C og 1D). Andre, og vi havde tidligere rapporteret, at ethanol ekstrakt af fed knopper havde en potent terapeutisk virkning på en række kræft cellelinjer [34,43,44]. Ved behandling med den ethanol ekstrakt af kryddernellike knopper, Hela, A549 og HCT116-celler viste alle nedsat levedygtighed som detekteret med MTT-assays (fig 1B, 1C og 1D). Imidlertid krystalviolet-farvning viste nedsat densitet på HeLa, A549 og HCT116-celler behandlet med 5-FU eller fed ethanolekstrakt ved 37 ° C og yderligere viste en mere udtalt virkning på A549-celler, men viste næsten ingen virkning på Hela og HCT116-celler, ved 39 ° C (fig 2 og 3). Fordi ethanol hovedsagelig ekstraherer hydrofobe bestanddele, vi også behandlet disse cellelinier med en æterisk olie af kryddernellike knopper, hvilket resulterede i potent dræbende virkning samt (Fig 3). Disse resultater indikerer, at 39 ° C faktisk potenserer kemo følsomhed, men potenseringen er cellelinje og agent specifik.

Hela, A549, H1650 og HEK293T celler udviste ikke åbenlyse forskel i morfologi mellem 37 ° C og 39 ° C. Imidlertid HCT116 celler var normalt i en uregelmæssig form ved 37 ° C, men mange af dem krympede til en sfærisk form ved 39 ° C (figur 7). Ved behandling med en lav koncentration (1 uM) af cisplatin, mange Hela-celler ved 39 ° C, men ikke ved 37 ° C, ændret til spindel form, som forekom så tidligt som 30 minutter efter behandlingen (figur 7). Ved en koncentration på 0,025%, nellikeolie forårsagede celle krympning og frigørelse på mindre end 30 minutter, hvilket blev mere udtalt ved 39 ° C to timer efter behandlingen (figur 7). Sandsynligt, kan sådanne hurtige ændringer ikke indebærer kaskader af gen-aktivering og inaktivering

Venstre panel:. HCT116 celler ved 37 ° C normalt vise uregelmæssig form (pil), men bliver sfæriske ved 39 ° C. Behandling med 0,025% fed olie dræber mange flere celler ved 39 ° C end ved 37 ° C, med de resterende celler indskrumpede til kugleform inden for 30 minutter. Højre panel: Tredive minutter efter behandling med 1 uM cisplatin (CDDP), mange Hela-celler har skiftet til en spindel form (pil) ved 39 ° C men forbliver uændret ved 37 ° C. To timer efter en behandling med 0,025% fed olie, mange flere Hela celler dør ved 39 ° C end ved 37 ° C.

Interessant væksthæmning og celledød fortsatte efter cisplatin blev trukket tilbage, manifesteret som yderligere fald i celletæthed eller koloni nummer bestemmes både mikroskopisk observation og krystalviolet farvning, især ved 39 ° C, og når cellerne blev podet ved en lav densitet (fig 8). Disse ændringer blev mere åbenbart manifesteret i HCT116-celler (figur 3). Faktisk er der stort set ikke var nogen levedygtig Hela, A549 og HECT116 celler forlod tre dage efter cisplatin tilbagetrækning i de 39 ° C retter, mens der stadig var et betydeligt antal levedygtige celler i de 37 ° C retter. Indlysende potensering blev også skelnes, når en 3-dages behandling med cisplatin ved 37 ° C blev efterfulgt af 3 dages dyrkning ved 39 ° C (data ikke vist). Disse resultater antyder, at virkningerne af 39 ° C på den kemoterapeutiske virkning af cisplatin er langvarig, der går ud over behandlingen. Men denne efterbehandling effekt på 39 ° C var både cellelinje og agent specifik, da den ikke var indlysende i nellikeolie behandlet HCT116 celler (Fig 3) eller i 5-FU behandlede HCT116 og Hela-celler (fig 3 og 6 ).

cellerne blev derefter behandlet med 1 pM cisplatin, 4 uM 5-FU eller 0,025% nellikeolie i 3 dage. Efter midlet var blevet trukket tilbage, blev cellerne lov at vokse i en uge mere. Bemærk, at der er næppe nogen kolonier i de 39 ° C retter af Hela og A549 celler behandlet med cisplatin, eller af A549 celler behandlet med fed olie, selv om endnu en uge havde fået for væksten, hvilket tyder på en post-behandling vækst inhibering. Men denne efterbehandling effekt ved 39 ° C ikke spores i 5-FU behandlede Hela eller fed olie behandlet A549 celler.

39 ° C anholdelser celler ved G1 fasen og til tider modvirker vækst stimuli af serum

Vi lod Hela og A549-celler til at vokse ved 39 ° C i to uger eller længere med passager, således at cellerne havde tilpasset HT miljø. Cellerne blev derefter analyseret for cellecyklusfordeling. Da dataene stærkt varierede mellem forskellige eksperimenter blev analyserne gentaget for mange gange med de fleste data vist i figur 9. En større G1 fraktion og gensidigt mindre S og G2-M-fraktioner ved 39 ° C, sammenlignet med deres 37 ° C modparter, var konstant observeret, hvilket bekræfter, at den 39 ° C kultur forårsager G1 anholdelse (figur 9). blev også analyseret Langsigtede dyrkede HCT116 celler, selvom som kontrollerne til cisplatin behandling, og resultaterne viste også en G1 anholdelse ved 39 ° C (figur 10).

Data er præsenteret som gennemsnit af triplet retter i hvert eksperiment, plus eller mindreårige standardafvigelse (SD). I nogle forsøg en eller alle grupper indeholder kun en enkelt skål og dermed dataene mangler SD. “Synkroniseret” betyder, at cellerne blev frataget fra serum i 24 eller 48 timer og derefter genopfyldes med serum for angivne tid inden bestemmelsen af ​​cellecyklusfordeling. “Exp”: mange gange forsøget gentages. “Temp”: kultur temperatur.

en

: signifikant forskellig fra 39 ° C modstykke (p 0,05, Wilcoxon rank-sum test af tre gentagelser af eksperimentet).

b

: signifikant forskellig fra 39 ° C modstykke (p 0,05, Wilcoxon rank-sum test af triplet retter inden for samme eksperiment).

c

:. Signifikant forskellig fra serummet-genopfyldes gruppe ved den samme temperatur i 4 timer senere (p 0,05, Wilcoxon rank-sum test af triplet retter inden for samme eksperiment)

Exp: mange gange forsøget gentages. Forkæl: behandling. Temp: temperatur. Con: ubehandlet kontrol. CDDP: cisplatin. S /G2 /M er summen af ​​S- og G2-M-fraktioner, der afviger fra G1 celler ved deres fordoblet DNA-indhold.

en

: signifikant forskellig fra de ubehandlede celler ved 39 ° C og fra CDDP-behandlede celler ved 37 ° C (p 0,05).

b

: signifikant forskellig fra CDDP-behandlede celler ved 37 ° C (p 0,05).

c

: signifikant forskellig fra ubehandlede celler ved 39 ° C. Wilcoxon rank-sum test blev anvendt.

For at bestemme om cellerne ved 39 ° C viser en ændret reaktion på serumafledte vækststimuli, vi trak Hela og A549-celler fra serum i 24 timer, som udvidede forskellen i G1 fraktion mellem 37 ° C og 39 ° C (figur 9). Som forventet, fire timer efter serum genopfyldning, nogle G1-standsede Hela-celler reentered cellecyklussen, manifesteret som formindsket G1 fraktion og forøget S- og G2-M-fraktioner, sammenlignet med serum-berøvet modstykker. Da det er velkendt, efter vores erfaring og mange andres, at synkronisering af Hela celler ved G1 kræver en længere serum sult, vi også frataget cellerne fra serum i 48 timer, hvilket faktisk yderligere udvidet forskellen i G1 fraktionen mellem sultede og genopfyldes celler som forventet (Fig 9). Forskellen mellem serum-udsultning og -replenishment blev også udvidet ved 39 ° C, hvilket indikerer, at virkningerne af serum sult og en højere temperatur er additive på standse cellerne ved G1.

Berøvelse af A549-celler fra serum også forårsaget G1 anholdelse. Imidlertid overraskende fire eller endda ti timer efter serum genopfyldning, G1 del af A549-celler viste kun et lille fald ved 37 ° C, selv om dette lille fald stadig udvidet forskellen mellem serumudsultning og opfyldning og mellem 37 ° C og 39 ° C (figur 9). Mere overraskende, ved 39 ° C, endda 10 timer efter serum genopfyldning, A549-celler blev stadig ikke frigivet fra G1, hvilket indikerer, at G1 standsning af A549-celler ved 39 ° C ikke kan overvindes ved vækststimuli af serum.

39 ° C og cisplatin ændre cellecyklusfordeling i en cellelinje specifik måde

som forventet, Hela, A549 og HCT116-celler behandlet med kun opløsningsmidlet viste G1 standsning ved 39 ° C, viser sig som øget G1 fraktion og faldt S og G2-M fraktioner sammenlignet med deres 37 ° C modparter (fremhævet i figur 10). Men når de behandles med en lav koncentration (1 uM) af cisplatin, disse cellelinjer udviste forskellige profiler af cellecyklusfordeling. Hela-celler manifesteret en typisk G2-M standsning, dvs. en stigning i G2-M fraktion og en gensidig fald i G1 fraktion, både 37 ° C og 39 ° C, sammenlignet med de ubehandlede modstykker (figur 10). Cisplatin-behandlede A549-celler konstant manifesteret en G2-M standsning ved 39 ° C, men ofte manifesteret G1 standsning ved 37 ° C. Helt anderledes, har cisplatin-behandlede HCT116 celler ikke nogen fast mønster af forandringer i fordelingen cellecyklus enten ved 37 ° C eller ved 39 ° C, sandsynligvis fordi i mangel af cisplatin ved begge temperaturer, HCT116 celler allerede havde en relativ høj summen af ​​S /G2-M-celler, der afviger fra G1 celler ved deres fordoblet DNA-indhold (fig 10).

Discussion

der har været rigeligt undersøgelser offentliggjort om HT terapi af cancer, men de fleste af dem bestemme kun virkningerne af en kortvarig HT, som kort som minutter eller timer [45-48]. Kun få undersøgelser er blevet udført på cellekultur ved en moderat febrilsk temperatur i en periode længere end en runde af cellecyklus, som er en dag eller længere for de fleste kræft cellelinjer. Af denne grund, lidt information er tilgængelig for evaluering af kroniske HT effekter på cellevækst og cellecyklus distribution. Til vores viden, var den længste periode med HT studie i cellekultur udført af Heng laboratorium, der viser, at ved en 42 ° C kultur for to på hinanden følgende uger, COLO-357 humane bugspytkirtelkræftceller manifestere en indledende væksthæmning, men senere genoptage vækst, med forøget celledød i forhold til de modparter ved 37 ° C kultur [28]. Vi studerer kronisk indflydelse på 39 ° C på cellevækst og om virkningerne af flere kemoterapeutiske stoffer, som har klinisk relevans baseret på to begrundelser: For det første, feber ved denne temperatur optræder ofte i kræft og ikke-kræftpatienter og kan vare i dage. For det andet, historisk, læger inducerede langvarig feber hos patienter at behandle deres kræft. For eksempel blev nogle af Coley patienter gentagne gange induceres til at udvikle feber i årevis [18].

ledning af denne undersøgelse, vi indser, at en højere temperatur kan øge aktiviteterne i MTT-reducerende enzymer, som vil resultere i en højere absorbans reduceret MTT og dermed en falsk cellelevedygtighed. Faktisk vi engang faldt i denne faldgrube, fordi det ikke var blevet godt behandlet i publicerede undersøgelser af HT. Da nogle kemikalier kan ændre aktiviteten af ​​MTT-reducerende enzymer [40], er det muligt, at nogle terapeutiske kemikalier kan resultere i lignende artefakter i MTT-assays samt. Desuden har vi også indse, at vi ikke kun mangler en realistisk teknik til at kvantificere effekten af ​​HT på cellevækst i kultur retter, men også mangler gode dyremodeller til at studere in vivo effekter af HT. Større begrænsninger på dyr undersøgelse, foruden de mulige etiske bekymring på dyret protokol, omfatter, at in vivo-effekter i høj grad involvere medfødte immunitet og dermed udelukke brugen af ​​immunsvækkede mus, og at vi mangler gode pyrogener at fremkalde feber siden almindeligt anvendte pyrogener selv, sådan som endotoksiner [49,50], kan have anticancer effekter.

Det har været kendt i lang tid, der normalt celler skal podes ved en tærskel nummer eller densitet i en dyrkningsskål, ellers vil de ikke vokse . Forklaringen på dette fænomen er, at cellerne nødt til at samarbejde med hinanden for at overleve og replikere, hvilket betragtes som den celle-kultur version af Allee virkning [32,33]. En af vores nye fund er, at nogle kemo lægemidler såsom cisplatin og 5-FU påvirke denne tærskel, fordi når cellerne podes i en lav densitet, f.eks 1000-2000 celler pr 35 mm skål, forskellen i kolonien tal mellem kemo lægemiddel behandlede og ubehandlede retter er meget større, sammenlignet med den situation, hvor flere end 20.000 celler blev udsået i skålen. En højere temperatur som en slags behandling påvirker også denne tærskel ved potensering af virkningerne af cisplatin og 5-FU på celle-celle samarbejde.