PLoS ONE: påvisning af kræft med Serum miRNA på en Oligonucleotid Microarray

Abstrakt

Micro RNA (miRNA) er en klasse af små, ikke-kodende RNA-arter, der spiller kritiske roller i hele cellulære udvikling og regulering. miRNA ekspressionsmønstre taget fra forskellige vævstyper ofte pege på den cellulære afstamning af en individuel vævstype, derved er en mere invariant kendetegnende for vævstype. Nyligt arbejde har vist, at disse miRNA ekspressionsmønstre kan anvendes til at klassificere tumorceller, og at denne klassificering kan være mere præcis end klassificeringen opnås ved anvendelse messenger RNA genekspressionsmønstre. Et aspekt af miRNA biogenese, der gør dem særligt attraktivt som biomarkør er det faktum, at de fastholdes i en beskyttet tilstand i serum og plasma, hvilket således tillader detektion af miRNA ekspressionsmønstre direkte fra serum. Denne undersøgelse fokuserer på evalueringen af ​​miRNA ekspressionsmønstre i humant serum i fem typer af human cancer, prostata-, tyktarms-, ovarie-, bryst og lunge, ved hjælp af en pan-human microRNA, high density microarray. Denne microarray platform muliggør samtidig analyse af alle menneskelige microRNA ved enten fluorescerende eller elektrokemiske signaler, og kan let redesignet til at omfatte nyligt identificerede miRNA. Vi viser, at tilstrækkelige miRNA er til stede i en milliliter af serum for at detektere miRNA ekspressionsmønstre, uden behov for amplifikationsteknikker. Derudover er vi i stand til at bruge disse ekspressionsmønstre korrekt skelne mellem normale og kræft patientprøver

Henvisning:. Lodes MJ, Caraballo M, Suciu D, Munro S, Kumar A, Anderson B (2009) Detection af kræft med Serum miRNA på en Oligonucleotid Microarray. PLoS ONE 4 (7): e6229. doi: 10,1371 /journal.pone.0006229

Redaktør: Alfredo Herrera-Estrella, Cinvestav, Mexico

Modtaget: 3. februar 2009; Accepteret: 4 Juni 2009; Udgivet: 14 juli 2009

Copyright: © 2009 Lodes et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Combimatrix er en reklame for-profit selskab, som gav støtte til undersøgelsen. Vigtige efterforskere er ansatte i selskabet. Tilladelse fra selskabets juridiske og finansielle afdelinger blev opnået at indsende publikationen, og tilladelse fra tilsynsmyndighederne blev opnået at begynde undersøgelsen. Videnskabeligt personale designet undersøgelsen indsamlet og analyseret data og skrev manuskriptet

Konkurrerende interesser:. CombiMatrix er en reklame for-profit virksomhed og førende investigatorer er ansatte i selskabet. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes andre konkurrerende interesser.

Introduktion

MikroRNA’er (miRNA) er enkeltstrengede RNA molekyler af ca. 21-23 nukleotider i længden, som fungerer i reguleringen af ​​gen udtryk. miRNA udtrykkes som en del af primære transkripter i form af hårnåle med signaler for dsRNA-specifikke nuklease spaltning med ribonuclease drosha i kombination med et RNA-bindende protein. Efter forstadiet miRNA frigives som en cirka 70 nt RNA, transporteres det fra kernen til cytoplasmaet af exportin-5 og derefter spaltes af Dicer RNase III til dannelse af et dobbeltstrenget RNA. Dicer initierer dannelsen af ​​RNA-inducerede silencing kompleks (RISC), som er ansvarlig for gendæmpning observeret på grund af miRNA ekspression og RNA-interferens [1], [2], [3]. Salg

MikroRNA’er har blevet fundet i væv og også i serum og plasma og andre legemsvæsker, i en stabil form, der er beskyttet mod endogen RNase-aktivitet (sammen med RISC, enten frit i blod eller i exosomer (endosom-afledte organeller)). Undersøgelser af Lu et al [4] demonstrerede gennemførligheden og nytten af ​​overvågning af ekspressionen af ​​miRNA i humant kræftvæv. De fandt en høj grad af diversitet i miRNA ekspression tværs cancere, og fandt, at omkring 200 miRNA kunne være tilstrækkeligt til at klassificere humane cancere. Tam [5] tilføjet, fordi miRNA fungerer som ledere i gen regulatoriske netværk, de er forskellige fra andre biomarkører fordi de har en patogen rolle i sygdomsprocessen og er ikke biprodukter af sygdomstilstanden. Fordi miRNA funktion ved specifik binding til deres mål, kan polymorfier (SNP) i sekvensen af ​​miRNA eller deres target mRNA’er føre til sygdom, herunder cancer. Disse miRNA-specifikke SNP’er kan påvirke risikoen for sygdom og kan også anvendes til diagnosticering af disse sygdomme [6]. Deregulerede miRNA er blevet beskrevet af adskillige humane cancere herunder bryst-, lunge-, colon-, ovarie- og prostatacancer. Mitchell et al [7] fandt, at miRNA oprindelse af prostatakræft væv indtaste cirkulation og kan anvendes til at skelne patienter med prostatacancer fra raske kontrolpersoner og etableret en blod-baserede PCR tilgang til påvisning af human prostatacancer. En lignende fremgangsmåde blev anvendt til at påvise serum miRNA fra æggestokkene kræftpatienter [8]. Taylor og Gercel-Taylor [9] undersøgt anvendelsen af ​​cirkulerende exosomer i diagnosticering af cancer. De fandt, at miRNA indhold af ovarietumorceller og cirkulerende exosom var ens og kunne anvendes til at skelne cancerpatienter fra patienter med benign ovariesyndrom og fra normale kontroller.

miRNA signaturer fra normale og cancerøse væv er blevet anvendt at klassificere flere typer af cancer og kan også tillade klinikere at bestemme en behandlingsforløb baseret på den oprindelige vævstype. Det kan også være muligt at anvende miRNA ekspressionsmønstre som biomarkør for at overvåge virkningen af ​​behandlingen på cancer progression [2]. Fordi miRNA udtryk profiler parallelt udviklingsmæssige oprindelse af væv, og fordi relativt få miRNA kan anvendes til effektivt at skrive væv, er de potentielt overlegen markører end messenger RNA’er til diagnose cancer [4]. Potentialet for anvendelse af serum miRNA som biomarkører for sygdom og som mål for terapeutika er lovende [10], da det ville betyde en ikke-invasiv og nøjagtig test for kræft. I denne undersøgelse viser vi, at serum miRNA kan anvendes til at skelne mellem kræft patientsera og normal donor sera, under anvendelse af en simpel microarray analyse, der kræver ingen amplifikation trin.

Resultater Salg

Serum microRNA ekstraktion

Vi har fastslået, at en tilstrækkelig mængde af miRNA er til stede i mindre end 1 ml humant serum til frembringelse af et påviseligt signal på et mikroarray anvendelse af fluorescens eller elektrokemisk detektion (ECD). Ved hjælp af en simpel phenol /chloroformekstraktion protokol, vi genvundet ca. 1,3 ug af serum RNA fra hver 800 pi serum (gennemsnit af 18 prøver, standardafvigelse 0,3). Den resulterende mønster af miRNA udtryk kunne bruges til at skelne mellem kræftpatienter og normale donorer.

omtrentlige størrelse af de små RNA udvundet fra plasma blev bestemt ved at isolere store RNA-fragmenter (koncentration lave ethanol) og små RNA-fragmenter (høj koncentration ethanol) under anvendelse af Invitrogen PureLink miRNA isolation kit, efter sur phenol /chloroformekstraktion og udfældning. De to RNA size fraktioneringer blev mærket med biotin (Mirus) og hybridiseret til et mikroarray. Resultater (ikke vist) viste, at langt størstedelen af ​​signal var fra den lille RNA fraktion, som var magen til signalet fra den ikke-fraktioneret prøve.

DNA kontaminering af ekstraheret serum nukleinsyre blev undersøgt ved sammenligning af en ekstraheret prøve, der blev delt, og halvdelen behandlet med DNase I. Efter mærkning både behandlede og ubehandlede prøver med biotin og hybridisering til forskellige sektorer af samme 4 × 2K array, kunne meget lille forskel ses mellem behandlede og ubehandlede prøver (r

2 = 0,9 og 0,96 for henholdsvis to replikater) at lille DNA forurener prøver (data ikke vist).

analysens sensitivitet og stabilitet

følsomheden af ​​vores miRNA assay blev bestemt ved tilsætning fortyndinger af en syntetisk RNA oligonukleotid til vores assay under serum ekstraktion. Vi var i stand til at opdage cirka 4.000 eksemplarer af serum microRNA pr mikroliter serum (Figur 1). Denne afsløring niveau svarer til den rapporteret i Mitchell et al [7] for prostatakræft specifikke microRNA miR-141 ved hjælp af TaqMan-analyser. miRNA microarrays er relativt mere følsomme end standard ekspressionsvektorer microarrays fordi små oligonukleotider har bedre hybridiseringskinetik end større RNA- eller DNA-molekyler. For miRNA, både deres beskyttelse mod fordøjelse af forskellige cellulære faktorer, og deres lille størrelse bidrager til deres opdagelse i serum ved microarrays på niveauer, der er så lave som dem, der ses med metoder, der ellers ville blive betragtet mere følsomme.

RNA miRNA analoge oligonukleotider, ved koncentrationer i området fra 0 til 40 millioner kopier pr mikroliter, blev tilsat til 400 ul serum efter tilsætning af RLT buffer. RNA blev derefter ekstraheret fra serum under anvendelse phenol /chloroform-ekstraktioner og en ethanoludfældning. Prøver blev derefter mærket og hybridiseret på et mikroarray. Lodrette streger indikerer array-signalintensiteter for specifikke miRNA prober repræsenterer vildtypesekvensen (Wild) og prober med to interne mutationer (Mut) til (A) oar | MIR-431 og (B) oar | MIR-127. Scales for 4000 og 0 eksemplarer datapunkter (boxed i venstre paneler) udvides i de rigtige paneler:. (C) åre | miR-431, og (D) åre | miR-127

vi har også fastslået, at data indsamlet fra de samme serumprøver efter at være frosset ved -80 ° C i 1 uge efter den første miRNA tests, svarede til de oprindelige data. MikroRNA’er fra alikvoter af 2 serumprøver fra cancerpatienter (1 prostata- og 1 colon) blev ekstraheret, mærket og hybridiseret til arrays, og efter en frysning /optøning begivenhed blev nye portioner ekstraheres igen, mærket og hybridiseret til en anden gruppering. Datasæt, fra re-analyseres prostatakræft prøve 811 og kolon prøve 792, viste stærke korrelationer når rå array-data blev sammenlignet (r

2 = 0,94 og 0,96 henholdsvis). Dette resultat indikerer, at analysen er reproducerbar og stabil over tid.

Serum microRNA dataanalyse

Flere prostata, æggestokke, tyktarm, bryst og lungekræft serumprøver samt normal mandlige og kvindelige donor sera er blevet analyseret på den pan-miRNA microarray at fastslå serum miRNA profiler og bekræfte specificiteten af ​​de profiler til forskellige kræftformer og normale donorer. Adskillige data analysemetoder er blevet testet for at bestemme den mest relevante metode til diskrimination af kræft versus normal. Til den indledende analyse, log vi

2-transformeret serum miRNA probe signaler fra en normal donor og sammenlignet disse data til at logge

2-transformerede probe data fra en prostatacancerpatient og fra en prostatacancer-cellelinie. Selv om både prostatacancer serumprøven og prostatacancer-cellelinie (22Rv1) prøve viste opregulering forhold til en normal serumprøve, de ikke viser stor lighed med hinanden. På dette tidspunkt, vi simpelthen konstatere en relativ opregulering af serum miRNA i kræft i forhold til serum fra normale donorer (Figur 2).

Log forvandlet normal donor serum miRNA signaler (blå linje) blev sammenlignet med miRNA array-signaler fra en prostatacancer-cellelinie 22Rv (åbne firkanter) og fra en prostatacancerpatient (lukkede ruder). Generelt kræft og cellelinje miRNA synes at være opreguleret i forhold til normale donor serum miRNA.

Vi først satte sig for at definere et minimalt sæt sonder, der ville tillade os at skelne mellem prostata og normale serumprøver. Signal fra hver miRNA probe var første baggrund korrigeret ved hjælp af negative kontrol sonder. Efterfølgende blev hver miRNA probe udtrykt som den naturlige logaritme af forholdet mellem den selv og den samme probe i en normal human mandlig serum prøve. Dette giver en værdi på 0 for alle prøvetagningssonder basen serum og en op eller ned regulering i forhold til at prøve (normal) for alle de andre prøver (normal og kræft). Figur 3 viser forholdene mellem en delmængde af prober, der passerede flere kriterier. Alle prostatakræft probe datasæt blev filtreret for at fjerne alle prober hvis perfekt match signal var ikke større end dens mutant signal. Femten miRNA fandtes at være over-udtrykkes i serum fra alle trin 3 og 4 prostatakræft patienter (miR-16, -92a, -103, -107, -197, -34b, -328, -485-3p, -486 -5p, -92b, -574-3p, -636, -640, -766, -885-5p) med hensyn til 8 normale kontroller (Figur 3). Denne analyse viste også en lidt forhøjet signal for miR-141 i fase 3 og 4 prostatakræft patient sera (middelværdi = 829, STD = 201) i løbet af normal donor sera (middelværdi = 555, STD = 64); hvilket er i overensstemmelse med data rapporteret af Mitchell et al [7] med RT-PCR.

Efter datasæt normalisering, den naturlige log af forholdet mellem signalet for en specifik probe i samme probe fra den normale serum prøve blev taget. 15 miRNA viste opregulering i alle fase 3 og 4 prostatakræft prøver sammenlignet med sera fra normale mandlige donorer. Disse miRNA er angivet nedenfor hvert datasæt. Fem trin 3 og 4 prostatakræft sera (gul), og 8 normal mandlig donor sera (rød) blev analyseret. Lodrette linje viser plus eller minus én standardafvigelse af middelværdien.

I figur 4 har vi plottede z-score-korrigeret signal intensiteter for tre hybridiseringer. Z-score normalisering blev beregnet ved at subtrahere signalet på hver probe ved middelværdien af ​​testprober fra hele hybridisering og derefter, ved at dividere denne værdi med standardafvigelsen af ​​signalet tværs testprober, på tværs af hver hybridisering. Normaliseringen udbytter probesignaler, der er centreret og normaliseret til et gennemsnit på 0 og en standardafvigelse på 1,0. For hver parcel blev signal sorteret fra højeste til laveste intensitet, og plottet som en fast linje. Perfekt match /mismatch (pm /mm) forhold blev plottet som åbne trekanter over signalintensiteten linje. Det er klart, prober med højere intensiteter har betydeligt højere pm /mm forhold. For signal fra en miRNA der foreligger væsentlig, skal dens perfekte match (vildtype anti-sense) sonde signal være større end dets dobbelte mutant negativ kontrol (mm) sonde. Specifikt skal pm /mm forholdet være større end 1,5 (afbildet på højre side y-aksen). Med denne parameter blev mindst 34 sonder betragtet som signifikant for den normale serum prøve (figur 4A). For prostatacancercellelinie 22Rv1 serumprøve prøve og prostatacancer (figur 4 B og C), der var 57 og 62 betydelige prober hhv. På det enkleste niveau, at de fleste af de prober, der har høj signal har også høje pm /mm forhold, indikerer, at de signaler, vi læser er reelle. Vi udførte også flere ikke-miRNA negative kontrol hybridiseringer. For disse hybridiseringer, selv om nogle sonder har en højere signal end andre, det er ikke ledsaget af en tilsvarende stigning i PM /mm nøgletal (ikke vist)

(A) Analyse af signal fra normalt serum.; (B) Analyse af signal fra 22Rv1 cellekultur; og (C) signal fra prostatacancer patientserum. Z-score (blå linjer) blev bestemt ved at subtrahere signalet på hver probe ved middelværdien af ​​testprober fra hele hybridisering og derefter, ved at dividere den resulterende værdi af standardafvigelsen af ​​signalet tværs testprober, på tværs af hele hybridisering.

Hierarkisk klyngedannelse.

Hierarkisk klyngedannelse blev brugt til at gruppere prøver fra forskellige sygdomme og normale tilstande (figur 5). Datasættet anvendes til klyngedannelse indeholdt 35 serumprøver, der var en blanding af normalt serum og kræft serumprøver fra forskellige typer og sværhedsgrad (faser) (se tabel 1 og 2). Da de fleste af miRNA anvendes på mikroarrayet ikke er til stede i påviselige niveauer i de fleste serumprøver blev clustering kun udført på en delmængde af miRNA. Denne undergruppe blev trukket fra gruppen af ​​miRNA, der blev bedømt til at være betydelig. Kun signal fra miRNA probe sæt, der blev anset for at have været betydelig i mindst 5 hybridiseringer på tværs af hele datasættet blev taget og anvendt til yderligere analyse. Signal fra testprober (vildtype anti-sense) var log

2-forvandlet. Disse prober blev derefter normaliseret ved omdannelse til Z-score. Kun testprober, ikke nogen af ​​de negative kontroller eller spike-ins, blev anvendt til denne beregning. Signal blev derefter tærsklingsbehandlet baseret på betydning. Hierarkisk klyngedannelse blev udført under anvendelse af et program skrevet i huset, der bruger spearman rang korrelation som afstanden funktion. Udgangen for dette program er et dendrogram, der blev vist ved hjælp af programmet TreeView [11]. Clustering indikerer en klar afgrænsning mellem normal og de fleste kræft prøver (figur 5).

Cancer prøver og normale donorprøver (parentes) blev grupperet ved hjælp af et hierarkisk klyngedannelse program for at vise prøve-til-prøve relationer. Prøve mærker inkluderer donor tilstand (kræft type eller normal), prøve lotnummer (sidste tre cifre), køn og cancer etape (2 – 4, eller 0 for normal). Etiketter markeret med a eller b angiver gentaget testning af den samme prøve. Vejviser

Heat Map Analysis.

For yderligere at undersøge miRNA ansvarlige for klyngedannelse, Heat kort blev anvendt til at søge efter ligheder mellem miRNA ekspressionsmønstre inden for hver prøve. Denne metode er mest effektiv, når rækker og kolonner er beordret til at tillade disse mønstre let at identificere. Clustering blev således brugt til at give denne bestilling (ved at identificere miRNA, der har lignende ekspressionsmønstre, og arrangere dem i umiddelbar nærhed). Disse data blev porteret til open source program, Cluster [12]. De rå data for både prøve og miRNA-signal blev median centreret og derefter grupperet hjælp gennemsnitlige kobling, Spearman rank koefficient som en afstand funktion. Heatmaps blev vist ved hjælp Treeview [11]. Denne fremgangsmåde resulterede i en klar ordning af prøver taget fra vores test-sæt (figur 6). Prøver blev mærket med en entydig identifikator. Serumprøver fra patienter med colon, prostata, ovarie, bryst og lungekræft i forskellige stadier af sygdommen og behandlingen blev anvendt i dette datasæt. Denne analyse resulterede i to hovedgrene:. Én større klynge af sekvenser indeholdende de fleste af de cancer prøver, og en anden gren, der indeholder den normale gruppe sammen med en anden cancer gruppe (figur 6)

Sættet af miRNA anvendes til analyse blev valgt baseret på signifikans i mindst 5 hybridiseringer. En sonde-sæt blev vurderet signifikant, hvis forholdet mellem perfekt-match (PM) /mismatch (MM) sonder var større end 1.5.For hver hybridisering i analysen, blev eneste væsentlige signal bruges til klyngedannelse. Signal for de miRNA hvis signal blev dømt signifikant ved PM /MM-forhold var Log 2 konverteret. Derefter signalet var median normaliseret over denne hybridisering og Gennemsnitlig Linkage Clustering blev udført under anvendelse af et Spearman Rank Correlation. Clustering blev visualiseret under anvendelse af programmet TreeView [12]. Grøn angiver negative værdier og Rød indikerer positive værdier. Prøver identificeres som enten normalt (blå bjælke) eller cancer (gul bar) øverst i figuren. miRNA navne er anført til højre og prøve identifikationer er anført ovenfor

Afgørelse Tree Analysis

For hver miRNA modne region blev to kontroller skrevet på chippen:.. en følelse vild -type probe (r), en anti-sense vildtype (PM) -form og en dobbelt mutant kontrol (MM). Denne probe sæt blev anvendt til at evaluere betydningen samt intensiteten af ​​hver miRNA modne form. For hver hybridisering blev råsignalet ekstraheret og prober blev grupperet efter miRNA at de var designet til. PM-signalet var log

2 forvandlet, og Z-normaliseret. For klassifikatoren og for det fokuserede cancer versus normal hierarkisk klyngedannelse, brugte vi en simpel heuristik for at bestemme om en probe faktisk var til stede. For hver miRNA, der blev evalueret, vi tælles et signal betydeligt, hvis signalet for PM /MM 1,0. Hvis ja, blev derefter Z-normaliseret log

2 (signal) anvendes til dette miRNA, ellers sonden omkring den bestemte probe ikke blev anvendt. Normalisering blev således udført i løbet af anti-sense vildtypeprober hele chip; blev dog kun data fra betydelige sonder anvendt til klyngedannelse og klassificering.

Data Mining blev udført ved hjælp af WEKA pakke [13]. Normaliseret sonde intensitet data blev konverteret til ARFF format og input til WEKA programmet. Hybridiseringer blev inddelt i to klasser, “kræft” og “normale”. Vi brugte CfsSubsetEval rutine at vælge miRNA (attributter). Denne metode gav den bedste klassificering af dataene i de to klasser. Denne rutine vurderer prædiktive evne af de enkelte attributter samt graden af ​​redundans blandt hver miRNA. Den foretrækker attributter, der er stærkt korrelerede inden for hver klasse, men har lav inter-korrelation. Valget af attributter blev udført under anvendelse af 10-fold krydsvalidering, og udvælgelse af de 28 bedste egenskaber var baseret på, at de blev valgt mindst 30% af tiden.

Vi næste ekstraheret signalet fra hver hybridisering til blot dette udvalgt sæt af miRNA s. I figur 7A blev to forskellige klassificører bruges til at skelne cancer vs. normale prøver. En Bayesiansk netværk og en instans-baserede metode kaldet K * [14] var i stand til klart at skelne mellem de to klasser inden for 36 prøver. Clustering blev næste udføres ved hjælp af Cluster program fra Eisen et al. [12]. Gennemsnitlig binding blev anvendt som kriterierne for træ-building og Spearman rank korrelation blev anvendt som afstanden funktion. Figur 7 B viser en langt bedre adskillelse af normal vs. kræft patientprøver.

Data Mining blev udført ved hjælp af WEKA pakke [13]. miRNA prober (attributter) blev valgt ved hjælp af et udvalg attribut rutine kaldet CfsSubsteEval. (A) 28 miRNA blev fundet ved hjælp af denne metode. To forskellige klassificeringen metoder, både netværket gennemførelse Bayes og K * metoder [14] var i stand til korrekt at klassificere disse prøver (ved anvendelse af 10-fold krydsvalidering). Resultaterne for både klassificeringen kørsler vises som en forvirring matrix til højre. (B) Hierarkisk klyngedannelse af normale og cancer prøver blev udført ved hjælp af signal fra disse 28 miRNA. Røde blokke er stærkt udtrykt, grøn anses nedreguleret og sorte blokke er ikke-signifikant som bedømt ved PM /MM kriterierne i teksten. Prøver identificeres som enten normalt (blå bjælke) eller cancer (gul bar) øverst i figuren. miRNA navne er anført til højre og prøve identifikationer er anført ovenfor.

Analyse af kodede prøver.

miRNA microarray data fra kræftpatienter og normal donor sera blev kodet for at fjerne enhver indikation af sygdomsstatus og sendt til analyse. Brug af undergruppe af attributter, der er beskrevet ovenfor og i figur 7, blev 16 single-blindet prøver tilsat til datasæt og analyseret med klassificeringen. K-star klassificeringen var i stand til at ringe 16/16 prøver korrekt som enten fra kræftpatienter eller normale donorer, mens Bayes Network klassificeringen produceret 3 fejlklassificeringer ud af 16 (data ikke vist).

Diskussion

miRNA ekspressions- signaturer har en potentiel rolle i diagnose, prognose og terapi af humane sygdomme, herunder cancer, hjertesygdomme, virusinfektioner og inflammatoriske sygdomme [1] – [4], [10], [15] – [25 ]. Deregulering af miRNA i kræft kan være forårsaget af kromosomale deletioner, amplifikationer og omplantning; ved hypermethylering af CpG øer; og ved regulering af transskription og post-transkriptionel forarbejdning [1], [2], [23]. Afvigende ekspression af miRNA kan påvirke udviklingen af ​​kræft ved at påvirke ekspressionen af ​​onkogener eller tumorsuppressorer, og miRNA, såsom MIR-17-92 klynge, kan fungere direkte som onkogener [1], [2], [23]. miRNA er også involveret i kræft gennem deres effekt på cellecyklus, apoptose, metastase, og angiogenese [1], [2], [23].

Flere undersøgelser har beskrevet de miRNA, der er forbundet med kræft [ ,,,0],15], [23], [26] – [32]. De fleste af disse undersøgelser har anvendt biopsiprøver, arkivering væv eller cancerceller [5], [33] – [37]; eller har brugt miRNA udvundet paraffin indlejret eller formalin faste væv [38]. Ved at sammenligne ikke-cancervæv omgivende cancerøse væv eller normale donorer versus kræftpatienter, disse miRNA, der er op eller nedreguleret kan identificeres, ofte efter PCR-amplifikation. Mange undersøgelser er blevet offentliggjort beskriver specificitet miRNA til forskellige typer af kræft, kræft stadier og kræftbehandling og flere anmeldelser er offentliggjort, at opsummere de seneste oplysninger om de roller, miRNA i kræft [1], [2], [5 ], [6], [15], [23], [25], [32]. Disse undersøgelser viser anvendeligheden af ​​miRNA i både diagnose og prognose af flere kræftformer og også skelne mellem kræft og godartede lidelser [34]. Mens talrige undersøgelser har ført til en forståelse af miRNA på en væv eller celleniveau, er der for få af data i serum undersøgelser hæmmer deres anvendelse i rutinemæssig diagnose.

For nylig en række undersøgelser er udført på miRNA tilstedeværende i serum [7] – [9], [39] – [41]. I en nylig rapport, blev miRNA vist at være signifikant forhøjede hos gravide versus ikke- gravide kvinder [40]; og i en anden undersøgelse blev placentale miRNA vist at være til stede i maternelt plasma [42]. I disse undersøgelser blev miRNA sig at være meget stabil over for opbevaring og også for enhver RNAse nedbrydning. miRNA er for nylig blevet vist af Mitchell et al [7] for at cirkulere i serum af patienter med prostatacancer [7]. Især kunne miR-141 differentiere prostatacancer patienter fra normale individer [7]. I et værk af Taylor og Gercel-Taylor [9], der cirkulerede tumor exosomer isoleret fra serum af patienter med ovariecancer ved hjælp af magnetiske perler og et antiEpCAM antistof. miRNA blev derefter ekstraheret, mærkes og påvises ved microarray. Denne tilgang, ved hjælp af større mængder serum, viste, at otte diagnostiske miRNA var opreguleret i cancer exosomer: MIR-21, mir-141, miR-200a, miR-200C, miR-200b, miR-203, miR-205, og mIR-214. Hidtil dog ingen rutineanalyse er tilgængelig for behandlingen miRNA signaturer i serum eller i plasmaet hos cancerpatienter.

Et emne, der vises i disse undersøgelser er, at de miRNA ekspressionsmønstre set i serum ikke er identiske til dem, der ses fra miRNA taget direkte fra kræft cellelinjer. I vores undersøgelse fandt vi, at selv om både prostatacancer serumprøven og prostatacancer-cellelinie (22Rv1) prøve viste opregulering forhold til normal serumprøve, de viser ikke stor lighed med hinanden. Denne tilsyneladende uoverensstemmelse kunne finde sted for en række årsager. Den mest åbenlyse af dem er muligheden for, at prøver fra cellelinier selv er ikke repræsentative for, hvad der vises i serum. Vi kan spekulere, at den mest oplagte kilde til miRNA, der vises i serum er et produkt af tumorcellelyse; imidlertid kan det også være muligt, at deres udseende i serummet er produktet af en form for aktiv transport involverer dannelsen af ​​exosomer (36). Dette ville forvirre en direkte sammenligning mellem miRNA ekspressions patters afledt fra cellelinie og tumor med dem, der er serum-afledt.

Oplysninger om anvendelsen af ​​miRNA som biomarkører er overvejende knyttet til undersøgelser af vævsprøver eller cancercelle linjer. Tydelige mønstre af miRNA udtryk er i stand til at skelne mellem celle type og stadium i forskellige kræftformer. Det lover godt for diagnostiske og prognostiske anvendelser af miRNA-profiler. Det indikerer også, at der er et klart behov for at definere udtrykket profiler af miRNA i serum af kræftpatienter og sammenligne disse til profiler observeret i serum hos enkeltpersoner, der repræsenterer en række af syge og sunde tilstande. Det forventes, at miRNA profiler i serum har potentialet til at være tidlige markører til påvisning kræft og vil også spille en rolle i kontrollen af ​​sygdomsstatus under kemoterapi.

I denne undersøgelse har vi bestemt, at en tilstrækkelig mængde af miRNA er til stede i én ml af humant serum til frembringelse af et påviseligt signal på et mikroarray anvendelse af fluorescens eller elektrokemisk detektion. På det enkleste niveau, har denne undersøgelse vist, at serum miRNA er opreguleret hos cancerpatienter i sammenligning med normale donorer. I en sammenligning af fase 3 og 4 prostatakræft sera og normal donor serum miRNA niveauer, fandt vi, at 15 miRNA (miR-16, -92a, -103, -107, -197, -34b, -328, -485-3p , -486-5p, -92b, -574-3p, -636, -640, -766, -885-5p) var opreguleret i serum fra patienter med prostatacancer i forhold til normal donor sera.

Heat Kort og klynge analyser viser, at serum miRNA signaturer kan også anvendes til at adskille kræftpatienter og normale donorer i de fleste tilfælde. Femogtres miRNA (se figur 6) blev anvendt i en Heat Kort analyse, der isoleret 21 cancer prøver plus 3 genanalyseres prøver, fra normale prøver. Seksten kræft prøver grupperet sammen, mens fem kræft prøver dannede en separat klynge inden for det normale prøve klynge. Cluster analyse (se figur 5) blev også anvendt til at skelne 21 cancer prøver fra 12 normale prøver. Tre kræft prøver, der blev re-analyseret efter fryse-optøning og opbevaring, også grupperet med prøverne kræft

Vi har også vist, at serum miRNA kan påvises på et niveau svarende til den, der er rapporteret for TaqMan PCR fra serum, cirka 4.000 kopier pr ul [7], og at analysen er stabil til gentagen stikprøvekontrol efter opbevaring. Den relative følsomhed miRNA microarrays forhold til standard ekspressionsvektorer arrays kan skyldes hybridiseringskinetikken af ​​små oligonukleotider. Små molekyler tendens til at have bedre hybridiseringskinetik end større RNA- eller DNA-molekyler. De fleste af de termodynamiske modeller til forudsigelse DNA-hybridisering adfærd blev udviklet ved anvendelse korte oligonukleotider [43]. Mange af de konklusioner sådanne undersøgelser gælder ikke, når større molekyler anvendes som sekundær struktur, ikke-specifik binding, og forskellige andre uforudsigelige effekter forstyrre forudsagt hybridisering adfærd. For miRNA, både deres beskyttelse mod fordøjelse af forskellige cellulære faktorer, og deres lille størrelse bidrager til deres detektion i serum ved microarrays på niveauer, der er så lave som dem, der ses med metoder, der ellers ville blive betragtet mere følsomme, såsom RT-PCR. Følsomheden af ​​microarray platform, der anvendes her har givet os mulighed for at overvåge miRNA fra et lille rumfang serum og at klassificere sera enten fra normale donorer eller fra cancerpatienter.

Vores resultater generelt enige i mange tilfælde med tidligere publicerede undersøgelser.