PLoS ONE: HATL5: A Cell Surface Serin Protease udtrykkes forskelligt i Epithelial Cancers

Abstrakt

I løbet af de sidste to årtier, celleoverflade proteaser tilhører den type II transmembrane serinprotease (TTSP) familie er dukket op som vigtige enzymer i pattedyrs degradome, spille kritiske roller i epitel biologi, regulering af metaboliske homeostase, og kræft. Humane luftveje trypsinlignende protease 5 (HATL5) er en af ​​de få familiemedlemmer, der forbliver ukarakteriserede. Her demonstrerer vi, at HATL5 er en katalytisk aktiv serinprotease, der inhiberes af to Kunitz typen serinproteaseinhibitorer, hepatocytvækstfaktor aktivator inhibitor (HAI) -1 og 2, samt ved serpinA1. Fuldlængde HATL5 er lokaliseret på celleoverfladen af ​​dyrkede mammale celler som påvist ved konfokal mikroskopi. HATL5 viser en relativt begrænset væv ekspressionsprofil, med både transkript og protein til stede i livmoderhalsen, spiserør, og mundhulen. Immunohistokemisk analyse afslørede et ekspressionsmønster hvor HATL5 er lokaliseret på celleoverfladen af ​​differentierede epithelceller i den lagdelte pladeepitel af alle tre af disse væv. Interessant er HATL5 faldt betydeligt i hals-, esophageal, og hoved og hals carcinomer i sammenligning med normalt væv. Analyse af livmoderhalskræft og kræft i spiserøret væv arrays viste, at de pladeepitelceller mister deres udtryk for HATL5 protein på malign transformation

Henvisning:. Miller GS, Zoratti GL, Murray AS, Bergum C, Tanabe LM, List K ( 2014) HATL5: en celleoverflade serinprotease udtrykkes forskelligt i epitelcancer. PLoS ONE 9 (2): e87675. doi: 10,1371 /journal.pone.0087675

Redaktør: Claudia Daniela Andl, Vanderbilt University, USA

Modtaget: 18 oktober, 2013; Accepteret: December 28, 2013; Publiceret: 3 feb 2014

Copyright: © 2014 Miller et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af start-up midler fra Wayne State School of Medicine og Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

type II transmembrane serinproteaser er opdelt i fire fylogenetisk adskilte underfamilier: de humane luftveje trypsinlignende (HAT) /differentielt udtrykt i pladecellecarcinom genet (DESC) underfamilien, hepsin /transmembrane protease serin (hepsin /TMPRSS) underfamilie, matriptase underfamilie, og Corin underfamilien. HATL5 tilhører HAT /DESC underfamilien sammen med HAT, DESC1, TMPRSS11A, og HAT-like 4 [1] -. HATL5 (HATL-5, HAT-lignende 5) er kodet af TMPRSS11b gen lokaliseret inden for en enkelt genklynge omfatter alle de HAT /DESC gener i både mus og mennesker [4]. Alle medlemmer af HAT /DESC underfamilien består af en stilk region med en enkelt søpindsvin sperm protein, enteropeptidase, agrin (SEA) domæne og et C-terminalt serinproteasedomæne. Der er en omfattende mængde litteratur dokumenterer kritiske roller medlemmer af hepsin /TMPRSS, matriptase og Corin underfamilier i fysiologiske og patologiske processer. Kritiske roller for disse TTSPs er blevet beskrevet i forskellige områder og omfatter epitelial udvikling og homeostase, jern metabolisme, hørelse, fordøjelse, blodtryk regulering, samt virusinfektion, inflammation og onkogenese [3] [5], [6]. Forholdsvis få undersøgelser, der kendetegner de biokemiske egenskaber af HAT /DESC underfamilie og /eller udforske deres fysiologiske funktioner er blevet offentliggjort. HAT er blevet rapporteret at have fibrinogenolytic aktivitet, til at modulere urokinase-receptoren og aktivere protease-aktiveret receptor (PAR) 2 [7] [8], [9] [10], [11]. Desuden kan HAT uncoat reovirus virioner til at fremme infektion i cellekultur og spalter overfladen glycoprotein, hemagglutinin (HA), af influenzavirus [12] [13], [14]. For nylig viste en undersøgelse beskæftiger genetisk ablation af TMPRSS11A og HAT i mus viste, at de to proteaser kan undværes for udvikling, generelle sundhed og overlevelse på lang sigt i fravær af eksterne udfordringer eller yderligere genetiske underskud [15].

i denne undersøgelse udførte vi en biokemisk karakterisering og ekspression analyse af HATL5. Fuldlængde HATL5 cDNA styrer ekspressionen af ​​et 60 kDa N-glycosyleret protein, der lokaliserer til celleoverfladen af ​​mammale celler. Det oprensede aktiverede HATL5 serinproteasedomænet hydrolyserer syntetiske peptidsubstrater, og inhiberes af medlemmer af to forskellige serinproteaseinhibitor familier: Kunitz-typen; HAI-1, HAI-2 og aprotinin, og serpinfamilien element; serpinA1. HATL5 protein lokalisering er bemærkelsesværdigt ens i de tre forskellige væv analyserede: livmoderhals, spiserør og mundslimhinden. Således er HATL5 hovedsageligt detekteres på overfladen af ​​epitelceller i disse stratificeret pladeepitel. Under carcinogenese, er ekspression af celleoverflade-protease overvejende formindsket, og i mange tilfælde, ikke påvises i de squamous carcinomceller.

Materialer og metoder Salg

etiske retningslinjer

brug af menneskelige væv paraffin arrays blev godkendt i henhold til de institutionelle retningslinier ved Wayne State University Institutional Review Board Administration (# 2013-43).

Kloning og ekspression af fuld længde menneskelig HATL5

human esophageal RNA blev opnået fra Biochain (Newark, CA). Første streng cDNA-syntese blev udført med oligo (dT) primere ved anvendelse af et RETROscript kit ifølge producentens instruktioner (Ambion, Life Technologies, Grand Island, NY). Gene specifikke primere blev designet til fuld-længde menneske HATL5 ved hjælp af den deponerede sekvens for

Homo sapiens

transmembrane protease, serin 11B, mRNA, GenBank # BC126195.1. De primere 5′- GCCACCATGTAC-AGGCACGGCATATC-3 ‘og 5′- GAGTCCAGTCTTGGATGTAATCC-3’ blev anvendt til at amplificere cDNA’et ved anvendelse af en high-fidelity Platinum®Taq polymerase (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY), som derefter blev indsat i pcDNA 3.1 /V5-His TOPO® TA (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) i ramme med et C-terminalt His-mærke og V-5 epitop. Konstruktioner blev verificeret ved sekventering (ABI Prism 3730 DNA Analyzer, Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY). Transfektion af HEK293 og COS-7-celler (ATCC, Manassas, VA) blev udført under anvendelse af lipofectamin 2000 i overensstemmelse med producentens instruktioner (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY). Celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA). Transfektion blev udført med 4,0 ug fuld længde HATL5-indeholdende plasmid-DNA. Cellerne blev lyseret ved anvendelse af RIPA buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris /HCl, pH 7,4, 0,1% SDS, 1% NP-40, og protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og klaret ved centrifugering ved 12.000 x g ved 4 ° C °. Proteinkoncentrationer blev bestemt ved anvendelse af et Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Waltham, MA). Proteinprøver blev adskilt ved SDS-PAGE under anvendelse af 4-12% NuPAGE Bis-Tris-geler (Life Technologies, Grand Island, NY) under reducerende betingelser og analyseret ved western blotting under anvendelse af en primær V-5-monoklonalt museantistof (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) og et gede-anti-muse-sekundært alkalisk phosphatase-konjugeret antistof (Millipore, Billerica, MA).

Kloning og ekspression af human HATL5 serinproteasedomænet Pro-formen

human HATL5 serinprotease (SP) domæne blev klonet ind i pSecTag2a plasmidet (Life Technologies, Grand Island, NY) til ekspression og analyse i mammal cellekultur. HATL5 serinproteasedomænet sekvens fra det humane fuldlængde HATL5-V5-His plasmid blev PCR-amplificeret under anvendelse af følgende primere: 5′-CCAAGGATCCATGTTGTGGGAGACAAGTAGCCAAC-3 ‘og 5′-CCAAGCGGCCGCGAGTCCAGTCTTGGATGTAATCC-3’. Det resulterende PCR-fragment blev klonet i pSecTag2a vektoren mellem BamHI- og Notl-steder ved hjælp af standardteknikker. Transfektion af CHO-celler (ATCC, Manassas, VA), proteinekstraktion og Western blot-analyse blev udført som beskrevet ovenfor. Et monoklonalt muse-anti-Myc-antistof (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) blev anvendt til detektion ved western blotting.

Kloning og ekspression af HATL5 Active serinproteasedomænet i

Pichia pastoris

Den humane HATL5 aktive serinproteasedomænet blev produceret i gær ved anvendelse af en Pichia Expression Kit (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY). For kloning i pPIC9 vektor, HATL5 serinprotease sekvens fra pcDNA 3.1 V5 /HIS /TOPO menneske-HATL5 plasmid blev muteret til at fjerne en XhoI websted ved hjælp af Agilent Quick-Change II ™ mutagenese kit (Agilent Technologies, Inc. Santa Clara, CA). Primere til mutagenese var: 5′-gccaggtgtctatactcgggtgacttcttatcgcaattgg-3 ‘og 5′-ccaattgcgataagaagtcacccgagtatagacacctggc-3’. Mutagenese resulterede i en enkelt synonym punktmutation, således gengive den native aminosyresekvens. Efter mutagenese blev human HATL5 serinproteasedomænet amplificeret og klonet ind i pPIC9 vektoren ved Xhol- og Notl-steder, anvendelse af primerne 5′-tctctcgagaaaagaattgtgaatggaaaaagctccc-3 ‘og 5′-attcgcggccgctcagagtccagtcttgg-3’. Kloning resulteret i HATL5 aktiveret serinprotease domæne sekvens (Ile-Val-Asn) er indsat umiddelbart efter en Leu-Glu-Lys-Arg KEX2 spaltningssite kodes af vektoren. Leu-Glu-Lys-Arg-Ile-Val-Asn spaltes mellem Arg og Ile af gæren protease KEX2 som er et transmembrant protease placeret i Golgi, gengive en secerneret aktiveret HATL5 serinproteasedomæne. Ekspression af matriptase aktiv serinproteasedomænet i

Pichia pastoris

blev udført parallelt som beskrevet [19]. Transformation blev udført i TOP-10 kompetente celler (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) og pPIC9-HATL5 positive kloner blev isoleret og amplificeret ved anvendelse af standardteknikker. Til transformation af

Pichia pastoris

, 40 ug pPIC9-human-HATL5, pPIC9-matriptase, pPIC9 tom vektor blev fordøjet med Sall og oprenset ved phenol-chloroform-ekstraktion. Elektroporering af lineariserede plasmid ind i GS115 gærstamme (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) blev udført ved 1,5 kV anvendelse af 0,2 cm kuvetter (BioRad, Hercules, CA) i en BTX-Transporator Plus (Harvard Apparatus Holliston, MA). Ekspressionen af ​​rekombinante proteaser i de konditionerede medier fra individuelle gærkloner blev analyseret ved SDS-PAGE og western blotting under anvendelse af et kanin-anti-TMPRSS11b (Abcam, Cambridge, MA) eller et kanin-anti-matriptase antistof (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) . HATL5 og matriptase proteiner blev oprenset ved anionbytningskromatografi under anvendelse af en HiTrap Q HP-søjle (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) som beskrevet [16].

Chromogenic Proteinase Assays

Analyserne gennemføres i plader med 96 brønde i et totalt reaktionsvolumen på 100 pi anvendelse af 50 mM Tris-HCI pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,01% Tween-20, 0,01% BSA til fortynding af alle prøver. 5 nM oprenset aktivt rekombinant HATL5 eller matriptase serinproteasedomænet blev inkuberet ved 37 ° C i 60 minutter med 100 pm af det syntetiske peptid L-1720 Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA (Bachem, Bubendorf, Schweiz) i fravær eller tilstedeværelse (inhibitor og substrat tilsættes samtidigt) i HAI-1 (60 nM) (R hvoraf fem er placeret i serinproteasedomænet (fig. 1A og B). Det katalytiske domæne af muse HATL5 indeholder de væsentlige serinproteaseinhibitorer katalytiske triade rester, H

225, D

270, S

366, og substratet bindende lomme-rester, D

360, S

386 og G

388. SWG motiv i det katalytiske domæne er konserveret i alle medlemmer af HAT /DESC underfamilien og forventes at være placeret på toppen af ​​substratet bindende lomme, positionering spaltelige binding af substratet i den korrekte orientering (S

386WG i HATL5). Proteolytisk aktivering af HATL5 forudses at opstå inden et motiv (K

184IVNG) ved krydset af pro- og katalytiske domæner. Disse resultater tyder på, at

TMPRSS11b

gen sandsynligvis koder en funktionel serinprotease

(A) Aminosyresekvens af human HATL5 (UniProtKB /Swiss-Prot: Q86T26.3).. Aminosyrerester koder det transmembrane domæne er understreget. Regionen med homologi til søpindsvin sperm protein, enteropeptidase, agrin (SEA) domæner er angivet med en optrukket linie box og trypsinlignende serinprotease domæne er angivet med en punkteret linie boks. Den katalytiske rester His

225 (H), Asp

270 (D), og Ser

366 (S) er angivet med firkanter. Potentielle N-glycosyleringssteder er angivet med cirkler. Aktiveringen spaltningssted er indikeret med en pil, og de to cysteinrester forudsiges at danne en disulfidbro forbinder stilken region til serinproteasedomænet ved aktivering spaltning er angivet med trekanter. (B) Skematisk fremstilling af den forudsagte domæne arkitektur HATL5. TM = transmembrane domæne, SEA = Sea urchin sperm protein, Enteropeptidase, Agrin domæne, N indikerer forudsagte N-glycosyleringssteder, aktivering spaltningsstedet er angivet med en pil, og SS repræsenterer disulfid bro forbinder havet og serin protease-domæner [31 ].

HATL5 er et 60 kDa glycosyleret protein

for at karakterisere HATL5 protein kodet af

TMRSS11b

gen blev den fuld længde humane cDNA genereret af high-fidelity PCR under anvendelse af et humant cDNA-bibliotek spiserøret. CDNA’et blev sekventeret, bekræftet at være identisk med den forudsagte cDNA-sekvens, og blev indsat i en mammal ekspressionsplasmid der indrettet det udtrykte protein med en V5-His epitopmærke ved C- terminalen (fig. 2A, top). Derudover blev en mammal ekspressionsvektor indeholdende pro-formen af ​​serinproteasedomænet, herunder 15 aminosyrer opstrøms for aktiveringsstedet, og et C-terminalt myc-tag genereret (figur 2A, i midten) samt en

Pichia pastoris

vektor til sekretion af det spaltede aktive form af serinprotease domæne (figur 2A, nederst). Efter transfektion af fuldlængde HATL5 vektor i HEK293, COS-7, eller CHO-celler, henholdsvis cellelysaterne blev analyseret ved SDS-PAGE og western blot. I alle tre cellelinjer, blev et protein-produkt på ca. 60 kDa detekteret (fig. 2B). Denne tilsyneladende molekylvægt er betydeligt højere end den forudsagte molekylmasse på 46 kDa, hvilket antyder, at HATL5 er underlagt post-translationelle modifikationer. For at undersøge om det udtrykte HATL5 kan være posttranslationelt modificeret ved glycosylering, blev proteinekstrakter fra transficerede HEK293, COS-7, eller CHO-celler underkastes enzymatisk deglycosylering før Western blot-analyse. Deglycosylering af fuld længde HATL5 ført til fremkomsten af ​​en ~48 kDa arter, der var til stede i ekstrakter fra alle tre cellelinjer (Fig. 2B). I betragtning af at den V5-His-tag tilføjer ca. 5 kDa til det rekombinante protein, det deglycosylerede form af fuld længde HATL5 har en tilsyneladende molekylmasse meget tæt på den forudsagte molekylmasse. Fem af de otte potentielle N-glycosyleringssteder er placeret i serinproteasedomænet. For at bestemme om serinproteasedomænet af HATL5 er glycosyleret, blev serinproteasen pro-formen udskilles af transficerede CHO-celler behandlet med deglycosylering enzymer og analyseret ved western blotting. Forud for deglycosylering denne formular havde en tilsyneladende molekylvægt på 45 kDa (fig. 2C, venstre). Den forudsagte molekylmasse på denne secernerede form af HATL5 er 30 kDa, herunder myc-tag. Efter deglycosylering, en reduktion i tilsyneladende molekylvægt, til en 30 kDa form blev observeret. En lignende observation blev gjort ved deglycosylering af umærkede kløvet aktive HATL5 serinproteasedomænet udskilles af transficeret

Pichia pastoris

(forudsagt molekylmasse = 26 kDa), der resulterede i en form med en tilsyneladende molekylmasse på -28 kDa ( fig. 2C, højre). Tilsammen denne analyse viser, at humant HATL5 er en 60-kDa glycoprotein, og at en eller flere af de fem potentielle

N

-bundne glycosyleringssteder i serinproteasedomænet udnyttes.

( A) Skematisk repræsentation af de tre forskellige rekombinante HATL5 proteiner genereret til denne undersøgelse. V5-H = V5-His epitopmærke (B) Hel celle proteinlysater fra HEK293, COS-7, eller CHO-celler, der udtrykker fuld længde V5-His-mærkede human HATL5. (C) konditionerede medier fra CHO-celler, der udtrykker myc-tagget HATL5 serinprotease domæne eller konditionerede medier fra

Pichia pastoris

udtrykke spaltet, aktiv HATL5 serinprotease blev analyseret. (B og C) Proteiner blev separeret ved SDS-PAGE og analyseret ved western blotting under anvendelse af anti-V5, anti-myc eller anti-HATL5 antistoffer som angivet. Baner med proteinekstrakter behandlet med deglycosylering enzymer forud for SDS-PAGE er vist (+), og ubehandlede ekstrakter (-). De sorte pilespidser angiver positionen af ​​de glycosylerede former af HATL5, og de åbne pilespidser angiver positionen af ​​de deglycosylerede former.

HATL5 er et katalytisk aktivt Protease

For at undersøge den enzymatiske egenskaber HATL5, serinproteasedomænet, herunder aktivering spaltningssted og 15 yderligere aminosyrer opstrøms spaltningsstedet, blev udtrykt i CHO-celler (fig. 2 i midten). Den HATL5 protein blev udskilt i mediet som en enkelt kæde proenzym. En lignende fremgangsmåde som tidligere anvendes til matriptase-3 førte til et udskilt protein stand til at undergå auto-aktivering som fremgik af en let stigning i elektroforetisk mobilitet og ved sin erhvervede proteolytiske aktivitet [18]. Den udskilte form af HATL5 imidlertid ikke, synes at have auto-katalytiske egenskaber, da inkubering under forskellige forskellige betingelser (buffer sammensætning, temperatur og tid) gav ikke nogen påviselig mobilitetsskift eller katalytisk aktivitet (data ikke vist). For at udtrykke HATL5 og mediere proteolytisk spaltning ved aktiveringsstedet,

Pichia pastoris

ekspressionssystem blev anvendt under anvendelse af intracellulære gær protease, KEX2. KEX2 transmembrane serinproteasen hører til subtilisin-lignende pro-protein konvertase familie med specificitet for spaltning efter parrede basiske aminosyrer og er lokaliseret i den sene Golgi rum. Ved kloning af HATL5 serinproteasedomænet i Pic9 vektoren med HATL5 aktive serinprotease domæne sekvens (

185IVNG) straks efter LGKR KEX2 spaltningsstedet kodes af vektoren, en hidtil ukendt fusion spaltningssted blev dannet (fig. 2, bottom ). Den LGKRIVNG sekvens spaltes mellem Arg (R) og Ile (I) ved KEX2, hvilket gør en secerneret aktiv HATL5 serinproteasedomæne. Ekspression af matriptase aktiv serinproteasedomænet i

Pichia pastoris

blev udført parallelt som beskrevet [19]. Tilstedeværelsen af ​​HATL5 serinprotease i konditioneret medium fra

Pichia pastoris

kloner transficeret med Pic9-HATL5 vektoren blev bekræftet ved Western blotting under anvendelse af et anti-HATL5 antistof (fig. 3A, venstre). Intet signal blev påvist i konditioneret medium fra kloner transficeret med tomme Pic9 vektoren eller Pic9-matriptase vektor. Tilsvarende anti-matriptase antistof detekteres det udskilte matriptase serinproteasedomænet i konditioneret medium fra celler transficeret med Pic9-matriptase vektor (fig. 3A, højre) og ikke fra kloner transficeret med Pic9-HATL5 ekspressionsvektor eller Pic9 vektoren uden protease insert. Den katalytiske aktivitet af HATL5 og matriptase henholdsvis blev bekræftet under anvendelse serinproteasen kromogene peptidolytisk substrat Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA (fig. 3B). Konditionerede medier fra celler transficeret med tom Pic9 vektor blev indbefattet som en negativ kontrol for at sikre fravær af forstyrrende udskilte gærproteaser.

(A) Konditionerede medier prøver fra

Pichia pastoris

kloner transficeret med enten ekspressionsvektoren uden protease insert (vektor), med HATL5 serinproteasedomænet cDNA (HATL5 # 1 og # 2) eller matriptase serinproteasedomænet cDNA blev analyseret ved western blotting under anvendelse af et anti-HATL5 antistof (venstre panel) eller et anti-matriptase antistof (højre panel). Positionerne af HATL5 (åben pilespids) og matriptase serinprotease domæne (sort pil hoved) er vist. (B) Prøver fra de konditionerede medier som beskrevet i (A) blev inkuberet ved 37 ° C i 60 minutter med det syntetiske kromogene peptid Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA (100 um), og absorbansen ved 405 nm blev registreret (C) 5 nM oprenset aktivt rekombinant HATL5 (hvide søjler) eller matriptase (sorte søjler) serinproteasedomænet blev inkuberet ved 37 ° C i 60 minutter med det syntetiske kromogene peptid MeOSuc-Glu-Val-Lys-Met-pNA (100 um ) i fravær eller nærvær (inhibitor og substrat tilsat samtidigt) af HAI-1 (60 nM), HAI-2 (40 nM), aprotinin (2 um), leupeptin (20 um), benzamidin (2 mM), eller serpinA1 (60 nM). Enzymaktiviteter for hvert enzym er afbildet i forhold til aktivitet, når ingen inhibitor blev tilsat.

Virkningen af ​​forskellige serinproteaseinhibitorer på den hydrolytiske aktivitet af det oprensede HATL5 serinproteasedomænet dybt Suc-Ala-Ala- Pro-Arg-pNA blev også analyseret, igen under anvendelse matriptase som en velkarakteriseret henvisning TTSP (fig. 3C). HATL5 aktivitet blev reduceret med de generiske molekyleinhibitorer på serinproteaser, leupeptin og benzamidin. Fuldstændig inhibering blev opnået med det globulære polypeptid, Kunitz typen serinproteaseinhibitor, aprotinin (bovin pancreatisk trypsininhibitor). Den makromolekylære Kunitz typen serinproteaseinhibitorer, hepatocytvækstfaktor aktivator inhibitor (HAI) -1 og 2, er tidligere blevet vist at inhibere flere medlemmer af TTSP familien herunder matriptase, matriptase-2, HAT, hepsin og TMPRSS13 [20] [21 ], [22] [23] [24] [25] [26] [27]. HAI-1 og HAI-2 inhiberede aktiviteten af ​​HATL5 med 50% og 75%, hhv. Desuden blev HATL5 hæmmet af et medlem af serpin superfamilien, serpinA1 (α

1-1-antitrypsin).

HATL5 er lokaliseret på celleoverfladen af ​​dyrkede celler og Stratificeret pladeepitel

Analyse af HATL5 proteinsekvensen afslørede tilstedeværelsen af ​​et enkelt transmembrandomæne, hvilket indikerer, at HATL5 proteinet, ligner tidligere karakteriserede medlemmer af TTSP familien, kan være placeret på celleoverfladen. For at undersøge den subcellulære lokalisering af HATL5 blev HEK293-celler, der udtrykker V5-mærkede fuldlængde protease analyseret ved fluorescerende immuncytokemi. Nonpermeabilized transficerede celler farvet med et primært anti-V5 antistof og et AlexaFluor 568-konjugeret sekundært antistof blev analyseret ved konfokal fluorescensmikroskopi. Transficerede HEK293-celler viste et intenst rødt fluorescerende signal, der var begrænset til plasmamembranen (fig. 4A, venstre panel). Når primære antistoffer blev substitueret med ikke-immunt IgG blev ingen påviselig farvning observeret (fig. 4A, højre panel). En lignende membran farvning blev observeret i et parallelt forsøg under anvendelse af transficerede COS-7-celler (data ikke vist).

(A) mikrografier af fluorescerende konfokal analyse viser celleoverfladeekspression i repræsentative eksempler på HEK293-celler transient transficeret med en humant fuldlængde HATL5-V5 ekspressionsplasmid. Nonpermeabilized celler blev inkuberet med et anti-V5-antistof (venstre panel) eller en kontrol ikke-immun antistof (højre panel), efterfulgt af inkubation med AlexaFluor 568-mærkede sekundære antistoffer og Hoechst farvning at visualisere cellekerner (blå, begge paneler). Cellerne blev visualiseret ved konfokal fluorescensmikroskopi ved 543 nm (AlexaFluor 568) og 405 nm excitationsbølgelængder (Hoechst). Flettede billeder opnået ved de to excitationsbølgelængder er vist. Målestokbjælkerne er 100 pm. (B) Ekspression af HATL5 (øvre panel) eller GAPDH (nederste panel) meddelelse ved RT-PCR-analyse af mRNA ekstraheret fra hele museorganer. (C) Immunohistokemisk analyse af HATL5 ekspression i normale humane væv. HATL5 protein blev påvist med et kanin-anti HATL5 antistof i esophageal musoca (C1, D1), cervikal mucosa (E), mundslimhinden (tunge) (F) og strubelåget (del af supraglottisk strubehovedet) (G). Primære antistoffer blev substitueret med ikke-immunt kanin-IgG i serielle sektioner af alle prøver og blev ikke observeret nogen signifikant farvning (pilespidser i C2, D2 og ikke vist). Stærk epithelial-farvning (pilespidser) detekteres i apikale, pladeepitelceller i normal esophagus (C1, D1), normal livmoderhals (E), og tunge (F) uden signifikant farvning i mesenkymale rum (angivet med stjerner). Ved stor forstørrelse, er HATL5 proteinet tydeligt lokaliseret på celleoverfladen af ​​apikale epithelceller (pilehoved i D1). I strubelåget (G) farvning iagttages i pladecellekræft suprabasale epitelceller foruden apikale celler. Epi = normalt epitel. Størrelse barer alle paneler; 50 um.

For at bestemme ekspressionen af ​​HATL5 i væv, blev RT-PCR-analyse udført på totalt RNA ekstraheret fra en række af voksne musevæv (Fig. 4B). Denne analyse viste, at HATL5 viser en relativt begrænset væv udtryk profil, med mRNA påvist i 4 ud af de 19 analyserede væv: spiserør, livmoderhals, tungemål og testikler. Et fælles træk mellem spiserøret, cervix, og tungen er, at mucosale foringer af disse væv indeholder alle stratificeret pladeepitel. Det fik os til at undersøge fordelingen og cellulære lokalisering af HATL5 protein i disse væv ved immunhistokemi (IHC). Repræsentative sektioner af normal esophageal, livmoderhalskræft, og hoved og hals (tunge og strubelåget) slimhinde er vist i figur 4C. Brug af serielle snit blev objektglassene probet med et kanin-anti-HATL5 protein eller anvendt som negative kontroller, hvor det primære antistof blev substitueret med ikke-immunt kanin-IgG (fig. 4C og data ikke vist). I alle tre vævstyper detekteres en stærk epitelial farvning i de apikale pladeepitelceller uden signifikant farvning i de submukøse eller mesenchymal rum. HATL5 protein er primært lokaliseret på celleoverfladerne af de større pladeepitelceller. Denne celle overflade lokalisering er i overensstemmelse med den forventede fordeling af den forudsagte membran forankret topologi HATL5.