PLoS ONE: LEDGF /p75 Overekspression Dæmper oxidativ stress-induceret nekrose og opregulerer oxidoreductasen ERP57 /PDIA3 /GRP58 i Prostata Cancer

Abstrakt

Prostatakræft (PCA) dødelighed er drevet af meget aggressive tumorer karakteriseret ved metastaser og resistens over for behandling, og denne aggressivitet medieres af en række faktorer, herunder aktivering af stress overlevelse veje i proinflammatoriske tumormikromiljøet. LEDGF /p75, også kendt som DFS70 autoantigenet, er en stress transskription co-aktivator impliceret i cancer, HIV-AIDS, og autoimmunitet. Dette protein er målrettet efter autoantistoffer i visse undergrupper af patienter med PCa og inflammatoriske tilstande, såvel som i nogle tilsyneladende raske individer. LEDGF /p75 overudtrykkes i PCa og andre kræftformer, og fremmer resistens mod kemoterapi-induceret celledød via transaktivering af overlevelse proteiner. Vi rapporterer i denne undersøgelse, at overekspression af LEDGF /p75 i PCA celler dæmper oxidativ stress-induceret nekrose, men ikke staurosporin-induceret apoptose. Dette fund var konsistent med den iagttagelse, at mens LEDGF /p75 håndfast blev spaltet i apoptotiske celler i en p65-fragment, som mangler stress overlevelse aktivitet, var det forholdsvis intakt i nekrotiske celler. Overekspression af LEDGF /p75 i PCA-celler førte til opregulering af transkript og proteinniveauer af thiol-oxidoreductase ERp57 (også kendt som GRP58 og PDIA3), hvorimod dets udtømning førte til ERp57 transkript nedregulering. Chromatin immunpræcipitation og transkription reporter assays viste LEDGF /p75-binding til og transaktivere ERp57 promotoren henholdsvis. Immunohistokemisk analyse afslørede signifikant forhøjet co-ekspression af disse to proteiner i kliniske prostata tumorvæv. Vores resultater antyder, at LEDGF /p75 ikke er en inhibitor af apoptose, men snarere en antagonist for oxidativ stress-induceret nekrose, og at dets overekspression i PCa fører til ERp57 opregulering. Disse resultater er af betydning at afklare rolle LEDGF /p75 stress overlevelse vej i PCa

Henvisning:. Basu A, Cajigas-Du Ross CK, Rios-Colon L, Mediavilla-Varela M, Daniels-Wells TR, Leoh LS, et al. (2016) LEDGF /p75 Overekspression Dæmper oxidativ stress-induceret nekrose og opregulerer oxidoreductasen ERP57 /PDIA3 /GRP58 i prostatakræft. PLoS ONE 11 (1): e0146549. doi: 10,1371 /journal.pone.0146549

Redaktør: Mohammad Saleem, Hormel Institute, University of Minnesota, UNITED STATES

Modtaget: September 8, 2015; Accepteret: December 19, 2015; Udgivet: 15 januar 2016

Copyright: © 2016 Basu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud 5R25GM060507, 5P20MD001632 og 5P20MD006988, og ved Loma Linda University School of Medicine center for Sundhed forskelle og Molekylær Medicin. CKCD, MMV, LRC og SRM blev støttet af graduate uddannelsesstipendier under tilskud R25GM060507. SAM blev understøttet af en medicinsk forskeruddannelse praktik under tilskud 5P20MD006988. HB er ansat af en kommerciel virksomhed-Novartis Pharmaceutical Oncology. De finansieringskilder (NIH, Novartis) ydet støtte i form af løn til forfattere (CAC, CKCD, MMV, LRC, SRM, SAM, HB), men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling af data og analyse, beslutning at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i afsnittet “forfatter bidrag”

Konkurrerende interesser:. En af forfatterne, HB, er ansat af en kommerciel virksomhed-Novartis Pharmaceutical Oncology. Novartis ydet støtte i form af løn til HB, men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Denne kommercielle tilhørsforhold ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den næststørste årsag til kræftdødsfald blandt mænd i USA, påvirker uforholdsmæssigt African American mænd i forhold til andre racemæssige /etniske grupper [1]. PCa initiering og progression er blevet forbundet med kronisk inflammation og øget oxidativ skade i denne kirtel [2,3]. Som en mekanisme af overlevelse i denne stressende miljø, PCA-celler aktiverer stress overlevelse veje, der fremmer tumor aggressive egenskaber, herunder resistens over for celledød og kemoterapi [4-6]. Lens epitel-afledt vækstfaktor på 75 kD (LEDGF /p75) er en ny oncoprotein der fremmer pattedyr celle overlevelse i tilstedeværelsen af ​​miljømæssige stressfaktorer, der øger cellulære oxidativ skade [7-14]. Også kendt som transskription co-aktivator p75, PC4 og SFRS1 interagerende protein (PSIP1), og tætte fine spættede autoantigen på 70 kD (DFS70), er dette multifunktionelle protein opnået relevans i studiet af cancer, HIV-AIDS, autoimmunitet og øjen- sygdom (revideret i ref. [9,10]). Som den centrale cellulære co-faktor for HIV integration i vært chromatin har LEDGF /p75 vakt betydelig opmærksomhed i det seneste årti, og energisk indsats er i øjeblikket i gang for at målrette dette protein til behandling af HIV-AIDS [15].

Den nye rolle LEDGF /p75 som en stress oncoprotein er blevet afsløret af flere undersøgelser fra vores gruppe og andre, der dokumenterer dens overekspression i menneskets forskellige typer kræft, og dens evne til at fremkalde træk forbundet med tumor aggressivitet i cancerceller [10 -14,16-19]. Desuden er LEDGF /p75 udtrykkes afvigende i humane leukæmier, og interagerer med Menin-MLL (mixed leukæmi afstamning) transkriptionskomplekset at aktivere ekspressionen af ​​cancerassocierede gener og leukemogenesis [20,21]. Potentialet i LEDGF /p75 som et lovende mål for kræftbehandling er blevet fremhævet af undersøgelser, der viser, at dets hæmning eller nedregulering dæmper de aggressive egenskaber kræftceller [14,17,19,21,22].

Vores gruppe og andre viste tidligere, at LEDGF /p75 er målet for et autoantistof respons i en delmængde af PCA patienter, såvel som i tilsyneladende raske personer og patienter med forskellige kroniske inflammatoriske tilstande ([23], også anmeldt i ref. [9, 10]). Vi rapporterede også, at LEDGF /p75 er overudtrykt i prostata tumorer og at denne overekspression fremmer PCa celle modstand mod caspase-uafhængig lysosomale celledød induceret af taxan stof docetaxel (DTX), den gyldne standard for PCa kemoterapi [11,13,23] . Interessant, LEDGF /p75 opregulering forekommer naturligt i udvælgelsen af ​​DTX-resistente PCA celler [24]. I konkordans med disse observationer, viste flere undersøgelser, at LEDGF /p75 overekspression i cancerceller fremmer resistens over for lægemidler, der inducerer oxidative DNA-skader og lysosomal celledød [12-14,18,25], fører en gruppe til at henvise til dette protein som en “vogter lysosomal stabilitet i human cancer” [14]. Stress beskyttende funktioner LEDGF /p75 synes at være medieret af dets evne til at deltage i DNA-reparation og transskriptionelt aktiverer stress overlevelse proteiner, såsom varmechokprotein 27 (Hsp27), peroxiredoxin 6 (PRDX6) og vaskulær endotelvækstfaktor C (VEGF C) [18,26-30].

Vi observerede tidligere at LEDGF /p75 overekspression i PCA celler ikke beskytte mod caspase-afhængig apoptose udløst af TRAIL (tumornekrosefaktor apoptoseinducerende ligand), et velkarakteriseret inducer af dødsreceptoren apoptotiske vej [13]. TRAIL, staurosporin (STS), og andre induktorer af apoptose fører til caspase-3-medieret spaltning af LEDGF /p75 i en fremtrædende p65 fragment, der mangler pro-overlevelse aktivitet og forbedrer celledød under stressbetingelser [22,23,30]. Endvidere caspase-3-medieret spaltning af LEDGF /p52, den korte alternativ splejsningsvariant af LEDGF /p75, genererer et p35-fragment, som ophæver den transkriptionelle aktivitet af LEDGF /p75 [30].

grund af sin spaltning og inaktivering under apoptose, kan LEDGF /p75 ikke fungere som en klassisk inhibitor af apoptose, men snarere som en opstrøms beskytter af DNA og lysosomale integritet under en augmented tilstand af cellulær oxidativ stress. Derfor fokuserede vi denne undersøgelse på at undersøge muligheden for LEDGF /p75 at beskytte PCA celler mod oxidativt stress-induceret nekrose, og bidrage til opregulering af endoplasmatisk reticulum protein af 57 kD (ERp57) i PSA. ERp57, også kendt som glucose reguleret protein af 58 kD (GRP58) og disulfidisomeraseproteinet familie Et medlem 3 (PDIA3), er en multi-funktionel thiol-oxidoreductase og en chaperone protein ansvarlig for at opretholde passende foldning af nyligt syntetiserede glycoproteiner [31 , 32]. Vores resultater viser, at LEDGF /p75-overekspression dæmper oxidativ stress-induceret nekrotisk celledød og bidrager til ERp57 opregulering i forbindelse med PSA.

Materialer og metoder Salg

Undersøgelserne med humane antistoffer, cancercelle linjer, og prostata væv blev udført under godkendelsen af ​​Loma Linda University Board Institutional Review.

cellelinjer, Antistoffer og reagenser

metastatisk prostatacancer cellelinjer DU145 (kat. # HTB -81) og PC3 (kat. # CRL-1435), K-ras transformerede prostata epitelial cellelinje RWPE-2 (kat. # CRL-11610), afledt fra den normale prostata-cellelinien RWPE-1, og osteosarcomcellelinie line U2OS (Kat. # HTB-96) blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC). Celler blev dyrket som anbefalet af leverandørerne i en fugtig inkubator med 5% CO

2 ved 37 ° C. Følgende antistoffer blev anvendt: mus monoklonale anti-β-actin (1: 5000, Sigma-Aldrich) og anti-ERp57 (1: 200, Enzo Life Sciences); kanin polyklonalt anti-LEDGF /p75 (1: 1000, Bethyl laboratorier Inc); gede polyklonalt anti-Lamin B antistof C-20 (1: 1000 Santa Cruz Biotechnology.); humant autoantistof til topoisomerase I (1: 100, Topo I), en venlig gave fra Dr. Eng M Tan (Scripps Research Institute, La Jolla, CA); anti-LEDGF /p75 polyklonalt kaninantistof Scripps-Ab5087 (1: 1000), også doneret af Dr. Eng M. Tan; og peberrodsperoxidase (HRP) -mærket sekundært IgG-antistoffer (1: 5000, ThermoFisher Scientific). Tert-butyl hydrogenperoxid (TBHP), et organisk peroxid, blev købt fra Sigma-Aldrich. STS og N-acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-methylcoumarin (Ac-DEVD-AMC, fluorogene caspase-3/7 substrat) blev indkøbt fra Axxora. Den brede caspaseinhibitor benzylocarbonyl-Val-Ala-Asp-fluormethyl keton (z-VAD-FMK) blev købt fra Biomol International.

Cell Død og levedygtighed Analyser

Celledød blev induceret ved behandling med cytostatika TBHP (50, 75, 100, og 150 uM) eller STS (4 uM) i op til 24 timer. I nogle eksperimenter blev celler præinkuberet med 100 uM z-VAD-fmk i 1 time før udsættelse for disse midler. Cell morfologi blev visualiseret på et Olympus IX70 mikroskop udstyret med Hoffmann Modulation Contrast (Olympus amerikansk) og en digital Spot Imaging System (Diagnostiske Instrumenter). For at bestemme cellelevedygtighed, celler podet i 96-brønds plader (3 x 10

4 celler per brønd) blev behandlet med TBHP eller STS, vasket med phosphatbufret saltvand (PBS), og fikseret i 4% paraformaldehyd i 1 time ved 4 ° C. Celler blev derefter vasket tre gange med destilleret vand, og Accustain Crystal Violet opløsning (Sigma-Aldrich) (1: 4) blev tilsat til hver brønd efterfulgt af inkubation i 20 minutter ved stuetemperatur. Celler blev vasket med destilleret vand for at fjerne overskydende farve og derefter tørret ved stuetemperatur. Eddikesyre (10% v /v) blev tilsat til hver brønd i 10 minutter og absorbansen blev målt ved 570 nanometer (nm) under anvendelse af en μQuant mikropladelæser (Bio-Tek Instruments).

DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol) farvning blev anvendt til at visualisere kondenseret eller fragmenteret kromatin i celler behandlet med TBHP eller STS. Kort beskrevet blev celler podet (3 x 10

4) i 8 brønde Lab-Tek

® Permanox

® kammerskiver (ThermoFisher Scientific), behandlede efter 24 timer med de forskellige cytotoksiske midler, vaskes med PBS og derefter fikseret og permeabiliseret med methanol /acetone-opløsning (3: 1 v /v) i 10 minutter ved -20 ° C. Fastsættelsen opløsning blev fjernet, og objektglassene blev inkuberet ved stuetemperatur i 5-10 minutter til tørring. Dækglas blev monteret under anvendelse af Vectashield mounting medium indeholdende DAPI (Vector Laboratories). DAPI-farvning blev visualiseret under anvendelse og Olympus BX50 fluorescensmikroskop og billeder blev opnået med et Spot Imaging System (Diagnostic Instruments).

caspaseaktivitet assays blev udført som tidligere beskrevet [30]. Kort beskrevet blev celler podet i sorte, klare bund plader med 96 brønde (3 x 10

4 celler per brønd). Ved afslutningen af ​​behandlingen med TBHP eller STS blev celler inkuberet med 50 pi 3X caspase puffer [150 mM HEPES pH 7,4, 450 mM natriumchlorid, 150 mM kaliumchlorid, 30 mM magnesiumchlorid, 1,2 mM ethylenglycol-bis (2 -aminoethylether) –

N

,

N

,

N ‘

,

N’

-tetraeddikesyre (EGTA), 30% saccharose, 10% CHAPS og 1,5% NP-40], i nærværelse af 30 mM dithiothreitol (DTT), 3 mM phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF), og 75 uM af det fluorogene peptidsubstratet Ac-DEVD-AMC (caspase-3/7) til 2 timer ved 37 ° C. Dette blev efterfulgt af inkubation af cellerne ved stuetemperatur i 12 timer, og måling af absorbansen ved excitation af 360 nm og emission på 460 nm i en FLX800 Microplate Fluorescerende Reader (Bio-Tek Instruments). Fold aktivitet blev bestemt ved at normalisere til en absorbansværdierne for ubehandlede, kontrol celler.

Måling af Reactive Oxygen Species

generation af reaktive ilt arter (ROS) blev vurderet på grundlag af den intracellulære oxidation af 2 ‘, 7′-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA, Invitrogen) til dannelse af fluorescerende forbindelse 2′, 7’-dicholorofluorescein (DCF). Celler blev podet i en 6-brønds plade med en tæthed på 3 x 10

4 celler per brønd, dyrket i 24 timer og derefter behandlet med TBHP eller STS i op til 12 timer. DCFH-DA (0,5 uM) blev derefter tilsat til cellerne, efterfulgt af inkubation i 20 minutter ved 37 ° C. Celler blev vasket med PBS og derefter resuspenderet i 0,5 ml PBS. Fluorescensintensitet blev bestemt ved flowcytometri under anvendelse af et FACScalibur cytometer (BD Biosciences).

Kvantitativ realtids-PCR

Kvantitativ realtids-PCR (qPCR) blev udført som tidligere beskrevet [24]. Kort beskrevet blev totalt RNA ekstraheret fra celler under anvendelse af RNeasy plus mini kit (Qiagen). RNA (0,5 ug) blev revers trancribed til cDNA under anvendelse iScript cDNA syntesekit (BioRad). qPCR blev udført på den MyiQ real-time PCR detection system med primere under anvendelse iQ SYBR Green Supermix (BioRad) ifølge producentens anbefalinger. Primer sekvenser for LEDGF /p75 og ERp57 blev designet ved hjælp af Primer3 software og kommercielt syntetiseret af Integrated DNA Technologies (IDT) (tabel 1). Mål-mRNA-værdier blev normaliseret under anvendelse af glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) mRNA og data blev udtrykt i forhold til normaliserede værdier af tilsvarende kontroller. Prøverne blev analyseret i tre uafhængige forsøg, hver i tre eksemplarer.

Generation of PCA celler med stabil overekspression eller udtømning af LEDGF /p75

LEDGF /p75 cDNA er tidligere klonet i vores laboratorium ind i den mammale ekspressionsplasmid pcDNA3.1 (Invitrogen) [22]. Kort beskrevet både pcDNA3.1 tom vektor og pcDNA3.1-

ledgf /p75 Salg plasmider blev transficeret ind RWPE-2 og PC3-celler ved anvendelse af Fugene 6 (Roche) metode. Otteogfyrre timer efter transfektion blev cellerne trypsiniseret og podet i plader med 6 brønde. Selektion af stabile transfektanter blev opnået ved tilsætning af G418 (330μg /ml) (ThermoFisher Scientific) til cellekulturerne. Overlevende kolonier udvidet og ekspression af LEDGF /p75 i celler stabilt transficeret med tom vektor eller pcDNA3.1-

ledgf /p75

blev bekræftet af qPCR og immunblotting.

PC3 celler med stabil overekspression eller udtømning af LEDGFp75 bruger virale vektorer var generøse gaver fra professorerne Zeger Debyser og Rik Gijsbers (Katholieke Universiteit Leuven, Belgien). Overudtrykker PC3-celler blev dannet ved at transducere dem med retrovirale vektorer, der koder fuld-længde LEDGF /p75 cDNA som beskrevet tidligere [24,33] PC3-celler med stabil udtømning af LEDGFp75 blev dannet ved anvendelse intensiveret lentiviral vektor-baseret RNA-interferens som tidligere beskrevet [34] . Kort fortalt blev kort hårnål (sh) anvendte RNA til stabilt Knockdown LEDGFp75 mens shSCR tjente som ikke-interfererende shRNA kontrol. Transducerede celler blev selekteret med zeocin (200 pg /ml) og LEDGF /p75-overekspression eller udtynding i udvalgte kloner blev bestemt ved qPCR og immunblotting.

RNA-interferens-medieret knockdown af LEDGF /p75 i PCA-celler

Transient knockdown af LEDGF /p75 i PCA-celler blev opnået ved levering af specifikke korte inhibitoriske RNA’er (siRNA’er) i celler under anvendelse af Oligofectamine fremgangsmåden (Invitrogen, Life Technologies) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev LEDGF /p75 siRNA (siLEDGF /p75) og en forvrænget siRNA duplex (siSD, negativ kontrol) udformet som tidligere [24] beskrevet og syntetiseret af IDT. Den siLEDGF /p75-sekvensen svarede til nucleotiderne 1340-1360 (5’AGACAGCAUGAGGAAGCGAdTdT-3 ‘) i forhold til det første nukleotid i startkodonen af ​​LEDGF /p75 åben læseramme. Denne sekvens svarer til en region i C-terminalen af ​​LEDGF /p75, der ikke deles af dens korte alternativ splejsningsvariant LEDGF /P52. Rækkefølgen for siSD var 5’GCGCGCUUUGUAGGAUUCGdTdT-3 ‘. Celler blev transficeret med 40 nM siRNAs og dyrket i 72 timer før analyse.

Docetaxel-Resistant PCA Celler

Docetaxel (DTX) resistent PC3 (PC3-DR) og DU145 (DU145-DR ) cellelinjer blev udviklet ved dyrkning PC3 og DU145 celler i nærvær af DTX på en dosis-eskalering måde [35]. Celler, der overlevede den oprindelige kultur i 1 nM DTX blev passeret 4 gange før forøgelse af koncentrationen af ​​DTX til 5,5 nM, og derefter til 11 nM. Resistente celler blev opretholdt kontinuerligt i 11 nM DTX.

immunblotting Analyse

Immunoblotting blev udført i det væsentlige som beskrevet tidligere [24]. Kort fortalt blev proteiner i hel-cellelysater fra PCA-celler separeret ved SDS-PAGE (NuPAGE 4-12%, ThermoFisher Scientific) efterfulgt af overførsel til polyvinyldifluorid (PVDF) membraner (Millipore). Membraner blev blokeret med 5% tørmælk opløsning fremstillet i TBS-T-buffer (20 mM Tris-HCI, pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,1% Tween 20) og probes med primære antistoffer. Efter adskillige vaske med TBS-T, blev membranerne inkuberet med passende peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundære antistoffer og vaskes igen flere gange med TBS-T. Protein bånd blev påvist ved forøget kemiluminescens (ThermoFisher Scientific Pierce).

Kinetworks ™ Stress /Heat Shock Protein Screen

Kinetworks ™ Stress /Heat Shock Protein Screen (Kinexus Bioinformatik Corporation) blev anvendt til kvantificere og sammenligne ekspressionsniveauerne af 25 forskellige stress- og varmechokproteiner i immunblots af hele cellelysater fra RWPE-2-celler stabilt overudtrykker LEDGF /p75 og kontrolceller stabilt transficeret med tom pcDNA-vektoren. Denne platform var et antistof-baserede vifte tjeneste til samtidig screening af flere stress proteiner i cellelysater, der var kommercielt tilgængelige på det tidspunkt, vi indledte denne undersøgelse. Cellelysater blev probet ved immunoblotting mod en spændings /varmechokprotein antistofpanel [36]. Immunoblotting procedurer og kvantificering af individuel stress protein immunoreaktivitet blev udført af Kinexus.

Luciferase-baserede Transskription Reporter Analyser

ERp57 promotor (

ERp57pr

) luciferase-baserede transskription reporter analyser blev udført som tidligere beskrevet [30]. Kort fortalt RWPE-2, PC3 og DU145-celler blev co-transficeret med ekspressionsvektoren kodende LEDGF /p75 (pcDNA3.1-

ledgf /p75

) eller tom vektor (pcDNA3.1), og reporter vektor (pLightSwitch tom vektor eller pLightSwitch-

ERp57pr

) (MNS Genomics /Active Motif). Ved 48 timer efter transfektion blev celler lyseret og luciferaseassays blev udført ved anvendelse af LightSwitch luciferaseassayreagens (koblingsudstyr Genomics /aktiv Motif). U2OS celler blev transficeret med en anden LEDGF /p75-ekspressionsvektor, pCruzHA-

ledgf /p75

eller tomme pCruzHA, og luciferase assay i disse celler blev udført ved anvendelse af Luciferase Assay System fra Promega. Relative lysenheder blev opnået i et MicroLumatPlus Lb 96V luminometer (Berthold Tech), og luciferase værdier blev normaliseret til proteinkoncentration på lysater fra celler co-transficeret med tomme vektorer og pLightSwitch-

ERp57pr

. Studerendes

t

-test analyse blev udført ved hjælp af Microsoft Excel. Forsøg blev gentaget mindst tre gange in triplo.

Chromatin immunopræcipitationsanalyser Salg

Disse assays blev udført i det væsentlige som tidligere [37] beskrevne. Kort fortalt blev PC3 og U2OS celler fikseret i 1% formaldehyd i 10 minutter og underkastet chromatin immunoprecipitation (chip) under anvendelse af chippen-IT Express Enzymatisk kit (Active Motif). Anti-LEDGF /p75-antistoffer (A300-848A, Bethyl) blev anvendt til at immunpræcipitere protein-chromatin komplekser. Immunpræcipiteret kromatin blev derefter enzymatisk spaltet. PCR blev udført under anvendelse af specifikke primere til at amplificere ERp57 promotoren (Tabel 1). Både ikke-specifik immunoglobulin G (IgG) antistof og input chromatin blev anvendt som kontroller.

immunhistokemisk (IHC) Analyse af prostatacancer Tissue Microarrays Salg

Humant PCA væv microarrays (TMAs), kommercielt tilgængelig fra Novus Biologicals og US Biomax Inc. blev anvendt til IHC-analyse af LEDGF /p75 og ERp57. Tre forskellige PCa TMA’er (to fra US Biomax Inc. og en fra Novus Biologicals) blev anvendt til at øge stikprøvestørrelsen. Kort fortalt vi købte fra US Biomax den PR807 og PR807a TMAs, hver indeholdende enkelte kerner af 3 sygdomsfrie væv sager normale, 7 normale sager tilstødende væv, og 50 PCA væv sager. Vi bruges også IMH-303 TMA (Novus Biologicals), som indeholder 40 PCA væv kerner og 9 matchede normale tilstødende væv. Producenterne af disse TMA’er leveres kun begrænset grundlæggende klinisk-patologisk oplysninger (alder, køn, tumor stadie i nogle tilfælde), der svarer til de væv kerner, uden patientens identifikatorer. Der forelå ingen oplysninger om patientens race eller etnisk oprindelse, behandling type, institutioner, der indsamlede væv, opfølgning rutiner, og håndteringsteknikker væv. De begrænsede patient opfølgende data knyttet til TMA’er forhindrede os i at udføre en Kaplan-Meier overlevelsesanalyse og anden klinisk sammenhæng analyser.

TMA’er blev farvet ved hjælp af en Biogene i6000 auto-farvningsværktøjet (Biogenex Corporation) som tidligere beskrevet [11]. Kort fortalt blev paraffinindlejrede vævssnit i TMA lysbilleder afparaffiniseret og objektglassene blev underkastet antigen-genvinding. Endogen peroxidaseaktivitet blev standset ved behandling med 3% hydrogenperoxid i 10% methanol, og Power Block

© universel blokerende reagens (Biogenex Corp.) blev anvendt til at blokere ikke-specifik proteinbinding. IHC-farvning af LEDGF /p75 blev udført under anvendelse Scripps-Ab5087 kanin polyklonale antistof, som er specifikt for LEDGF /p75 og ikke reagerer med den korte LEDGF /p52 splejsningsvariant [11]. IHC farvning af ERp57 blev udført ved hjælp af musen monoklonalt anti-ERp57 (Enzo Life Sciences). TMA objektglas blev inkuberet natten over med primære antistoffer, vasket og derefter inkuberet med Multi-link

© biotinyleret sekundært antistof (Biogenex Corp.), efterfulgt af inkubation med streptavidin-koblet peroxidase supersensitive Label

© (Biogenex Corp.). Immunfarvning blev påvist ved peroxidase aktivering af 3-amino-9-ethycarbazole (AEC) chromagen (Biocare Medical). TMA’erne blev modfarvet let med hematoxylin (Sigma) og monteret med Permount (ThermoFisher Scientific). For den negative kontrolprøve, blev det primære antistof udeladt og substitueret med kanin eller mus præ-immunserum. Vævssnit blev undersøgt under et Olympus BX50 mikroskop, og billeder blev erhvervet ved hjælp af en digital Spot RT3

TM kamera (Diagnostiske Instrumenter).

immunfarvet TMA’er blev scoret blindt for LEDGF /p75 immunoreaktivitet af en bestyrelse certificeret patolog (HR). En 4-tier pointsystem (0 = negativ, 1 = svag, 2 = moderat, 3 = stærk) blev anvendt til at evaluere farvningsintensitet. Væv med snesevis af 0-1 blev anset for at have lav intensitet farvning, mens væv med snesevis af 2-3 blev anset for at have høj intensitet farvning. Vævsprøver, der viste dårlig kvalitet blev udelukket fra analyserne. Disse undersøgelser blev udført under godkendelse fra Institutional Review Board

Statistisk analyse af IHC-data og deres forhold til patienternes kliniske resultater blev gjort ved hjælp af SAS-software-pakke. (Version 9.2, SAS Institute). For at lette statistisk analyse blev vævsprøver grupperet i to kategorier baseret på deres scores. “Lav” farvning blev bestemt som puljede farvning intensitet score på 0 og 1, mens “høj” farvning havde samlet score på 2 og 3. Sammenhæng mellem ekspressionsniveauer af LEDGF /p75 og ERp57 i tumor og kontrol (sygdomsfri normal + normal tilstødende ) væv blev bestemt under anvendelse Chi-square test. Sandsynlighed værdier under 0,05 blev anset for signifikante.

Resultater

LEDGF /p75 overekspression dæmper oxidativ stress-induceret nekrose, men ikke staurosporin-induceret apoptose i PCA celler

TBHP, en mere stabil homolog af hydrogenperoxid, der er almindeligt anvendt i modeller for oxidativ stress-induceret nekrose [38-40], og de apoptoseinducer STS blev udsat for PCA-celler for at aktivere nekrotisk og apoptotisk celledød, hhv. Begge midler reducerede cellelevedygtighed i RWPE-2 prostata-cellelinien (Fig 1A). Men mens STS-behandlede celler præsenterede de klassiske apoptotiske kendetegnende kendetegnet ved blebbing og chromatinkondensation og fragmentering, TBHP-behandlede celler udviste den typiske nekrotiske morfologi karakteriseret ved cytoplasmisk hævelse og kondenserede kerner uden kromatin fragmentering (Fig 1B og 1C). Behandling med STS førte til en tidsafhængig stigning i caspase-3-aktivitet, i overensstemmelse med apoptose induktion, hvorimod behandling med TBHP ikke førte til caspase-3-aktivering (Fig 1D). Lamin B, en klassisk caspase-3 substrat, blev spaltet i sin underskrift apoptotisk fragment af 45 kD under STS-induceret apoptose men ikke under TBHP-induceret celledød (Fig 1E), i overensstemmelse med vores tidligere observation, at dette protein ikke spaltes under nekrotisk celledød [41]. Tilsammen disse resultater var i overensstemmelse med foreliggende dokumentation, at TBHP er en stærk udløsende faktor for oxidativ stress-induceret nekrotisk celledød [38-40].

A. RWPE-2-celler blev behandlet med 100 pM TBHP eller 4 uM STS at inducere nekrose eller apoptose, henholdsvis. Cellelevedygtighed blev vurderet ved krystalviolet assay. B. Ændringer i cellulær morfologi er forbundet med nekrose eller apoptose i RWPE-2-celler behandlet med TBHP eller STS henholdsvis i 24 timer. C. Nuclear morfologi RWPE-2-celler (behandles som i panel B) visualiseret ved DAPI farvning. D. Caspase 3 aktivitet blev målt efter behandling med TBHP eller STS. E. Spaltning af Lamin B i sin underskrift apoptotisk 45 kD-fragment blev detekteret ved immunoblotting i RWPE-2-celler behandlet med STS men ikke i TBHP-behandlede celler. Linjer angiver bånd svarende til intakte proteiner og pilen peger på spaltningen fragment. F. Immunoblot viser stabil overekspression af LEDGF /p75 i RWPE-2-

ledgf /p75

kloner i forhold til RWPE-2

Vec

(tom pcDNA3.1 vektor) kloner og utransficerede RWPE- 2-celler. G. Crystal violet levedygtighed assay viser, at overekspression af LEDGF /p75 i RWPE-2 celler fremmer modstand mod celledød induceret af TBHP men ikke STS. Hver graf viser gennemsnittet af mindst 3 uafhængige forsøg udført i tre eksemplarer (*

P. 0

05)

.

P

værdier blev bestemt i forhold til at styre ved hjælp af Students

t

-test. Dataene repræsenterer gennemsnittet af mindst uafhængige forsøg.

For at afgøre, om LEDGF /p75 antagoniserer TBHP-induceret nekrose, vi genererede RWPE-2 celler stabilt overekspression dette protein (figur 1F). Disse celler udviste en signifikant svækkelse af TBHP-induceret nekrotisk celledød sammenlignet med celler stabilt transficeret med den tomme pcDNA3.1-vektoren (fig 1G). Som forventet havde LEDGF /p75-overekspression ikke svække STS-induceret apoptose (fig 1G), sandsynligvis på grund af dets spaltning med caspaser [22,23,30].

Vi reproduceres og udvidet disse resultater i knoglen metastatiske PCA celler, PC3. Svarende til vores observationer i RWPE-2-celler, behandling af PC3-celler med enten STS eller TBHP reducerede cellelevedygtighed på en tidsafhængig måde (Figur 2A). Som forventet, zVAD-fmk, en bred inhibitor af caspaser svækkede STS-induceret apoptose men havde ingen inhiberende virkninger på TBHP-induceret nekrose (figur 2A). Selvom zVAD-FMK betydeligt svækket STS-medieret apoptose, var det ikke helt hæmme celledød som tiden skred frem (Fig 2A), i overensstemmelse med tidligere observationer, STS inducerer caspase-uafhængig celledød eller necroptosis under caspase-kompromitteret forhold i visse cellelinjer [ ,,,0],42,43]. I overensstemmelse med vores observationer i RWPE-2 celler, STS-behandlede PC3 celler udviste den karakteristiske blebbing og omfattende chromatinkondensation og fragmentering i forbindelse med apoptose, hvorimod TBHP-behandlede celler udviste cytoplasmatisk hævelse uden nuklear fragmentering (Fig 2B og 2C). Som forventet, behandling med STS, men ikke med TBHP, førte til caspase-3-aktivering (Fig 2D).

A. PC3-celler blev behandlet med 100 pM TBHP eller 4 uM STS at inducere nekrotisk eller apoptotisk celledød, henholdsvis i nærvær og fravær af den brede caspaseinhibitor zVAD-fmk. Cellelevedygtighed blev vurderet ved 6, 12, 24 timer efter behandling, og ved 6 h behandling plus 18 timer recovery. B. Ændringer i cellulær morfologi er forbundet med nekrose eller apoptose i PC3-celler behandlet med TBHP og STS, henholdsvis i 24 timer. C. Nuclear morfologi PC3-celler visualiseret ved DAPI-farvning. D. Caspase 3 aktivitet blev målt efter behandling med TBHP eller STS. E. Spaltning af Topo I i sin underskrift apoptotisk (70 kD) og nekrotisk (70 kD og 45 kD) fragmenter blev påvist ved immunoblotting i PC3-celler behandlet med STS eller TBHP henholdsvis (øvre panel). Spaltning af LEDGF /p75 i sin underskrift apoptotisk fragment (65 kD) blev påvist i celler behandlet med STS, men ikke i celler behandlet med TBHP (nederste panel). p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol.