PLoS ONE: Undersøgelse af polymorfier i Hypoxi Pathway Gener i relation til Outcome i kolorektal cancer

Abstrakt

Introduktion

Tyktarmskræft er en fælles malignitet. Identifikation af genetiske prognostiske markører kan hjælpe prognostiske skøn i kolorektal cancer. Gener der regulerer respons på hypoxi og andre gener, der reguleres af de hypoxiske betingelser er blevet vist at spille roller i udviklingen af ​​kræft. I denne undersøgelse, vi hypotese, at genetiske variationer i hypoxi syntesevejsgener var forbundet med risiko for resultat i kolorektal cancer patienter.

Metoder

Denne undersøgelse blev udført i to faser. I den første fase, 49 SNPs fra seks hypoxi pathway gener (

HIF1A

,

HIF1B

,

HIF2A

,

LOX

,

MIF

og

CXCL12

) i 272 patienter med tarmkræft blev analyseret. I anden fase, 77 SNPs fra syv hypoxi pathway gener (

HIF1A

,

HIF1B

,

HIF2A

,

HIF2B

,

HIF3A

,

LOX

CXCL12

) blev analyseret i en ekstra kohorte af 535 patienter. Kaplan Meier, Cox univariate og multivariable regressionsanalyser blev udført for at analysere forholdet mellem SNP’er og samlet overlevelse (OS), sygdomsfri overlevelse (DFS) eller sygdomsspecifikke overlevelse (DSS). Da dette var en hypotese-genererende studie blev der ikke korrektion for multiple test anvendt.

Resultater

I fase I, (

HIF2A

rs11125070) blev fundet en SNP at være forbundet med DFS i multivariabel analyse; endnu sammenslutning af en proxy-polymorfi (

HIF2A

rs4953342) blev ikke påvist i fase II patient kohorte. I fase II, sammenslutninger af to SNPs (

HIF2A

rs4953352 og

HIF2B

rs12593988) var betydeligt i både OS og DFS multivariable analyser. Men sammenslutning af

HIF2A

rs4953352 blev ikke gentaget i fase I kohorten bruger en proxy SNP (

HIF2A

rs6706003).

Konklusion

Samlet set vores undersøgelse fandt ikke en overbevisende dokumentation for sammenslutning af de undersøgte polymorfier med sygdommen udfald i kolorektal cancer

Henvisning:. Haja Mohideen AMS, Hyde a, Squires J, Wang J, Dicks E, Younghusband B, et al. (2014) Undersøgelse af polymorfier i Hypoxi Pathway Gener i relation til Outcome i kolorektal cancer. PLoS ONE 9 (11): e113513. doi: 10,1371 /journal.pone.0113513

Redaktør: Armin Gerger, Medical University of Graz, Østrig

Modtaget: Februar 25, 2014 Accepteret: 29 oktober 2014; Udgivet: November 18, 2014

Copyright: © 2014 Haja Mohideen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af forskning og udvikling Corporation of Newfoundland (RDC, Ignite fond til SS: kontrakt nummer: 5404.1201.101 og løftestang for SS, RG, PP: kontraktnummer: 5404.1201.102), den canadiske Institute of Health Research (CIHR ) driftsfond (SS, RG, PP, FRN: 110.045), Medical Research Foundation (MRF) -COX Award 2010 (til SS og RG), CIHR fond for Colorectal Cancer Interdisciplinary Health Research Team ved University of Toronto og Memorial University, National Cancer Institute of Canada (giver 18.223 og 18226) og fonden Atlantic Innovation for Interdisciplinary Research Team i human Genetics. Angela Hyde blev støttet af Walter og Jessie Boyd Charles Scriver MD /PhD Studentship Award (Canadian Institute of Health Research Institute for Genetik og den canadiske Gene Cure Foundation). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Bemærk, at forfatteren SS er en akademisk redaktør for PLoS ONE. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE Redaktionelle politikker og kriterier. Ingen af ​​de andre forfattere har nogen interessekonflikt at rapportere.

Introduktion

Hypoxi er en tilstand karakteriseret ved lavt iltindhold. Solid tumorceller kan opleve hypoxiske betingelser på grund af begrænset blodgennemstrømning. Mens dette kan medføre reduceret celledeling eller død, engang det hjælper også celler tilpasse sig hypoxiske betingelser ved at ændre deres energiomsætning fra oxidativ fosforylering vej til glykolyse vej. Sådanne ændringer påvirke ekspressionen af ​​hypoxi-inducerbare gener og behandlingsresultater hos cancerpatienter. Derudover har været impliceret hypoxiske betingelser for at fremme DNA-replikation, angiogenese og tumorinvasion og metastatisk potentiale. Alle disse ændringer lettere tumor progression og kan have en negativ indflydelse på patientens udfald. Disse og andre roller hypoxiske forhold i tumor progression og resultatet er blevet grundigt gennemgået af mange i litteraturen (f.eks [1], [2]).

Under hypoxiske betingelser, celler aktiverer specifikke molekylære machineries med op -regulating eller nedregulering af ekspressionen af ​​visse gener. Dette lettes af de hypoxi inducerbare faktorer (HIFs). HIFs er heterodimere transkriptionsfaktorer, der består af a- og p-underenheder. Hos mennesker er der tre HIF-α (HIF-1α, HIF-2α og HIF-3α) og to HIF-β (HIF-1β og HIF-2β). Hver af disse underenheder er kodet af forskellige gener (

HIF1A

,

Arnt

/

HIF1B

,

EPAS1

/

HIF2A

,

ARNT2

/

HIF2B

, og

HIF3A

). HIFs binder til hypoxi responsive elementer (hres) langs de hypoksi-regulerede gener kan regulere deres ekspression. Disse hypoksi-inducerbare gener indbefatter gener fungerer i cellevækst, metabolisme, DNA beskadigelse respons, angiogenese, og metastase (gennemgået i [2], [3]). Desuden HIFs aktivere også gener fungerer i cellulære mekanismer, der fører modstand mod konventionelle anti-cancer behandlinger (revideret i [3]).

Blandt de gener, der reguleres af de HIFs er lysyloxidase (

LOX

) [4], makrofag migration inhibitorisk faktor (

MIF

) [5], og CXC motiv chemokin 12 (

CXCL12

) [6].

LOX

koder for et enzym, der hjælper med at opretholde den strukturelle integritet af bindevæv og er blevet identificeret som et kritisk drivkraft for hypoxi-induceret metastase i humane brysttumorer [7]. MIF er kendt hovedsageligt som et immunsystem protein, men i tyktarmskræft cellelinjer den fremmer hypoxi-drevet apoptose [8]. CXCL12 er andet protein mest kendt for sin rolle i immunsystemet, men det har vist sig at påvirke tumorcelledød og reducere metastase risikoen i kolorektale tumorcellelinjer [9].

kolorektal cancer er en almindelig kræft i de udviklede lande. I Canada, i henhold til de canadiske Cancer Society Statistics-2012, det er en af ​​de førende årsager til kræftrelaterede dødelighed [10]. Aktuelt etablerede markører er utilstrækkelige til nøjagtig forudsigelse af prognose i patienter med tarmkræft. Derfor kan identifikation af nye prognostiske markører hjælpe forbedre prognostiske modeller, hvilket igen kan bidrage til at forbedre overlevelse resultater af patienter med tarmkræft. I denne undersøgelse har vi den hypotese, at de genetiske variationer inden for udvalgte gener af hypoxi pathway er forbundet med risiko for resultatet i patienter med tarmkræft. For at teste vores hypotese, vi gennemførte denne undersøgelse i to faser: I fase I, vi fokuserede på tre HIF-kodende gener (

HIF1A

,

HIF1B

, og

HIF2A

) og tre gener reguleres under de hypoxiske forhold (

LOX

,

MIF

, og

CXCL12

) og undersøgt forholdet mellem deres SNPs (n = 49) med resultaterne i en lille gruppe af patienter med tyktarmskræft (n = 272). I fase II, fokuserede vi på fem HIF-kodende gener (

HIF1A

,

HIF1B

,

HIF2A

,

HIF2B

HIF3A

) og to hypoxi-inducerbare gener (

LOX

CXCL12

) og undersøgt forholdet mellem deres SNPs (n = 77) med risiko for resultatet i en ekstra kolorektal cancer patient kohorte (n = 535)

Materialer og metoder

Dette forskningsprojekt blev gennemført i to faser:. fase i og fase II. Fase II blev indledt efter afslutningen af ​​fase I, når en storstilet genotype data for en større patient kohorte blev opnået ved vores gruppe som en del af et andet projekt. Som illustreret i figur 1, er der forskelle mellem fase I og fase II i form af gener, SNPs og patientkohorter undersøgte.

Etik erklæring

Krav om patient samtykke blev frafaldet af den lokale REB udvalg (human Investigation Committee (HIC) af Memorial University, for nylig omdøbt til The Health Research Ethics Authority (HREA)) for de patienter i fase I. skriftligt samtykke blev opnået fra enten patienter eller deres familiemedlemmer (i tilfælde af afdøde patienter) i fase II-kohorten. I løbet af denne undersøgelse blev alle patientrelaterede data undersøgt anonymt. Denne særlige undersøgelse blev ligeledes godkendt af HIC.

Undersøgelse prøver

a) fase I kohorte.

Den første kohorte bestod af 280 patienter og blev beskrevet i detaljer tidligere [11 ]. Disse patienter blev diagnosticeret med tyktarmskræft mellem 1997-1998 i Avalon halvøen, Newfoundland. Patient i denne kohorte blev fulgt indtil 2009. Til dette projekt, DNA-prøver fra 272 af patienterne var tilgængelige for de genotypebestemmelse reaktioner.

b) fase II kohorte.

Den anden kohorte er en sub-kohorte af patienterne rekrutteret til Newfoundland Colorectal Cancer Registry (NFCCR). Den NFCCR kohorten blev rekrutteret mellem 1999 og 2003 og beskrevet i andre publikationer [12], [13]. I NFCCR kohorte, der er 736 patienter med stadium I-IV tumorer og med klinisk-patologiske og prognostiske data indsamlet indtil 2010 [11]. Blandt disse patienter, i alt 535 patienter med tilgængelige genotyper opnået ved hjælp af den genomewide SNP genotypning metode (

se nedenfor

) blev inkluderet i denne fase af projektet.

Valg af gener

a) fase I.

Seks hypoxi pathway gener (

HIF1A

,

HIF1B

,

HIF2A

,

LOX

,

MIF

CXCL12

) blev udvalgt.

b) fase II.

i fase II i dette projekt, vores primære mål var at undersøge sammenslutningerne af polymorfier fra de udvalgte gener i fase i (

HIF1A

,

HIF1B

,

HIF2A

,

LOX

,

MIF

og

CXCL12

) i en større patient kohorte. Ved at udnytte tilgængeligheden af ​​genotyper, vi også til formål at omfatte yderligere to HIF-kodende gener (

HIF2B

HIF3A

) i denne fase.

Udvalg af SNPs

a) fase I.

for at undgå redundans i polymorfier undersøgt, fulgte vi en tilgang, der er involveret beregning af korrelationskoefficienter (r

2) mellem genotyper af polymorfier per gen; fra disse SNPs, der var stærkt korreleret med hver (r

2≥0.8), blev kun én repræsentant SNP inkluderet i undersøgelsen.

Til dette formål, for hvert gen indgår i denne undersøgelse de genotype data for de kaukasiske prøver blev hentet fra HapMap databasen [14] før start af projektet, som blev brugt til at konstruere koblingsuligevægt kort over de gener, der bruger Haploview software [15]. r

2 værdier blev beregnet og tagSNPs blev bestemt under anvendelse af parvise tagger [16] gennemført i Haploview. Både tagSNPs og SNPs, der ikke er mærket af tagSNPs var rettet til at indgå for at have en omfattende analyse af hvert gen. I fase I blev i alt 49 sådanne SNPs held genotype ved hjælp af denne metode (tabel S1 i File S1). Blandt de 49 SNPs,

HIF2A

rs2346175 polymorfi havde 15% manglende data og tre polymorfier (

HIF1B

rs3738483,

HIF2A

rs6753127 og

HIF2A

rs11687512) havde mindre allelfrekvenserne (MAFs). 10% i fase i kohorte

b) fase II

Eighty-én SNPs blev udvalgt fra de otte hypoxi syntesevejsgener vha. tilgang beskrevet i fase I. fra de udvalgte SNPs, fire SNPs, der havde en MAF 10% var udelukket fra den statistiske analyse (

HIF1B

rs10305724,

HIF1B

rs3738483,

HIF2B

rs16972160, og

HIF2B

rs1139651), hvilket resulterede i 77 SNPs, der skal indgå i denne fase (tabel S2 i File S1). Nr polymorfi havde mere end 15% manglende genotypedata. Genotyper ingen SNP fra

MIF

gen var til rådighed for denne kohorte. Således i alt 77 SNPs fra syv gener (

HIF1A

,

HIF1B

,

HIF2A

,

HIF2B

,

HIF3A

,

LOX

CXCL12

) blev inkluderet i fase II.

Tretten SNPs blev undersøgt i begge patientkohorter. Derudover var der 15 SNPs undersøgt i fase I, der havde stærkt korrelerede genotyper med andre SNPs undersøgt i fase II-kohorten (tabel S3 i File S1): de resterende SNPs blev undersøgt enten kohorte I eller kohorte II, men ikke i begge . Da SNPs med højt korrelerede genotyper kan tjene som surrogater for hinanden, i løbet af denne undersøgelse har vi også kontrolleres (ud over ens SNPs), om resultaterne af de statistiske tests opnået for proxy SNPs i begge kohorter var ens med hensyn til deres sammenslutninger med overlevelsestid.

Genotypning

a) fase I.

I denne fase blev DNA-prøver udvundet enten fra blodprøver eller fra ikke-tumor kolorektale væv blokke opnået under operation . De genotyper de 49 polymorfier indgår i denne fase af undersøgelsen blev opnået ved enten Sequenom MassArray teknologi på en outsourcing genotype facilitet (University Health Network Analytisk Genetics Technology Centre, Canada, n = 35 SNP’er) eller in-house TaqMan SNP genotype analyser ( n = 14 SNP’er). For både MassArray og TaqMan SNP genotypebestemmelse analyser blev mindst 5% af forsøgspersonerne genotypebestemmes to gange og alle genotyper opnåede var 100% overensstemmende. Hver genotype reaktion indeholdt også ikke-skabelon kontroller til påvisning ekstern DNA-kontaminering. Disse DNA-prøver, der mislykkedes blev skal genotypebestemmes af TaqMan SNP genotype analyser blev forsøgt skal genotypebestemmes to eller flere gange afhængigt af tilgængeligheden af ​​DNA-prøver.

TaqMan SNP genotypning

TaqMan SNP genotype analyser blev udført i en 96 brønds hurtige reaktionstider plader under anvendelse af ABI 7900HT Hurtig Real-Time PCR System. Typisk genotyping reaktioner indeholdt 9 pi reaktionsblanding og 1 pi DNA-prøve (4 ng /pi). Reaktionsblandingen bestod af 5 pi TaqMan Universal PCR Master Mix (2 ×) (Applied Biosystems PN 4.304.437), 0,25 pi SNP genotypebestemmelsesassay Mix (20 ×) (specifikke for hver SNP) og 3,25 pi sterilt vand. I nogle tilfælde, især dem, der udviste ringe amplifikation, reaktionsvolumenet var 5 pi (indeholdende 4 ng DNA); dette blev gjort for at øge DNA-koncentrationer i reaktioner. Assay-id’er til de SNPs genotypede ved denne metode er vist i tabel S4 i File S1. En præ-run scanningen blev udført før start på forstærkning. PCR-reaktionsbetingelserne var som følger: a) aktivering af AmpErase UNG ved 50 ° C i 2 minutter, b) AmpliTaq Gold polymerase aktivering ved 95 ° C i 10 minutter, og c) 40 cykler med denaturering af DNA ved 95 ° C i 15 sek efterfulgt af primer-annealing og forlængelse ved 60 ° C i 1 min. Efter afslutning af reaktionerne blev et efterløb scanning skal udføres, og dataene blev analyseret under anvendelse detektionssekvensen software (SDS). De SDS genotypebestemmelse resultater blev også manuelt kontrolleres for at kalde de afsluttende genotyper af en af ​​os (SS).

b) fase II.

fase II i dette projekt, genotype data for 77 SNP’er blev opnået som en del af et hele genomet SNP genotyping undersøgelse. Genotyper blev opnået ved hjælp af Illumina human Omni1-Quad Bead Chip på en tjenesteudbyder (Centrillion Genomic Services, USA) ved hjælp af DNA-prøver ekstraheret fra blodprøverne.

Statistiske metoder

genotyper opnåede var organiseret i Microsoft Excel-ark og de statistiske analyser blev udført ved hjælp af statistiske Package for Social Sciences (SPSS) software. Forud for statistisk analyse, blev alle variabler kontrolleres for manglende data. Desuden blev MAFs af SNP’er beregnet og genotyper blev kontrolleret for afvigelser fra Hardy Weinberg ligevægt (HWE). HWE blev beregnet under anvendelse af Chi-square test. Variabler, der havde mere end 15% manglende data eller afviger fra den HWE blev inkluderet i den univariate analyse for sonderende formål, men blev udelukket fra multivariable analyse. Genotyper blev kodet under antagelse af dominerende genetiske model. Bortset alder, alle andre variabler indgår i analysen var kategorisk; alder blev analyseret som en kontinuerlig variabel

Tre forskellige mål for udfald blev anvendt til statistisk analyse:. samlet overlevelse (OS), sygdomsfri overlevelse (DFS) og sygdomsspecifikke overlevelse (DSS). For OS, død var den kliniske endepunkt (defineret som død af enhver årsag). For DFS, forekomst af tilbagefald af sygdom eller metastaser eller død var den kliniske slutpunktet. For DSS, kolorektal cancer specifik død var den kliniske slutpunktet. DSS oplysninger var kun tilgængelig for fase I kohorte. Patienter, som ikke oplevede tilfælde af renter i opfølgningsperioden blev censureret på datoen for deres sidste opfølgning.

Survival kurver blev genereret af Kaplan Meier-metoden. Forholdet mellem hver variabel og de resultatmål (OS, DFS, DSS) blev analyseret individuelt ved hjælp af Cox regression metode i univariat analyse. De p-værdier, Hazard Nøgletal (HRS) og 95% konfidensintervaller (CIS) for HRs blev også beregnet af Cox regression metode. Variabler, der var statistisk signifikant i univariate analyse (p 0,05) blev inkluderet i de multivariable Cox regressionsmodeller. Egenskaberne patient mellem to studier kohorter blev sammenlignet ved hjælp af Chi-square test statistik for kategoriske variable og Mann-Whitney U test for de kontinuerlige variabler. En p-værdi mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant; da dette var en sonderende analyse blev udført nogen korrektion for multiple test. Alle tests var dobbeltsidet.

Resultater

Fase I

Baseline karakteristika fase I kohorten er vist i tabel 1. I denne kohorte (n = 280), den median alder på diagnosetidspunktet var 68,4 år (spændvidde: 25,3-91,6), median OS og DSS opfølgningstid var 5,3 år (spændvidde: 0-12.5 år) og den mediane DFS opfølgningstid var 3,4 år (spændvidde: 0-12,5 år).

Ud af 49 polymorfier undersøgt i denne fase, de genotypefrekvenser for syv SNPs (

LOX

rs10040971,

HIF1B

rs10847,

CXCL12

rs2236534,

CXCL12

rs2236533,

CXCL12

rs11592974,

HIF2A

rs9973653 og

HIF2A

rs4145836) afveg fra HWE (tabel S1 i File S1 ). . Disse SNPs blev inkluderet i univariat analyse for sonderende formål

I univariat analyse for samlet overlevelse blev fundet tre SNPs at være signifikant associeret (p 0,05) med resultatet:

LOX

rs10519694 (p = 0,046; HR = 0,735; 95% CI: 0,543-0,994),

HIF2A

rs11125070 (p = 0,003; HR = 0,616; 95% CI: 0,447-0,848) og

HIF2A

rs1868084 (p = 0,024; HR = 0,678; 95% CI: 0,483-0,950; tabel S5 i File S1). Men i en multivariable model, sammenslutninger af ingen af ​​disse SNPs forblev statistisk signifikant, når der korrigeres for alder, klasse, scene og MSI-status (tabel 2).

I univariat analyse for sygdomsspecifikke overlevelse, forening af ingen af ​​SNPs var signifikante (tabel S6 i File S1)

i univariat analyse for sygdomsfri overlevelse, to SNP’er (

LOX

rs10519694;. p = 0,012; HR = 0,685; 95 % CI: 0,510-0,919 og

HIF2A

rs11125070; p = 0,003; HR = 0,629; 95% CI: 0,461-0,858) var forbundet (p 0,05) med overlevelsestiden (tabel S7 i File S1) . En af disse SNPs (

HIF2A

rs11125070) forblev statistisk signifikant i multivariable analyse, når der korrigeres for

LOX

rs10519694 genotyper, alder, klasse, scene og MSI-status (HR: 0,619, 95% CI: 0,446-0,859, p = 0,004; tabel 3)

fase II

efter afslutningen af ​​fase i, en mere omfattende undersøgelse (fase II) blev udført ved at tilsætte. polymorfismer fra yderligere to HIF-kodende gener (

HIF2B

,

HIF3A

) og ved at undersøge deres foreninger med OS og DFS i en anden og større patient kohorte.

Baseline karakteristika af fase II-kohorten er vist i tabel 4. i fase II-kohorten (n = 535) var den mediane alder var 61,2 år (interval: 20.7-75.0 år) var den mediane OS tid var 6,34 år (interval: 0,38-10,88 ) og median DFS tid var 5,98 år (interval:. 0,22-10,88)

af 77 SNPs (tabel S2 i File S1), genotypefrekvenser af syv polymorfier afveg fra HWE (

HIF2B

rs8041826,

HIF2B

rs7172914,

HIF2B

rs1020398,

HIF2B

rs4778600,

HIF2B

rs8033706,

HIF3A

rs12461322 og

HIF3A

rs11665853); disse SNPs indgik kun i univariate analyse for sonderende formål

I denne fase af projektet,

HIF2A

rs4953352 (p = 0,012; HR = 1,596; 95% CI:. 1,107-2,300 ) og

HIF2B

rs12593988 (p = 0,024; HR = 0,690; 95% CI: 0.500-0.952) polymorfier var forbundet med risiko for dødsfald i univariate analyse (p 0,05) (tabel S8 i File S1 ). I multivariable analyser, sammenslutninger af

HIF2A

rs4953352 (p 0,001; HR = 2,189; 95% CI: 1,468-3,265) og

HIF2B

rs12593988 (p = 0,009; HR = 0,627; 95 % CI: 0,442-0,890) med den samlede overlevelse fortsat betydelig, når også korrigeret for vaskulær invasion status, køn, scene og MSI-status (tabel 5)

I univariat sygdomsfri overlevelse analyse,

. HIF2A

rs4953352 (p = 0,009; HR = 1,574; 95% CI: 1,122-2,207),

HIF2B

rs12593988 (p = 0,042; HR = 0,736; 95% CI: 0,548-0,988), og

HIF2B

rs8033706 (p = 0,023; HR = 0,704; 95% CI: 0,521 til 0,953) polymorfier var forbundet med risikoen for recidiv, metastaser eller død (p 0,05) (tabel S9 i File S1). I multivariable analyse,

HIF2A

rs4953352 (p 0,001; HR = 1,965; 95% CI: 1,366-2,828) og

HIF2B

rs12593988 (p = 0,017; HR = 0,678; 95% CI : 0,493-0,931) forblev signifikant associeret med DFS tid, når der korrigeres for køn, placering, scene, vaskulær invasion og MSI-status (tabel 6). Notatet da genotypefrekvenserne af

HIF2B

rs8033706 polymorfi fraveget HWE, blev det ikke medtaget i denne multivariable model.

SNPs undersøgt i både fase I og fase II-kohorter

i alt 13 SNPs blev undersøgt i begge kohorter. Hertil kommer, ifølge HapMap data, var der 15 polymorfier undersøgt i fase I, hvis genotyper var stærkt korrelerede (r

2≥0.8) med 15 andre polymorfier undersøgt i fase II (tabel S3 i File S1). Vi ræsonnerede, at de SNPs med stærkt korrelerede genotyper kan tjene som surrogater for hinanden. Disse proxy SNPs fik os til at kontrollere, om en sammenslutning af en polymorfi påvist i en kohorte blev gentaget i den anden kohorte.

For

HIF2A

rs11125070 polymorfi forbundet med sygdomsfri overlevelse i fase I kohorte,

HIF2A

rs4953342 polymorfi undersøgt i fase II-kohorten var en proxy (r

2 0,90). Vores resultater viste, at

HIF2A

rs4953342 var ikke forbundet med DFS i fase II-kohorten (tabel S9 i File S1). Derudover, for

HIF2A

rs4953352 polymorfi, der blev fundet at være forbundet med både generelle og sygdomsfrie overlevelse i fase II-kohorten, der var en polymorfi (

HIF2A

rs6706003) genotype i fase I med højt korrelerede genotyper (r

2 = 0,87). Tilsvarende blev denne polymorfi ikke detekteret at være forbundet med enten OS (tabel S5 i File S1) eller DFS (tabel S7 i File S1) i fase I kohorte.

Der var ingen proxy SNP undersøgt i fase I kohorte for

HIF2B

rs12593988 polymorfi, at vi har registreret som er forbundet med OS og DFS gange i patientens kohorte II.

Forskelle mellem fase i og fase II-kohorter i form af deres klinisk-patologiske træk

fase i og fase II-kohorter meget forskelligt fra hinanden med hensyn til følgende baseline-karakteristika: alder: p 0,001, sex: p = 0,037, kvalitet: p 0,001, lymfe invasion: p 0,001, placering : p 0,001 og scene:. p = 0,018

diskussion

i denne undersøgelse, vi havde til formål at undersøge sammenslutninger af genetiske variationer fra udvalgte gener fungerer i hypoxi vej og klinisk resultat i kolorektal kræftpatienter. Denne undersøgelse omfatter to forskellige kohorter og på en måde overlappende endnu ikke identiske sæt af gener og SNP’er som afbildet i figur 1. Eksklusive de 13 SNPs, der var fælles mellem fase I og II, blev i alt 113 forskellige SNPs undersøgt i enten fase I eller fase II.

i fase i i dette projekt, 49 SNPs fra seks gener i hypoxi pathway og deres relation til resultatet i patientens kohorten blev analyseret ved hjælp af tre forskellige mål for udfald (OS, DFS og DSS). Vores resultater viste, at der ikke var nogen sammenslutning af disse polymorfier med OS eller DSS i denne kohorte. Men en hyppig SNP beliggende i mRNA kodende region af

HIF2A

gen (rs11125070, NM_001430.4: c.27-21086A T; mindre allel frekvens: 30,4% i fase I kohorte) var forbundet med DFS i multivariabel analyse uafhængige af andre prognostiske indikatorer. Specifikt patienter med AT og TT genotyper (genotyper indeholdende den mindre allel T) havde ~0.4 gange nedsat risiko for tilbagefald, metastase eller død sammenlignet med patienter med AA genotype. Men når foreningen af ​​en meget korreleret polymorfi undersøgt i fase II-kohorten (

HIF2A

rs4953342) blev testet i forhold til sygdomsfri overlevelse, denne forening blev ikke påvist i fase II-kohorten. Derfor, mens forskellene mellem de to kohorter i form af deres klinisk-patologiske træk kan have bidraget til denne uoverensstemmelse, i betragtning af, at ingen korrektion for multiple test blev anvendt i denne undersøgelse, antager vi, at foreningen observeret i fase I kohorte var en falsk positiv association.

i fase II i dette projekt, ud af de 77 SNPs undersøgte to SNPs (

HIF2B

rs12593988 og

HIF2A

rs4953352) var forbundet med resultat i både OS og DFS multivariable analyser.

HIF2B

rs12593988 (NM_014862.3: C.31 + 8939A G) og

HIF2A

rs4953352 (NM_001430.4: c.27-8490T C) er begge hyppige polymorfier (mindre allel frekvenser 19% og 49%, henholdsvis). I øjeblikket deres biologiske konsekvenser er ukendt, men kan en regulerende rolle af disse varianter i påvirke genekspressionen eller funktion ikke udelukkes. For

HIF2A

rs4953352, en anden polymorfi med højt korrelerede genotyper (

HIF2A

rs6706003) var ikke forbundet med enten OS eller DFS i fase I kohorte. Ikke-replikation af denne forening kan tilskrives forskellene mellem de to kohorter eller til den lille stikprøve af fase I kohorte, som kan føre til en utilstrækkelig undersøgelse magt til at opdage denne forening. Men hvis en korrektion for procedure multiple test blev anvendt, den observerede association ville ikke forblive signifikant. Således er den mest sandsynlige forklaring er, at foreningen observeret i fase II-kohorten var en falsk-positiv association

Der var ingen proxy SNP for

HIF2B

rs12593988 i vores kohorte jeg DataSet.; derfor var vi ikke i stand til at teste sin forbindelse med sygdom resultater i en uafhængig kohorte.

I øjeblikket studerer teste sammenslutninger af de polymorfier af hypoxi gener med generelle eller sygdomsfrie overlevelse i kolorektal cancer er ret sjældne. For eksempel, i henhold til dbCPCO databasen [17] og en litteratursøgning udført, og med januar 2014 kun fire studier så på polymorfier fra de undersøgte i denne undersøgelse gener (

HIF1A

,

Arnt /HIF1B

, og

CXCL12

). Den eneste undersøgelse studerede

HIF1B

rs2228099 (Val174Val G /C) polymorfi fandt ikke en sammenslutning af det med den samlede overlevelse i en patient kohorte [18]. Derudover to polymorfier fra

HIF1A

gen (rs11549465 Pro582Ser C /T [18], [19] og rs11549467 Ala588Thr G /A [19] blev undersøgt i forhold til overordnede eller sygdom frie overlevelse i andre kohorter: men disse undersøgelser ikke finde en sammenslutning af disse polymorfier med disse resultater i deres patientkohorter. Endelig en

CXCL12

genpolymorfisme, G /A i 3′-UTR (rs1801157 G801A), blev undersøgt i forhold til sygdomsfri overlevelse i to publicerede studier. Mens der i et studie denne polymorfi ikke var forbundet med sygdomsfri overlevelse [20], i en anden undersøgelse blev det konstateret, at være forbundet med sygdomsfri overlevelse i både univariate og multivariable kun analyser i patienter uden lymfeknuder node metastaser [21]. disse litteratur resultater viser sjældenhed offentliggjort forskning, herunder polymorfier fra vores liste af gener. Desuden blandt disse tidligere undersøgte polymorfier, kun

HIF1B

rs2228099 polymorfi blev undersøgt i vores undersøgelse ( i både fase i og II). Dette indikerer, at undtagen én polymorfi (

HIF1B

rs2228099), polymorfier rapporteret i dette manuskript undersøges for første gang i forhold til overlevelse resultater i kolorektal cancer.

Vores undersøgelse har visse begrænsninger og styrker . A) Da dette var en eksplorativ analyse, for at minimere de falske negative fund en korrektion for multiple test blev ikke udført. Vi bør bemærke, at ingen af ​​de fundne i denne undersøgelse foreninger ville forblive signifikant efter anvendelse, f.eks Bonferroni test for korrektion. B) Patienten kohorte undersøgt i fase I var præget af en relativt lille stikprøve (n = 272) og fase I og II-kohorter afveg væsentligt fra hinanden med hensyn til nogle baseline klinisk-patologiske træk. Desuden blev fase II patient kohorte hælder mod tidligere stadier og var således ikke er repræsentativ for NFCCR kohorten (data ikke vist). Men så vidt vi ved fase II-kohorten (n = 535) er også en af ​​de største undersøgt i en sådan undersøgelse i colorektal cancer kohorter. C) Denne undersøgelse var begrænset med otte gener fungerer i hypoxi vejen (

HIF1A

,

HIF1B

,

HIF2A

,

HIF2B

, og

HIF3A

,

MIF

,

CXCL12

, og

LOX

); mange andre gener i denne vej blev ikke undersøgt.