PLoS ONE: 1-Methyl-D-tryptophan potenserer TGF-β-induceret epithelial-Mesenchymale Transition i T24 Menneskelig blærekræft Cells

Abstrakt

Immun flugt og metastase er kendetegnende for flere typer af kræft, herunder blære kræft. En af de involveret i disse processer mekanismer er blevet forbundet med indolamin 2,3-dioxygenase (IDO). Selvom IDO er klassisk anerkendt for sin immunmodulerende ejendom, har det præsenteret nonimmunological effekter i nogle tumorer. TGF-β1 antages at bidrage til carcinom udvikling ved modulering immunosuppressiv molekyler, herunder IDO. Desuden TGF-β1 inducerer epitel-mesenkymale overgang (EMT), som er et kritisk trin i tumorindtrængen og metastase. Vi undersøgte rollen af ​​MT og IDO modulation i induktionen af ​​EMT af TGF-β1 i T24 human blære-carcinomaceller. Når T24-celler blev inkuberet med IDO inhibitor (MT, 1-methyl-D-tryptophan), med TGF-β1, og med MT + TGF-β1, blev der observeret et signifikant fald i IDO ekspression og aktivitet. Desuden blev nedregulering af e-cadherin og opregulering af n-cadherin og EMT transkriptionsfaktorer induceret af behandlingerne, hvilket bekræfter induktionen af ​​EMT. siRNA-medieret knockdown af IDO faldt e-cadherin ekspression, men havde ingen virkning på EMT transkriptionsfaktorer. I ridse-viklet assay blev den øgede migration proces intensiveres, når cellerne blev inkuberet med MT + TGF-β1. Disse virkninger var forbundet med en robust inhibering af Akt aktivering. Efter inokulering af T24 celler under nyrekapslen af ​​nøgne Balb /c, cellerne var positive for IDO i centrum af cellen infiltrat, var negativt i periferien, hvor EMT er høj. Afslutningsvis inhibering af IDO af TGF-β1 og MT er forbundet med EMT i T24 human blære-carcinomaceller. MT har forstærkende virkninger i TGF-β1-inducerede EMT, uafhængigt af IDO. Denne nonimmunological effekt af MT bør overvejes, hvis IDO er målet at undgå immun flugt i blærekræft

Henvisning:. Brito RBO, Malta CS, Souza DM, Matheus LHG, Matos YST, Silva CS, et al. (2015) 1-methyl-D-tryptophan potentierer TGF-β-induceret epithelial-Mesenchymale Transition i T24 human blærecancer Cells. PLoS ONE 10 (8): e0134858. doi: 10,1371 /journal.pone.0134858

Redaktør: Michael Platten, University Hospital of Heidelberg, Tyskland

Modtaget: Januar 28, 2015; Accepteret: 14 Juli 2015; Udgivet: 12. august 2015

Copyright: © 2015 Brito et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af São Paulo Research Foundation (FAPESP) indrømme 2012 /04.423-0, https://www.fapesp.br/.

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Urinary blærekræft er den mest almindelige malignitet i urinvejene [1]. Selv om den mest almindelige form for human blærecancer er non-muscle invasive (70% til 80%), 30% til 50% af disse tilfælde fremskridt til en muskel-invasiv form, efter gentagne resektioner, hvilket i sidste ende fører til cancer-specifik død og metastase [2].

Flere mekanismer er blevet impliceret i tumorindtrængen og metastase, herunder epitel-mesenkymale overgang (EMT). I denne proces, et polariseret epitelcelle antager en mesenchymal fænotype, der fører til et tab af cellulær adhæsion til basalmembranen, aktivering af motilitet og invasionsevne, og produktion af ekstracellulære matrix-nedbrydende enzymer [3]. Flere molekyler er involveret i initiering af EMT, herunder TGF-β superfamilieproteiner. TGF-β1 er et vigtigt inducer af EMT i flere forskellige typer af tumorer [4], herunder blærekræft [5]. Visse genetiske variationer og øgede plasmaniveauer af TGF-β er potente prædiktorer for blærecancer risiko [6,7].

indolamin 2,3-dioxygenase (IDO) er et enzym, der katalyserer nedbrydningen af ​​aminosyren tryptophan, hvilket fører til akkumulering af tryptophan metabolitter såsom kynurenin. Som beskrevet af Munn et al., IDO har en rolle i maternel-føtal interface og funktioner til beskyttelse embryoner mod den maternelle immunsystemet [8]. Efterfølgende IDO er blevet undersøgt til anvendelse som en effektiv immunomodulatorisk molekyle. Fordi IDO er produceret af mange celletyper i immunsystemet, herunder dendritiske celler, makrofager og regulatoriske T-celler, er IDO været impliceret i immunmedierede lidelser, såsom allograft-afstødning [9], autoimmune sygdomme [10] og flygte fra antitumor immunitet i kræft [11]. Vedrørende cancer, IDO aktivitet er til stede i mange humane tumortyper såvel som tumor-drænende lymfeknuder [11]; dog rolle IDO i tumorvækst stadig dårligt forstået. Mens IDO udtryk er korreleret med en mindre gunstig prognose for mange typer af kræft, herunder kolorektal [12], uterin livmoderhalsen [13], endometrie [14], bryst [15], melanom [16], i æggestokkene [17], og lungekræft [18], IDO ekspression er også forbundet med gentagelse overlevelse af hepatocellulære patienter [19] og for patienternes overlevelse på lang sigt med renal carcinoma [20]. Selv om der er en kontrovers om den rolle, den IDO i kræft, har molekyler, der kan modulere IDO-medierede veje blevet betragtet som lovende for kræftbehandling. I den forbindelse har 1-methyl-D-tryptophan, en kompetitiv inhibitor af IDO, blevet studeret intensivt som anticancermiddel. I øjeblikket var sammenslutningen af ​​1-methyl-D-tryptophan (MT) med docetaxel anvendes i en klinisk fase I studie med patienter med metastatisk solide tumorer [21]. Dog kan dette molekyle handle uafhængigt af IDO aktivitet [22], samt gerne tryptofan til at regulere mTOR pathway [23].

IDO udtryk er fundet ikke kun i tumor-infiltrerende immunceller og tumordrænende lymfeknuder men også i neoplastiske celler. I blærekræft, T24 human overgangs- carcinom cellelinje producerer IDO konstitutivt i kultur [24], selv uden medvirken af ​​immunsystemet, hvilket fører til den hypotese, at IDO kan have en rolle i ikke-immune processer. Levina et al., Viste, at opregulering af IDO i brystcancerceller forøget celleproliferation og nedsat apoptose på en måde, der var uafhængig af de immunologiske virkninger af IDO [25].

Interessant TGF-β inducerer en tolerogent fænotype i immunogene dendritiske celler, og denne effekt er medieret af IDO gennem aktivering af PI3K /Akt pathway [26]. Fordi TGF-β inducerer EMT i T24 blærecarcinomaceller [27, 28], vi hypotese, at modulering af IDO kan være forbundet med TGF-β i induktionen af ​​EMT i T24 carcinomceller. I denne undersøgelse har vi analyseret effekten af ​​MT og siRNA-medieret knockdown af IDO i TGF-β-induceret EMT i T24 blære-carcinomaceller.

Materialer og metoder Salg

Cellekultur

Menneskelige blærekræft T24 celler (HTB-4, American Type Culture Collection-ATCC, Manassas, VA, USA) blev erhvervet fra cellen bank af Federal University of Rio de Janeiro. T24-celler blev dyrket i McCoys 5A-medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) suppleret med 10% føtalt bovint serum og penicillin-streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og holdt ved 37 ° C med 5% CO

2.

for at analysere effekten af ​​TGF-β1 på IDO udtryk, T24-celler blev podet i 6-brønds plader (1X10

5 celler pr). Cellerne blev inkuberet med 1 ng /ml, 5 ng /ml eller 10 ng /ml TGF-β1 (R medium indeholdende 1 mM methyl-tryptophan (MT; 1-methyl-D-tryptophan, kat 452.483, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); medium indeholdende TGF-β1 (5 ng /ml); og medium indeholdende MT plus TGF-β1. Ved afslutningen af ​​48 timer blev supernatanter opsamlet til kynurenin måling, og den cellulære monolag blev trypsinbehandlet til RNA-ekstraktion. Dette eksperiment blev gentaget for protein isolation.

Små interfererende RNA (siRNA) transfektion

For at knockdown endogen IDO blev T24-celler transficeret med siRNA for IDO (Lyddæmper Select fortegnelserne 4.392.420, Ambion, Carlsbad, CA) eller med en ikke-målrettet kontrol siRNA til transfektion kontrol (Lyddæmper Vælg negativ kontrol lagerføres 4.390.843, Ambion, Carlsbad, CA) under anvendelse af Lipofectamine 3000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA). Kort beskrevet blev cellerne dyrket i 6 brønde plader, og derefter blev holdt i serumfrit McCoy medium indeholdende (per brønd) 1 ug siRNA, 5 pi P3000 Reagent, og 5 pi Lipofectamine 3000 reagens, i 24 timer. Efter transfektion blev mediet fjernet, og cellerne blev dyrket i 24 timer i McCoys 5A-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C med 5% CO

2. Efter bjærgningstiden blev cellerne inkuberet med TGF-β1 (5 ng /ml, i 48 timer, i serumfrit McCoy medium), nøjagtigt som tidligere beskrevet. De følgende fire betingelser i tre eksemplarer blev udført: T24-celler tidligere transficeret med kontrol siRNA (si-Control), uden TGF-β 1; T24-celler tidligere transficeret med IDO siRNA inkuberet uden TGF-β 1 (siIDO); T24-celler tidligere transficeret med kontrol siRNA inkuberet med TGF-β 1 (TGF-β); og T24 celler tidligere transficeret med IDO siRNA inkuberet med TGF-β1 (siIDO + TGF-β).

RT-qPCR

Samlet RNA blev ekstraheret ved hjælp PureLink RNA Mini Kit (Ambion Inc, Carlsbad , CA) ifølge producentens anvisninger, og den første streng cDNA blev syntetiseret ved M-MLV (Promega, Madison, WI) efter DNase-behandling (Promega, Madison, WI). Real-time PCR blev udført under anvendelse af Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, CA). Specifikke primere for TBP (

TATA-boks-bindende protein

; fremadrettet 5′-TTCGGAGAGTTCTGGGATTGTA-3 ‘og revers 5′-TGGACTGTTCTTCACTCTTGGC-3′; accession nummer NM003194), IDO (fremadrettet 5’-GGTCATGGAGATGTCCGTAA-3 ‘og bagudrettet 5’-ACCAATAGAGAGACCAGGAAGAA-3 ‘; accession nummer NM002164), E-cad (fremadrettet 5′-GGTCATGGAGATGTCCGTAA-3′ og revers 5’-ACCAATAGAGAGACCAGGAAGAA-3 ‘; accession nummer Z18923), N-cad (fremadrettet 5’-TGCCCGGTTTCATTTAGGGG -3 ‘og omvendt 5′-TCCCTCAGGAACTGTCCCAT-3′; tiltrædelse nummer X57548), TWIST (fremadrettet 5’-AGAGATGCAACTAAGCCCTCT-3 ‘og omvendt 5′-AAGCAGCTACTGACAGGCAC-3′; tiltrædelse nummer Y11177), Snail (fremadrettet 5’-ACCACTATGCCGCGCTCTT 3 ‘og revers 5′-GGTCGTAGGGCTGCTGGAA-3′; accession nummer NM005985), og Slug (fremadrettet 5’-TGTTGCAGTGAGGGCAAGAA-3 ‘og revers 5′-GACCCTGGTTGCTTCAAGGA-3’; accession nummer NM003068) blev anvendt. Tredobbelte af hver prøve blev opvarmet til 95 ° C i 5 min og derefter udsat for 40 cykler af denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder, annealing ved 60 ° C i 60 sek og ekstension ved 60 ° C i 60 sek. Disse reaktioner blev udført under anvendelse af et Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA). Efter realtids-PCR, tærsklen cyklus (C

t) blev bestemt for husholdning genet (TBP) samt målgener ved hjælp af auto baseline og auto tærskel forhold. Normaliserede genekspression data, ved hjælp af ΔΔC

t (ΔC

t reference- ΔC

t mål) og formlen 2

-ΔΔCt, blev udnyttet til yderligere analyse.

Western blot

Western blot-analyse blev udført for at analysere IDO udtryk og Akt /Pakt signalvejen aktivering. Kort beskrevet blev samlet protein ekstraheret fra T24-celler ved lyse-buffer (50 mM Tris-Base, 1 mM EDTA, 0,5 uM PMSF, 0,001% Triton X-100, 0,1 mM AEBSF, 0,08 pM aprotinin, 4 uM bestatin, 1,4 uM E- 64, 2,0 uM leupeptin og 1,5 uM pepstatin). Et hundrede mikrogram totalt protein blev denatureret og sat på en 12% natriumdodecylsulfat (SDS) -polyacrylamid gel elektroforese og derefter overført til en nitrocellulosemembran ved semi-tør elektroblotting (Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Efter blokering med fedtfri mælk blev membranerne inkuberet med 1: 250 muse-anti-humant IDO (MAB5412, Merck Millipore, Billerica, MA) eller 1: 1000 kanin-anti-humant phospho-Akt (MAB 2965; Cell Signaling Technology Inc ., Danvers, MA). Efter detektion af forøget kemiluminescens (ECL-påvisningssystem; Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ) blev de anti-IDO og anti-phospho-Akt membraner strippet med stripning puffer (62,5 mM Tris-HCI, 2% SDS, 0 , 1 M 2-mercaptoethanol) og inkuberet med 1: 5000 muse-anti-humant β-actin (A1978; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og 1: 1000 kanin-anti-human Akt (MAB 4685; Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA), hhv. Til påvisning, 1: 5000 ged anti-kanin IgG HRP-konjugeret (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og 1: 5000 gede-anti-muse-IgG HRP-konjugerede (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) sekundære antistoffer blev anvendt.

kynurenin måling

HPLC blev udført for at måle kynurenin i cellekultursupernatanterne. Prøverne blev deproteiniseret ved centrifugering ved 5.000 g (15 minutter ved 4 ° C) med 10% trichloreddikesyre (1: 1, vol /vol). Parallelt blev en standardkurve konstrueret med følgende koncentrationer: 0,5 pM, 1,0 pM, 2,0 pM, 4,0 pM, 8,0 pM, og 16,0 uM. Efter centrifugering blev supernatanterne og standarder filtreres gennem et 0,22 um sprøjte-loaded filter og løses med en mobil fase af acetonitril plus natriumacetatpuffer (4:96, v /v), pH 4,7. En forkolonne af 12.5X4.6 mm og en søjle af 250X4.6 mm (5 um; Agilent Hypesil ODS, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) blev anvendt. Toppen repræsenterer kynurenin blev påvist med Chemstation Agilent software (G2170AA, Agilent Technologies, Santa Clara, USA).

Scratch-sår migration og Transwell invasion analyser

For scratch-sår analyser, T24 celler blev podet i plader med 24 brønde (5×10

4 per brønd) og dyrket, indtil det når 80% konfluens (24-30 h). Celler blev holdt i serumfrit McCoys 5A Medium i 24 timer og derefter behandlet med følgende (tre eksemplarer): MT (1 mM), TGF-β1 (5 ng /ml), og TGF-β1 + MT. Celler opretholdt i serumfrit medium repræsenterede kontrol. Efter en 24 timers inkubation med behandlingen blev supernatanter fjernet og frisk medium blev tilsat (10% FBS). En ridse per brønd blev udført under anvendelse af en 200 pi pipettespids og fire billeder pr brønd blev taget ved 40X forstørrelse under et omvendt mikroskop (Ti-S; Nikon Corp., Tokyo, Japan). Efter tre timer blev der yderligere billeder erhvervet. Hver scratch-sårområde blev beregnet under anvendelse af ImageProPlus 6.0 program (Media Cybernetics Inc., Bethesda, MD).

Transwell invasion assays blev ligeledes udført. Transbrøndene blev udstyret med membraner (6,5 mm diameter, 8,0 um porestørrelse, Corning Inc., NY), overtrukket med BD Matrigel basalmembranmatrix (BD Biosciences, San Jose, CA) i en koncentration på 3 mg /ml, og derefter inkuberet ved 37 ° C i 2 timer. Cellerne blev behandlet som beskrevet for scratch-viklet assay, og derefter podet på toppen af ​​Matrigel coating med serum-frit medium (tre kopier). Cellerne fik lov til at migrere i 6 timer og 24 timer mod en kammer indeholdende McCoys medium tilsat 20% føtalt bovint serum. Efter inkubation blev membranerne fikseret i methanol og farvet med hematoxylin. Antallet af migrerede celler blev bestemt under mikroskop forstørrelse (400X).

Animal model for invasion analyse

Alle dyreforsøg blev godkendt af Nove de Julho University Institutional Animal Care og brug Udvalg.

Tre BALB /c nøgne mus (5-6 uger gamle) blev anvendt. Musene blev opretholdt i individuelt ventilerede bure under filtreret luft (Alesco, Capivari, Sao Paulo, Brasilien) med fri adgang til vand og mad. Intraperitoneal injektion af ketamin (100 mg /kg; ketamin-S, Sao Paulo, Brasilien) og xylazin (10 mg /kg; Rompun, Bayer, Leverkusen, Tyskland) blev anvendt til at opnå generel anæstesi. En 10 mm lumbal indsnit blev udført for at få adgang venstre nyre. T24-celler (1X10

6) blev resuspenderet i 10 mikroliter PBS og inokuleret under nyrekapslen under anvendelse af en 21G-nål fastgjort til en 100 pl-Hamilton-sprøjte (Hamilton Company, Reno, Nevada). Efter omhyggelig podning blev kapsel indsnit efterfølgende ætses. Mus blev overvåget dagligt i 28 dage. På den 28

th dag blev musene bedøvet med ketamin /xylazin, efterfulgt af laparotomi og torakotomi for at verificere metastase. For hver mus blev en midcoronal sektion af venstre nyre fastsat i Duboscq-Brasilien opløsning i 60 minutter efterfulgt af post-fiksering i pufret 10% formaldehydopløsning indtil paraffinindlejring. Sektioner (3 um tyk) blev farvet med hematoxylin og eosin og derefter anvendt til immunhistokemi. Histologisk analyse blev anvendt til at verificere tilstedeværelsen af ​​T24 celler i subkapsulær rum og renal parenkym.

Immunhistokemi

Paraffinsnit blev udsat for mikrobølgebestråling i citratpuffer at forbedre antigen-genvinding. Biotin Blocking System (X0590, Dako Co., Danmark) og fedtfri mælk blokering blev anvendt før primære antistof inkubation. Muse anti-human IDO (MAB5412, Merck Millipore, Billerica, MA) (01:25) blev anvendt som det primære antistof til analyse af IDO ekspression. For at fuldende sandwich inkuberedes sektioner med LSAB + System-HRP reagenser (K0690; Dako Co, Danmark). Endelig blev DAB-substrat-kromogen anvendes til at fuldføre reaktionen (K346811; Dako Co., Danmark)

Statistical Analysis

Data er præsenteret som middelværdi ± SEM.. For parametriske data, blev envejs variansanalyse med parvise sammenligninger udføres i overensstemmelse med den Newman-Keuls formulering. For ikke-parametrisk data blev Kruskal-Wallis eller Wilcoxon anvendt. En p-værdi mindre end 0,05 blev betragtet som signifikant.

Resultater

TGF-β1 og MT hæmmer IDO udtryk

Inkubation af T24 celler med TGF-β1 faldet betydeligt IDO udtryk (figur 1), for alle testede koncentrationer. Som illustreret i fig 2A, behandling med MT og MT + TGF-β1 signifikant reduceret ekspression af IDO i T24-celler (relativ ekspression af 0,16 ± 0,18 vs. 1,00 ± 0,01). Denne virkning blev også observeret i resultaterne af Western blotting for IDO protein (figur 2B). For at vurdere IDO aktivitet, blev kynurenin målt i supernatanten af ​​T24 celler under anvendelse af HPLC. Koncentrationen af ​​kynurenin blev markant formindsket efter inkubation med MT, TGF-β1, og MT + TGF-β1 (0,59 ± 0,12 uM, 0,29 ± 0,02 uM, og 0,38 ± 0,06 uM henholdsvis vs. 3,45 ± 0,16 uM i Control ; p. 0,0001) (fig 2C)

IDO udtryk nedreguleres af TGF-β i T24 celler

(A) IDO udtryk ved real-time PCR, (B. ) Western blotting for IDO, og (C) IDO aktivitet vurderet ved kynurenin måling i supernatanten.

MT potenserer EMT genekspression

Et signifikant fald blev observeret i ECAD udtryk med MT og TGF-p1 behandlinger (fig 3A). I modsætning hertil Ncad ekspression steg signifikant med TGF-β1 behandling (Fig 3B), en virkning, der blev potenseret af kombinationen af ​​TGF-β1 med MT (mere end 8 fold vs. TGF-β1 alene). Endvidere blev ekspressionen af ​​EMT-associerede transkriptionsfaktorer (Twist, snegle og Slug) med TGF-β1, og behandling med TGF-β1 i kombination med MT intensiveret denne virkning (fig 3C, 3D og 3E).

relative mRNA-niveauer af (A) E-cadherin (epithelial markør), (B) N-cadherin (mesenchymale markør), og (CE) EMT-associeret transkriptionelle faktorer (Twist, snegle og Slug). Foreningen af ​​MT og TGF-β1 potenseret EMT i T24 celler, faldende E-cadherin ekspression og opregulering inductor gener af EMT. * P 0,05 vs. Kontrol;

# p 0,05 vs. MT;

† p 0,05 vs. TGF-β

siRNA-medieret knockdown af IDO og udtryk for EMT markører

Brugen af ​​siRNA var effektivitet i at lukke munden IDO genekspression. . Som vist i figur 4, siIDO faldt betydeligt ekspressionen af ​​IDO i T24-celler. En signifikant reduktion af IDO ekspression blev observeret efter stimulering med TGF-β1, hvorefter blev intensiveret, da forbundet med siIDO (figur 4). Med hensyn til EMT markører, siIDO væsentligt reduceret ECAD ekspression, og dets associering med TGF-β1 potenserer denne effekt blev imidlertid ikke statistisk signifikans fundet (Fig 5A). Selvom siIDO viste effekt på ECAD udtryk siIDO havde ingen effekt i ekspressionen af ​​N-cadherin og EMT transkriptionsfaktorer (Twist, Snail, og Slug) (figur 5).

En negativ kontrol-siRNA blev brugt for si-Control og TGF-beta betingelser. En signifikant reduktion af IDO ekspression blev observeret i siIDO celler, og i TGF-p-stimulerede celler. Associeringen af ​​siIDO og TGF-β inducerede en mere udtalt reduktion af IDO ekspression.

Relative mRNA-niveauer af (A) E-cadherin (epithelial markør), (B) N-cadherin (mesenchymale markør), og (CE) EMT-associeret transkriptionelle faktorer (Twist, snegle og Slug). siRNA-medieret knockdown af IDO var effektivt til at reducere E-cad-ekspression, og dets associering med TGF-β potenserede denne effekt. Imidlertid knockdown af IDO alene havde ingen virkning i N-cad-ekspression, såvel som i ekspressionen af ​​EMT-transkriptionsfaktorer. Kun TGF-β handlet inducere ekspressionen af ​​N-cad og EMT-transkriptionsfaktorer, og dets samarbejde med siIDO ændrede ikke denne effekt. * P 0,05 vs. Kontrol;

# p. 0,05 vs. MT

Scratch-sår og Transwell invasion analyser

I bunden-sår assay, migration kapaciteten af ​​T24 celler blev evalueret ved måle arealet besat af migrerende celler. Som vist i figur 6, 3 timer efter indførelse af scratch-sår, MT og TGF-β1 inducerede en hurtigere migration af T24-celler sammenlignet med ubehandlede celler. Den øgede migration proces blev intensiveret, når cellerne blev inkuberet med TGF-β1 plus MT (fig 6A og 6B).

(A) Billeder blev fanget ved 40X forstørrelse under et omvendt mikroskop, tre timer efter scratch dannelse. (B) Sårlukning var betydeligt hurtigere i MT + TGF-β i forhold til kontrol.

T24 celle invasion blev undersøgt ved hjælp af rekonstitueret Matrigel i Transwell kamre. Efter 6 timers inkubation blev forstærket invasion aktivitet observeret, når cellerne blev inkuberet med TGF-β1 plus MT, selv om resultatet ikke var statistisk signifikant (figur 7). Efter 24 timers inkubation blev ingen observerbar forskel påvist mellem de forskellige grupper (Fig 7).

Selv om en større grad af invasiv kapacitet blev observeret i T24-celler efter 6 timers TGF-β og MT + TGF β behandling, blev der ikke observeret statistisk signifikans. Efter en migrering periode på 24 timer, blev ingen forskel fundet.

Akt aktivering

At analysere Akt pathway aktivering, blev udført Western blotting eksperimenter. Som vist i figur 8, inkubation af T24 celler med MT, TGF-β1 eller MT + TGF-β1 fremmet robuste inhibering af Akt aktivering.

PI3K /Akt pathway aktivering blev bedømt ved Western blotting for Akt og phospho- Akt i T24 cellelysater. Efter 48 timers inkubering med MT, TGF-β, og MT + TGF-β, et nedsat niveau af phospho-Akt blev observeret. Hæmning af PI3K /Akt vej er forbundet med EMT i T24-celler.

In vivo

analyse

For at analysere IDO udtryk

in vivo

, T24-celler blev podet under nyrekapslen af ​​nøgne mus. Fire uger efter inokuleringen, vi identificeret T24 celler under nyrekapslen. Endvidere blev T24-celler fundet infiltrere den renale parenchym mod renale medulla (S1 Fig). Immunohistokemisk analyse af IDO ekspression afslørede, at subkapsulær og infiltrerende T24-celler var positive for IDO. Imidlertid blev ekspressionen af ​​IDO specifikt lokaliseret til centrum af cellen infiltrat (Fig 9).

IDO-positive celler blev fundet i infiltrat centrum (pil), mens IDO-negative celler overvejende blev fundet i periferien af ​​infiltrat (pilespids). IDO immunfarvning blev ikke observeret i den renale parenkym (stjerne).

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi den ikke-immunologiske rolle MT og IDO i kræft progression og formidling , især i EMT. Blærecarcinom T24 celler konstitutivt udtrykker IDO, selv i fravær af et immunsystem. Vi var i stand til at inducere EMT i T24-celler med TGF-β1, og denne virkning korrelerer med nedregulering af IDO. Når vi bruger MT eller IDO siRNA blev EMT forstærkes, især ved MT.

EMT er en proces, hvor epitelceller erhverve en invasiv fænotype, der fører til en systemisk spredning af maligne celler. Under EMT, er specifikke gener udtrykkes der i sidste ende fungerer at deregulere intracellulære biokemiske veje, som bidrager til etableringen af ​​en ondartet fænotype. I vores undersøgelse vurderede vi processen med reduceret ekspression af E-cadherin efterfulgt af øget N-cadherin ekspression, til en proces, der kaldes “cadherin switching,” karakterisere EMT i T24-celler [29]. EMT spiller en vigtig rolle i blærekræft, hvor der kræves motilitet, invasion og anti-apoptotiske mekanismer til metastase [30].

TGF-β1 er en potent inducer af EMT i visse vævstyper, herunder blære kræft. T24-celler udtrykker TGF-β-receptor 1, og siRNA-baseret inhibering af TGF-β-receptor 1 undertrykker motilitet og invasionsevne af disse celler [27]. I vores undersøgelse T24-celler erhvervet mesenchymal egenskaber, såsom mesenkymale markør ekspression og motilitet, efter TGF-β1 stimulus. Interessant, TGF-β1 behandling induceret EMT hæmmede IDO ekspression i T24-celler. Desuden MT, som også formindsket IDO ekspression intensiverede TGF-β-drevet EMT.

siRNA-medieret knockdown af IDO reducerede signifikant E-cadherin ekspression, men de mesenkymale markører blev ikke ændret. Fordi MT signifikant øget ekspression af mesenchymale markører indikerer disse resultater, at IDO pathway muligvis deltager i EMT af T24 celler, men MT har en virkning potentiering TGF-β1-inducerede EMT uafhængigt af IDO. Metz et al viste, at MT har virkning på dendritiske celler uafhængigt af IDO inducerer mTOR pathway (Metz). Det er vigtigt at bemærke, at mTOR er stærkt forbundet med EMT i blærecancer [31]. Det er muligt, at MT medierer mTOR pathway i T24 celler, men denne mekanisme blev ikke vurderet i vores undersøgelse.

Vores undersøgelse er den første til at undersøge forholdet mellem TGF-β1 og IDO i T24 celler. Men der er undersøgelser, der viser, at TGF-β1 kan modulere IDO ekspression i visse typer af celler. Yuan et al. viste, at medens IDO ekspression kan induceres i humane fibroblaster efter stimulering med INF-gamma, TGF-β1 ophæver denne virkning uden at påvirke INF-gamma-ekspression [32]. I modsætning hertil TGF-β1 inducerede IDO ekspression i dendritiske celler via PI3K /Akt og noncanonical NFK-p veje, der fører til en tolerogenisk fænotype [26]. De mekanismer, der forbinder TGF-β og IDO er ikke blevet helt klarlagt, men en mere plausibel mekanisme er blevet beskrevet af Pallotta og Grohmann [33]. Deres undersøgelser understøtter teorien om, at TGF-β giver regulatoriske virkninger på IDO syntese. Endvidere kan IDO udøve sin virkning gennem en mekanisme, der er uafhængig af dets enzymaktivitet [33].

I vores undersøgelse vurderede vi PI3K /Akt pathway aktivering anvendelse af Western blotting for Akt /phospho-Akt. Behandling med MT og TGF-β1 faldt betydeligt phospho-Akt niveauer, hvilket viser, at TGF-β-drevet EMT i T24-celler er forbundet med nedregulering af denne vej. I mange celletyper, er TGF-β-induceret EMT forbundet med PI3K /Akt pathway opregulering; men i T24 celler er det fortsat uklart. Al-Azayzih et al. analyserede phospho-Akt i T24-celler efter inkubation med TGF-β1 (som anvendt i vores eksperimenter, 5 ng /ml), og de var ikke i stand til at bestemme en forskel i phospho-Akt niveauer [34]. Fraværet af virkning på phospho-Akt niveauer kan skyldes længden af ​​TGF-β1 behandling. Mens de brugte en inkubationsperiode på 24 timer, vi brugte 48 timer. Endvidere Iliopoulos et al. brugte Akt – /- celler til at vise, at Akt1 knockdown fremmet TGF-β-induceret EMT i MCF10A celler. Denne virkning viste sig at være afhængig af ekspressionen af ​​specifikke microRNAer [35]. I den forbindelse kan den rolle Akt i EMT variere afhængigt af model-systemet.

Ud over cadherin skifte og væsentligt forøget ekspression af EMT-relaterede transkriptionsfaktorer (Twist, Snail, og Slug), T24 celler behandlet med TGF-β plus MT påviste øget vandrende kapacitet og invasionsevne. Foruden

in vitro

eksperimenter blev T24-celler inokuleret i nyrerne subkapsulær rum af nøgne Balb /c-mus. Efter 4 uger blev T24-celler observeret i den renale parenchym mod medulla. Immunohistokemisk analyse viste, at T24 celler i midten af ​​infiltrat var positive for IDO, mens perifere celler var IDO-negative. Det er muligt, at de perifere celler i infiltrat tabt IDO ekspression til at erhverve en invasiv fænotype. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at afklare denne mekanisme.

Som konklusion, MT og nedregulering af IDO er forbundet med EMT i T24 humane blærecarcinomceller, og denne effekt kan være udløst af TGF-β1. Selvom IDO hæmning er attraktive som anti-cancer terapi, fordi IDO fremmer tolerance over for tumorer, de nonimmunological effekter medieret af MT og andre IDO modulatorer fortjener overvejelse i blærekræft. Som perspektiv, skal hæmmere af IDO kombineres med andre klasser af lægemidler i anti-cancer terapi for at minimere eventuelle negative virkninger forårsaget af disse midler.

Støtte Information

S1 Fig. Histologi af nyrevævet efter subkapsulær podning af T24 celler.

At analysere T24 celle invasion

in vivo

, vi podet 1X10

6 celler under nyrekapslen. Histologi (hematoxylin og eosin-farvning) blev vurderet 28 dage efter inokulering. (A) T24 celler under nyrekapslen (pilespids), og (B) T24-celler infiltrerer den renale parenchym mod renale medulla (pil). Nedsat parenkym er angivet med stjerne

doi:. 10,1371 /journal.pone.0134858.s001

(TIF)

Tak

Vi er oprigtigt taknemmelig Angela Batista Gomes dos Santos og Samara for deres tekniske assistance.