PLoS ONE: Ron Knockdown og Ron monoklonalt antistof IMC-RON8 bevidstgøre kræft i bugspytkirtlen til histon-deacetylasehæmmerne (HDACi)

Abstrakt

Recepteur d’origine Nantais (Ron) er overudtrykt i et panel af bugspytkirtelkræftceller og vævsprøver fra patienter med pancreascancer. Ron kan aktiveres ved dets ligand makrofagstimulerende protein (MSP), for derved at aktivere onkogene signalveje. Krydstale mellem Ron og EGFR, c-Met, eller IGF-1R kan give en mekanisme bag resistens. Således kan målrette Ron repræsentere en hidtil ukendt terapeutisk strategi. IMC-RON8 er den første Ron monoklonale antistof (mAb) ind klinisk forsøg for at målrette Ron overekspression. Vores undersøgelser viser IMC-RON8 downmodulated Ron udtryk i bugspytkirtelkræftceller og signifikant blokeret MSP-stimuleret Ron aktivering, nedstrøms Akt og ERK fosforylering, og survivin mRNA-ekspression. IMC-RON8 hindrede MSP-induceret celle migration og reduceret celle transformation. Histondeacetylaseinhibitorer (HDACi) er rapporteret til at målrette ekspression af forskellige gener gennem ændring af nucleosomstørrelse histoner og ikke-histon proteiner. Vores arbejde viser HDACi TSA og Panobinostat (PS) faldt Ron mRNA og protein-ekspression i bugspytkirtelkræftceller. PS reducerede også nedstrøms signalering af Pakt, survivin, og XIAP, samt forbedret celle apoptose. Interessant PS reduceret kolonidannelse i Ron Knockdown celler i et større omfang end Ron scramble kontrolceller i kolonidannelse og bløde agarose assays. IMC-RON8 kunne også bevidstgøre bugspytkirtelkræftceller til PS, som afspejles af reduceret koloni tal og størrelse i kombinationsbehandling med IMC-RON8 og PS i forhold til enkelt behandling alene. Den co-behandling reduceres yderligere Ron udtryk og Pakt, og øget PARP spaltning forhold til enten behandling alene. Denne undersøgelse tyder på potentialet for en ny kombination tilgang, som i sidste ende kan være af værdi i behandlingen af ​​kræft i bugspytkirtlen

Henvisning:. Zou Y, Howell GM, Humphrey LE, Wang J, Brattain MG (2013) Ron Knockdown og Ron monoklonale antistof IMC-RON8 bevidstgøre kræft i bugspytkirtlen til histon-deacetylasehæmmerne (HDACi). PLoS ONE 8 (7): e69992. doi: 10,1371 /journal.pone.0069992

Redaktør: Lu-Zhe Sun, University of Texas Health Science Center, USA

Modtaget: 29, 2013; Accepteret: 13 Juni 2013; Udgivet: 29 juli 2013

Copyright: © 2013 Zou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Institutes of Health for finansiering: CA34432, CA38173, CA72001 og CA54807, tildelt MG Brattain. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er en yderst ondartet sygdom, med cirka 40.000 nye tilfælde diagnosticeres i USA i 2012 [1]. De fem-års overlevelse er meget lav ( 5%) [2]. I øjeblikket, mindre end 10% af patienterne er berettiget til kurativ kirurgi, mens mere end 90% med lokalt fremskreden eller metastaserende sygdomme behandles med strålebehandling og /eller kemoterapi [3]. Kræft i bugspytkirtlen til sidst udvikler resistens over for disse behandlinger. Molekylære undersøgelser viste, at genetiske og epigenetiske ændringer drev pancreascancer [4]. En bedre forståelse af det molekylære grundlag af kræft i bugspytkirtlen vil gavne udviklingen af ​​nye terapeutiske strategier.

For nylig har Ron blevet identificeret til at blive overudtrykt i en delmængde af bugspytkirtlen kræftpatienter og etablerede kræft cellelinjer [5], [ ,,,0],6]. Ron tilhører MET receptortyrosinkinase (RTK) -familien. Tidligere undersøgelser har vist, at Ron niveauer er forhøjede i mange epiteliale cancere, herunder bryst- [7], colon [8], lunge [9], og blære [10] cancere. Ron overekspression var prognostiske af ringe overlevelse og korreleret med sygdomsprogression [11].

Funktionelle undersøgelser viste, at Ron kan aktiveres af dens ligand MSP til at indlede en kaskade af molekylær signalering, herunder PI3K /Akt, MAPK, β catenin, JNK og FAK veje til at regulere forskellige cellulære funktioner [12]. MSP /Ron akse har vist sig at påvirke celle migration og invasion, og potentielt fremme tumormetastase [12], [13]. Nedregulering af Ron ved knockdown resulterede i reduceret celleproliferation, transformation, tumorvækst, metastase og øget celle apoptose i tyktarmskræft celler [14], [15]; og sensibiliserede bugspytkirtelkræftceller at gemcitabin [16]. Derfor Ron spiller en vigtig rolle i opretholdelsen af ​​maligne fænotyper i humane kræftformer. IMC-41A10 var den eneste humane anti-Ron mAb, som er blevet rapporteret at have anticanceraktivitet [17]. IMC-41A10 hæmmede MSP binding til Ron, reducerede MSP-medieret Ron phosphorylering, PI3K /Akt og MAPK aktivering og celle migration

in vitro

. For nylig blev et nyt humant mAb IMC-RON8 genereret og påbegyndt fase I klinisk forsøg som den første Ron mAb.

Lægemiddelresistens er en stor forhindring i kræftmedicin. Krydstale mellem RTK kan repræsentere en af ​​de mekanismer for resistens. Ron er blevet rapporteret til hetero-dimeriserer med c-Met [18], og cross-talk med EGFR [19], [20] for at aktivere RTK på gensidig vis. Integrin og IGF1-R kan også aktivere Ron gennem en MSP-uafhængig måde [21], [22]. Overekspression af Ron øget resistens til IGF1-R-inhibitor BMS-536.924 i barndommen sarkom [23]; mens knockdown af Ron sensibiliserede de resistente celler til BMS-536.924 [23]. Disse resultater understreger en potentiel fordel for rationelle kombinationsbehandlinger baseret på Ron tyrosin kinase netværk.

Epigenetisk ændringer, såsom acetylering og methylering, er de vigtigste post-translationelle modifikationer af de stærkt ladede lysin rester af kerne nukleosomale histoner. Ændringer histonacetylering er under kontrol for at modsætte aktiviteter histon acetytransferases (HATS) og histondeacetylaser (HDAC) [24], der bestemmer transkriptionel aktivering eller repression af genekspression. Hatte og HDAC spiller også en vigtig rolle i acetylering og deacetylering af ikke-histon proteiner [25], [26].

Overekspression af HDAC’er er fundet i colon, bryst, bugspytkirtel, og andre kræftformer [27] – [31], der tyder på, at de kan være attraktive anticancer mål. HDAC-hæmmere er rapporteret til at målrette ekspression af forskellige gener gennem ændring af nucleosomstørrelse histoner og ikke-histon proteiner. Den pan-HDACi TSA, Vorinostat, Belinostat og Panobinostat (PS) er blevet bredt undersøgt. PS udøvede robuste anticancer effekter i leukæmi celler gennem hyperacetylering af nucleosomstørrelse histoner og transkriptionel opregulering af p21 og p27 udtryk [32]. PS reducerede pancreas cancervækst gennem inhibering af celleproliferation og induktion af celleapoptose [33]. TSA forbedret respons bugspytkirtelkræftceller til konventionelle kemoterapier herunder 5-FU og gemcitabin [2], [34]. Imidlertid er de præcise mekanismer, der ligger HDACi behandling er stort set ukendte. Vores laboratorium viste, at HDACi Belinostat inducerede ekspression af epigenetisk tavs TGFp RII og derfor restaureret TGFp signalering medieret cellevækstinhiberingen i Smad4 vildtype (wt) bugspytkirtelkræftceller (fx MiaPaCa-2), [35]. Ron er stærkt udtrykt i Smad4 mutant bugspytkirtelkræftceller. Vildtype Smad4 ekspression blev rapporteret at undertrykke Ron ekspression [36]. Knockdown af Smad4 eller inhibering af TGFp-signalering førte til induktion af Ron ekspression. Undersøgelserne her viser, at HDACi PS og TSA nedreguleret Ron og dens nedstrøms signalering i bugspytkirtelkræftceller. Ron KD eller Ron mAb sensibiliserede bugspytkirtelkræftceller til PS. Oral PS har været anvendt i klinisk fase II forsøg i voksne patienter med refraktær /recidiverende Hodgkins lymfom og fase I forsøg til avanceret solid tumor [32]. Vores undersøgelser har udforsket en mulig mekanisme bag PS behandling af kræft i bugspytkirtlen og forudsat vigtigt bevismateriale for potentialet i en rationel kombinationsbehandling for Ron-udtrykkende bugspytkirtelkræftceller.

Materialer og metoder

Cell Cultures Salg

Humane pancreas cancercellelinier Capan-1 og CFPAC-1 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD), og L3.6pl celler stammede fra Dr. IJ Fidler [37]. Celler blev dyrket i SM-medium (McCoys 5A serumfrit medium med pyruvat, vitaminer, aminosyrer og antibiotika), suppleret med 10% FBS. Alle celler blev holdt i en befugtet atmosfære og 5% CO

2 ved 37 ° C.

Antistoffer og reagenser

Antistoffer for Ron C-20, survivin, MAPK og pErk1 /2 blev købt fra Santa Cruz Biotechnology Inc. Poly- (ADP-ribose) polymerase (PARP), Pakt (Ser

473), Akt, blev caspase 9 antistoffer fås fra Cell Signaling Technology. XIAP antistof var fra Abcam. Anti-pTry klon 4G10 blev købt fra Millipore. Antistof til actin blev købt hos Sigma

Rekombinant humant MSP blev indkøbt fra R

0,05. Alle forsøg blev gentaget tre gange uafhængigt af hinanden.

Resultater

IMC-RON8 Downmodulated Ron Expression og Hæmmet MSP-afhængige Ron Phosphorylering og Downstream signalering

For at vurdere effekten af ​​IMC- RON8 på Ron ekspression i Ron-overekspression bugspytkirtelkræftceller blev Capan-1 og CFPAC-1-celler behandlet med 100 nM af IMC-RON8 for forskellige tidsintervaller, efterfulgt af Western blot-analyse. Figur 1A viste, at Ron reduktion blev set efter 4 h behandling med IMC-RON8 og varede op til 48 timer i begge cellelinier. IMC-RON8 blev derefter evalueret for dets evne til at blokere Ron aktivering og dens nedstrømseffektorer, MAPK og Akt. CFPAC-1-celler blev serumudsultet natten over og behandlet med IMC-RON8 efterfulgt af MSP-stimulering i 30 minutter. Resultater fra IP (fig. 1B) viste, at IMC-RON8 selv ikke inducerede Ron fosforylering, hvilket indikerer, at IMC-RON8 ikke havde agonist effekt. Tyrosin fosforylering af Ron var signifikant forhøjet ved MSP stimulering, men stort set ophævet af IMC-RON8 behandling. En tidligere undersøgelse rapporterede, at MSP stimulation aktiverer Ron nedstrøms signalering P 3K /Akt og MAPK i bugspytkirtelkræftceller [6]. Derfor undersøgte vi rollen som IMC-RON8 på MAPK og Akt phosphorylering i Capan-1, L3.6pl og CFPAC-1-celler. Vores resultater viste, at alle de pancreatiske cancercellelinier vi undersøgte udviste en stærk MSP-afhængig phosphorylering af Akt og MAPK, og at IMC-RON8 behandling blokeret MSP-induceret Akt og MAPK-aktivering i alle cellelinjer (fig. 1C). For at bestemme om Ron aktivering kan øge survivin og XIAP udtryk, vi behandlede Capan-1 og CFPAC-1 celler med IMC-RON8 efterfulgt af MSP stimulering i 12 timer efter serum udsultning for natten. Resultaterne viste, at MSP-stimulering forøget survivin-mRNA-ekspression (fig. 1D), men ikke XIAP mRNA-niveau (data ikke vist). IMC-RON8 kan blokere denne forøgede survivin mRNA-ekspression. Vi har ikke observere betydelig stigning i XIAP og survivin proteinekspression efter MSP stimulation på western blotting.

A) Effekt af IMC-RON8 (100 nM) på Ron udtryk. Western blot for Ron. β-actin tjente som en loading kontrol. B) Effekt af IMC-RON8 om MFP-induceret Ron aktivering. Celler blev serum sultet natten over og behandlet med IMC-RON8 i 1 time efterfulgt af MSP stimulation til halv time. Cellelysater blev udsat for IP, og IB til pron. C) Effekt af IMC-RON8 på downstream signalering. Samme behandling som B). Western blot for pERK og Pakt. D) Ron aktivering og survivin mRNA-ekspression. Capan-1 og CFPAC-1-celler blev behandlet med IMC-RON8 efterfulgt af MSP-stimulering i 12 timer efter serumudsultning natten over. RT- qPCR blev udført på total RNA for at bestemme mRNA niveau af survivin. GAPDH mRNA blev anvendt som en intern kontrol.

IMC-RON8 Markant Hæmmet MSP-drevet Cell motilitet

For at vurdere effekten af ​​IMC-RON8 på celle motilitet, en transwell migration assay blev udført i Capan-1-celler med IMC-RON8 behandling i nærvær eller fravær af MSP. IMC-RON8 væsentligt reduceret MSP- induceret cellemigration i Capan-1-celler med 80~90% (fig. 2A).

In vitro

sårheling analyser yderligere bekræftet evne IMC-RON8 at blokere celle migration. Capan-1 celler stimuleret med MSP begyndte at migrere til sårområdet 24 timer efter bunden (fig. 2B). Såret blev næsten helbredt ved migrerende celler ved 48 timer efter MSP behandling, mens IMC-RON8 væsentligt reduceret celle mobilitet.

Capan-1 celler blev serum udsultet natten over. Cellemigrering vurderet ved transwell assay med MSP som en kemoattraktant i bundkammeret. A) Billeder af celler migreret til undersiden af ​​Transwell membran. B) Kvantificering af migrerede celler. C.

In vitro

sårheling assay.

HDACi nedreguleret Ron mRNA og protein Expression og Downstream Signaling

For at bestemme virkningen af ​​HDACi på Ron udtryk Capan -1, L3.6pl og CFPAC-1-celler blev behandlet med pan-HDACi PS til 8, 24 og 48 timer. Resultaterne viste, at PS depleteret Ron ekspression i alle Ron-udtrykkende celle undersøgte linjer (fig. 3A). Reduktion af Ron blev bemærket inden for 8 timer med tiltagende udtømning opstået over 48 h perioder (Fig. 3A). Den udtalte nedregulering af Ron blev også set i bugspytkirtelkræftceller behandlet med en anden pan-HDACi, TSA (fig. 3B), hvilket indikerer Ron reduktion er et fælles træk for Pan-HDACi behandling. Vi afgøres derefter, om ændringer i Ron protein var i det mindste delvist på grund af ændringer i dets transskription. Behandling med PS væsentligt reduceret mRNA-niveauet af Ron i en tidsafhængig måde (fig. 3C). Derudover celler behandlet med DMSO alene (solvens til PS og TSA) havde ingen indflydelse på Ron ekspression både på mRNA og protein niveauer. Tidligere undersøgelser har vist, at Ron fosforylering aktiverer en kaskade af downstream signalmolekyler, herunder Akt fosforylering [6], [15], [17]. Derefter bestemte vi effekten af ​​PS på nedstrøms cellesignalering. Capan-1, L3.6pl og CFPAC-1-celler blev behandlet med PS. Efter behandling i 8 og 24 timer, blev Akt fosforylering reduceret i en koncentrationsafhængig måde i alle 3 bugspytkirtelkræft cellelinier (Fig. 3D). PS behandling i 24 og 48 timer også reducerede både XIAP og survivin protein niveauer i en koncentrationsafhængig måde i bugspytkirtelkræftceller (fig. 3D).

A) bugspytkirtelkræft celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af PS for 8h, 24h, og 48 timer. Western blot for Ron udførtes. β actin tjente som lastning kontrol. B) Celler blev behandlet med TSA med IB for Ron. Betydeligt antal celler var døde (ca. 80%) i 1000 nM TSA-behandlede Capan-1-celler efter 48 timer. C) Celler blev behandlet med 50 nM af PS til 8, 24 og 48 timer. RT- qPCR blev udført på total RNA for at bestemme mRNA niveau af Ron. GAPDH mRNA blev anvendt som en intern kontrol. D) Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af PS ved de angivne tidspunkter. Western blot for Pakt, XIAP og survivin ekspression. B-actin blev anvendt en belastning kontrol.

PS Reduceret Cell vækst og øget Cell Apoptose Gennem Induktion af Cell Cycle Regulator p21 og Caspase Aktivitet

Funktionen af ​​IAP familiemedlemmer XIAP og survivin er at inhibere caspase 3, 7, 9-aktivitet og caspase-afhængig celle apoptose ved binding til de aktive caspaser [42]. Vi viser, at efter 48 inkubering PS reduceret celleproliferation (fig. 4A) og øget celle apoptose (fig. 4B) på en koncentrationsafhængig måde i alle 3 celle testet som bestemt ved MTT og DNA-fragmentering linjer. Tidligere undersøgelser rapporteret, at HDACi behandling resulterer i forringet proliferation af bugspytkirtelkræftceller grund af en standsning i cellecyklus og induktion af caspase-afhængige programmeret celledød [33]. Vi har registreret en stigning i cyklin-afhængige kinase inhibitor (CDK) p21 i bugspytkirtelkræftceller efter HDACi behandling (fig. 4C). Øget Capase-9 og PARP-spaltning efter caspaseaktivering blev også observeret i Capan-1 og L3.6pl celler (fig. 4C). Vi fandt, at i CFPAC-1-celler, blev forøget caspase 9 spaltning kun påvist ved høje koncentrationer af PS behandling efter 48 timer, men ikke efter 24 timer. Tilsvarende blev PARP-spaltning kun set ved den høje koncentration af PS behandling i CFPAC-1-celler, hvilket viser, at CFPAC-1-celler er relativt resistente over for PS-induceret-celle apoptose sammenlignet med Capan-1 og L3.6pl celler.

Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af PS, A) cellevækst blev målt ved MTT; B) celleapoptose blev målt ved DNA-fragmentering; C) Western blots for p21, og caspaseaktivitet (PARP og caspase 9 spaltninger). B-actin blev anvendt som en belastning kontrol.

Ron Knockdown eller Ron mAb IMC-RON8 Sensitized bugspytkirtelkræftceller til PS Behandling

Både IMC-RON8 og PS downmodulated Ron udtryk. IMC-RON8 reducerer onkogen signalering gennem Pakt og pERK og hæmmer celle migration i bugspytkirtelkræftceller. Imidlertid IMC-RON8 ikke påvirke celleproliferation og celle apoptose

in vitro

som det fremgår af MTT, PARP og caspase 9 spaltninger, som er den samme for Ron knockdown (data ikke vist). PS Men inducerer betydeligt celle apoptose og reducerer celle proliferation i bugspytkirtelkræftceller. Kombinationen mellem Ron knockdown eller IMC-RON8 og PS kan kompensere for den manglende hæmning af celle overlevelse i Ron målrettet IMC-RON8 eller Ron knockdown. For at bestemme de proliferative virkninger af Ron knockdown og PS behandling blev en standard kolonidannelse assayet udføres. Først blev forvrænget (SC) og Ron shRNA plasmider leveres ind L3.6pl celler ved transfektion-infektion for at etablere L3.6pl SC kontrol og Ron knockdown stabile cellelinjer. Single cellekloner A6 og B21 blev udvalgt efter puromycin behandling. Ron shRNA specifikt slået ned Ron ekspression, eftersom c-Met, som har høj sekvensidentitet med Ron, viste ingen ændring (fig. 5A). Derefter L3.6pl SC og Ron KD kloner A6 og B21-celler blev behandlet med lave koncentrationer af PS. Resultaterne viste, at både L3.6pl SC og Ron KD cellevækst blev væsentligt inhiberet af PS i en koncentrationsafhængig måde (fig. 5A). PS behandling ved samme koncentration reduceret kolonidannelse i Ron KD L3.6pl celler i et større omfang end Ron SC kontrolceller (fig. 5A). Ron KD selv ikke ændre celledeling i bugspytkirtelkræftceller. Dernæst udføres bløde agarose assays til yderligere bestemme transformation egenskaber L3.6pl celler med Ron KD og PS behandling. Figur 5B viste, at L3.6pl Ron KD kloner producerede færre kolonier (30-40%) end Ron SC celler i blød agarose. PS signifikant reduceret dannede kolonier i begge L3.6pl Ron SC og KD cellekloner (fig. 5B). Interessant, PS behandling medførte signifikant længere færre koloni numre i L3.6pl Ron KD celler end i L3.6pl SC celler på alle PS koncentrationer (fig. 5B). Størrelserne af kolonier i PS behandlet L3.6pl Ron KD-celler var naturligvis mindre end PS behandlet SC-celler (data ikke vist). For yderligere at fastlægge den rolle, Ron i bugspytkirtelkræft, blev IMC-RON8 introduceret til at måle potentielle kombinationseffekter sammen med PS. I begge L3.6pl (fig. 5C) og CFPAC-1 (fig. 5D) celler, kunne blokade af Ron med IMC-RON8 reducere kolonidannelse i sammenligning med kontrollerne uden behandling (op til 50%). Kombinationsbehandling med PS og IMC-RON8 yderligere genereret signifikant færre koloni numre med mindre størrelse end enkelt lægemiddel behandling alene i både L3.6pl og CFPAC-1 celler (fig. 5C og 5D).

A) L3. 6PL celler blev stabilt transficeret med Ron SC og shRNA plasmider. Ron KD kloner A6 og B21 blev udvalgt til klongenicitetsassayet: L3.6pl Ron SC og KD kloner A6 og B21 blev behandlet på dag 2 med PS ved angivne koncentrationer i 48 timer. Efter vask blev celler dyrket i yderligere 10 dage i 10% FBS indeholdende medium. Cell kolonier blev visualiseret efter MTT farvning og kvantificeret i DMSO. B). Forankringsuafhængig vækst af L3.6pl SC og Ron KD kloner behandlet med PS blev bestemt som beskrevet i Materialer og Metoder. Soft argrose assay blev også udført for C) L3.6pl celler og D) CFPAC-1 celler behandlet med enten IMC-RON8 eller PS alene eller deres kombinationer.

Mekanismerne ligger til grund IMC-RON8 sensibilisering af bugspytkirtelkræftceller til PS

for at bestemme virkningen af ​​kombinationsbehandling med PS og IMC-RON8 om Ron udtryk Capan-1, L3.6pl og CFPAC-1 celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af IMC-RON8 , PS eller deres kombination. Vi fandt, at Ron blev nedbrudt af IMC-RON8 efter 24h behandling (fig. 6A). PS enkelt behandling reducerede Ron, Pakt og øget PARP-spaltning. Men samtidig behandling sænkes yderligere Ron udtryk (fig. 6A), sammenlignet med enkelt behandling alene i alle tre bugspytkirtelkræft cellelinier vi undersøgte. Endvidere co-behandling også yderligere reduceret Pakt og øget PARP-spaltning (Fig 6B). Disse kan forklare den reducerede koloni dannelse i kombinationsbehandling i forhold til monoterapi alene.

A) Ron udtryk efter samtidig behandling af Capan-1, L3.6pl og CFPAC-1 celler med IMC-RON8 og PS. B) Effekt af co-behandling af IMC-RON8 og PS på Pakt og PARP spaltning. β-actin blev anvendt som en belastning kontrol.

Diskussion

Denne undersøgelse identificerede en potentiel ny behandlingsmetode i bugspytkirtelkræft hjælp af en kombination strategi gennem udnyttelse både genetiske og epigenetiske egenskaber. Pancreas cancer er en af ​​de mest udfordrende problemer i cancerbehandling. Aktuel kemoterapi ved gemcitabin har en meget lav svarprocent ( 20%) og resistens udvikler hurtigt resulterer i fiasko behandling [2]. Således er der et akut behov for nye terapeutiske strategier.

Ron er for nylig blevet rapporteret at være stærkt udtrykt i bugspytkirtelkræftceller og patientprøver [5], [6]. Stimulering med MSP aktiverer Ron og dens downstream signalering, herunder P 3K /Akt og MAPK og fremmer celle migration og invasion. Men Ron aktivering havde ingen effekt på proliferation i bugspytkirtelkræftceller [6]. Knockdown af Ron har vist øget følsomhed over for apoptose af tyktarmskræft celler til vækst faktor afsavn stress gennem mutant p110α aktivering [14], [15]. Men bugspytkirtelkræftceller ikke indeholde p110α mutationer. Ron KD havde ingen effekt på celledeling og apoptose som vurderet af MTT, PARP og caspase 9 spaltninger

in vitro

(data ikke vist) i bugspytkirtelkræftceller.

Vores undersøgelser her viste, at IMC -RON8 downmodulated Ron udtryk, som var i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, at muse-anti-Ron mAbs Zt /G4, ZT /f2 og ZT /C9 reducerede Ron udtryk i colon cancerceller [43]. Humant mAb IMC-41A10 effektivt reducerede MSP-medieret Ron aktivering og dens downstream PI3K /Akt og MAPK aktivering [17]. MAPK signalering reduktion af IMC41A10 fremgik af pERK reduktion i alle kræft cellelinjer valgt. Men effekten af ​​IMC41A10 på Pakt er ikke konsekvent i alle cellelinjer. For eksempel IMC41A10 haft stor betydning for reduktion af Akt aktivering i HT29, Du-145 og AGS, mens IMC-41A10 ikke ændrede Pakt i andre celler, herunder kræft i bugspytkirtlen cellelinie BxPC3 [17].

IMC-RON8, en anden fuldt humant anti-Ron mAb, vises antitumoraktivitet mod human colon, lunge og pancreas xenografter i nøgne mus [44]. Vore studier her vist, at IMC-RON8 effektivt hæmmede Ron fosforylering i CFPAC-1 celler, samt downstream pMAPK og Pakt aktivering i alle de bugspytkirtelkræft cellelinjer vi undersøgte herunder BxPC3 (data ikke vist). Dette indikerede, at IMC-RON8 er funktionelle for at hæmme MSP-medieret signalveje og udviser stærk effekt med hensyn til at blokere PI3K /Akt pathway.

Tidligere arbejde fra vores laboratorium, og andre har vist, at Akt aktivering er knyttet til