PLoS ONE: Identifikation af Protein Biomarkører for livmoderhalskræft Brug Menneskelig Cervicovaginal Fluid

Abstrakt

Mål

Cervicovaginal væske (CVF) kan betragtes som en potentiel kilde til biomarkører for sygdomme i den nedre kvindelige reproduktive tarmkanalen. Væsken kan let opsamles og dermed tilbyde nye muligheder såsom udvikling af selvtest. Vores mål var at identificere en CVF protein biomarkør for livmoderhalskræft eller dets præcancer tilstand.

Metoder

En differentieret proteomics undersøgelse blev oprettet ved hjælp af CVF prøver fra raske og forstadier til kvinder. Label-fri spektral optælling blev anvendt til at kvantificere protein mængderne.

Resultater

proteomanalyse afslørede 16 kandidat biomarkører for hvilken

alpha-actinin-4

(p = 0,001) og

pyruvatkinase isozym M1 /​​M2 Hotel (p = 0,014) var mest lovende. Verifikation af

alpha-actinin-4

ved ELISA (n = 28) viste, at denne kandidat biomarkør diskriminerede mellem prøver fra raske og både lav risiko og HPV-inficerede kvinder højrisiko (p = 0,009). Yderligere analyse af langsgående prøver (n = 29) viste, at

alpha-actinin-4

niveauer korreleret med virus vedholdenhed og clearing, med en diskrimination på ca. 18 pg /ml.

Konklusioner

Vores resultater viser, at CVF er en glimrende kilde til protein biomarkører for detektion af lavere genital tarmkanalen patologier kvindelige, og at

alpha-actinin-4

afledt fra CVF er en lovende kandidat biomarkør for præcancer tilstand livmoderhalskræft. Yderligere undersøgelser vedrørende følsomhed og specificitet af denne biomarkør vil demonstrere dens anvendelighed til at forbedre de nuværende screeningsprogrammer og /eller dets anvendelse til en livmoderhalskræft selv-diagnose test

Henvisning:. Van Raemdonck GAA, Tjalma WAA, Coen EP, Depuydt CE, Van Ostade XWM (2014) Identifikation af protein Biomarkører for livmoderhalskræft Brug Menneskelig Cervicovaginal Fluid. PLoS ONE 9 (9): e106488. doi: 10,1371 /journal.pone.0106488

Redaktør: Rakesh N. Veedu, The University of Queensland, Australien

Modtaget: Marts 24, 2014 Accepteret: August 1, 2014; Udgivet 12. september, 2014

Copyright: © 2014 Van Raemdonck et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. GVR modtaget en bevilling fra Institut for Videnskab og Teknologi (https://www.iwt.be/english/welcome) (projekt nr . 093.132). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Christophe Depuydt erklærer, at han er en arbejdsgiver af Sonic Healthcare Benelux, Emiel Vloorstraat 9, 2020 Antwerpen, Belgien, og at den bedste overbevisning, er der ingen modstridende interesser, heller ikke økonomisk, faglig eller personale, mellem hans virksomhed i Sonic Healthcare Benelux og dette manuskript [pone-D-14-13.187] ( “Identifikation af protein biomarkører for livmoderhalskræft ved hjælp af menneskelige cervicovaginal væske “). Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

human papillomavirus (HPV) er ansvarlig for stort set alle livmoderhalskræft [1]. Selv om mere end 150 varianter af denne virus eksisterer, anvendes kun visse genotyper, såsom HPV 16, 18, 33, 45 og 58, er kendt som høj-risiko typer (HR-HPV) [2]. HPV-typer med lav risiko (LR-HPV), hovedsageligt HPV 6 og 11, sjældent forårsager genitale tumorer; dog, de forårsager kondylomer acuminata (anogenitale vorter) [3]. Persisterende HPV oncoprotein ekspression (E6 /E7) i HPV-inficerede epiteliale basale celler deregulerer celledeling [4]. Overekspression af disse virale gener forårsager deregulering af celleproliferation, metabolisme, apoptose, differentiering og genomisk ustabilitet, som alle kan føre til på hinanden følgende stadier af cervikal intra-neoplasi (CIN1, 2 og 3) eller skællede intra-epitheliale læsioner (lav -Grade SIL og high-grade SIL). Ca. 85% af alle seksuelt aktive personer vil blive udsat for HPV, og størstedelen af ​​alle HR-HPV-infektioner er virion producerer (som er begrænset i tid) tyder på, at der ud over den virale genotype er flere cofaktorer tæt forbundet med vedholdenhed de virale oncoproteiner og omdannelsen af ​​den cervikale slimhinde til malignt væv [5], [6].

Der er flere grunde til udviklingen af ​​et diagnostisk assay, baseret på cervicovaginal fluid (CVF), for tidlig påvisning af livmoderhalskræft ville være gavnligt. I første omgang aktuelle screeningsassays ikke er optimale. På grund af den høje forekomst af livmoderhalskræft, er kvinder mellem 25 og 65 ofte screenet under anvendelse Pap (anicolaou) udstrygninger, en test, som er baseret på påvisning af morfologiske ændringer i livmoderhalsen slimhindeceller. Desværre kan den lave følsomhed denne test resultere i livmoderhalskræft diagnosticeret på et sent tidspunkt [7]. Data om randomiserede forsøg viser, at HPV-DNA-screening er mere følsom end cytologi, men specificiteten er lavere, hvilket uundgåeligt vil resultere i en overbehandling fordi ca. 80% af HPV-positive patienter spontant rydde [3] virus. Derudover colposcopic undersøgelse er arbejdskrævende, vanskelig at automatisere og sårbare over for inter- og intra-observatør variation [8]. Indførelsen af ​​en ny biomarkør, der hjælper forbedre sensitivitet og specificitet af de nuværende screeningsprogrammer er derfor mere end velkommen. Den anden grund ligger i anvendeligheden af ​​CVF til diagnosticering. Fordi væsken let kan opsamles ved den enkelte ved hjælp af specielle indretninger [9], en hurtig og simpel test på grundlag af en dipstick assay udføres af kvinden selv, kunne udvikles. Sådan en selvtest kunne indføres f.eks i ressource-begrænset befolkningsgrupper, hvor ulige byrde af livmoderhalskræft ofte forekommer. Faktisk anslås det, at kun 5% af kvinderne i ressourcesvage lande screenes passende for livmoderhalskræft [10]. Mangel af sundhedsydelser infrastruktur og finansielle omkostninger er de vigtigste grunde til, cytologi-baserede programmer, der ikke gennemføres. Da alternative metoder i øjeblikket undersøges i disse regioner, kunne betragtes brug af en CVF-baserede selv-diagnose test. Derudover kunne selvtest også bruges i opfølgende undersøgelser af vaccinationsprogrammer, da effekten af ​​vaccination i seksuelt aktive kvinder er usikker [11]. Desuden nuværende vacciner kun adresse neoplasi-fremkaldende genotyper HPV 16 og -18 tyder på, at under ideelle omstændigheder, kan kun højst 70% af alle tilfælde af livmoderhalskræft forebygges [7], [12]. Således i det mindste for de kommende årtier, er nøje vurdering af vaccinationsprogrammer stærkt anbefales og en enkel selvdiagnosetest kunne hjælpe en masse i møde dette spørgsmål.

Tidligere blev flere proteomics studier udført for at identificere biomarkører til (tidligt) påvisning af livmoderhalskræft neoplasi. I forskellige forsøg, præcancerøse og sund cervikal væv blev sammenlignet og Lee

et al.

Studerede

in vitro

bidrag oncoprotein E7 til udviklingen af ​​cervikal neoplasi anvendelse af en HPV-inficeret cellelinje [ ,,,0],13] – [20]. Adskillige markører, der var knyttet til dysregulering af den normale cellecyklus, såsom p16, Ki67 og cyklin E blev karakteriseret. Disse resultater førte til en bedre forståelse af HPV-induceret carcinogenese, men indtil videre har de alle udviste lav følsomhed og /eller specificitet og derfor ikke kunne anvendes i klinikken.

For biomarkør opdagelse og validering, kropsvæsker er bedre end vævsprøver fordi de følgende fordele ligger fleste kropsvæsker: (1) let tilgængelighed; (2) undgåelse af risici prøveudtagning; og (3) flere muligheder prøvetagning [21]. I dag, plasma er den mest analyserede biologiske væske i søgningen efter biomarkører, og det er allerede blevet anvendt i livmoderhalskræft forskning [22], [23]. Men plasma kommer i kontakt med næsten alle organer i kroppen, hvilket gør plasma biomarkører mindre specifik, fordi det er vanskeligt at afgøre, fra hvilket organ de stammer [21].

CVF kan opnås ved cervicovaginal skylninger, vaginale podninger , tamponer eller med en anordning for selvstændige prøvetagning [9], [24] og har følgende fordele i forhold til plasma: (1) det besidder en lavere væskevolumen /orgel-forholdet i forhold til plasma, hvilket resulterer i højere følsomhed; og (2) det kommer i kontakt med færre organsystemer, som sandsynligvis øger specificiteten af ​​de markører [21], [25]. I denne undersøgelse har vi fokus på identifikation af kandidat biomarkører for livmoderhalskræft neoplasi ved at sammenligne protein sammensætning af individuelle CVF prøver fra raske og præcancer (LSIL og HSIL) kvinder. Vores resultater viser, at

alpha-actinin-4

(ACTN4) er en lovende kandidat biomarkør for præcancer tilstand af livmoderhalskræft, og at denne CVF protein er meget velegnet til at udvikle en selvstændig diagnose test.

Materialer og metoder

undersøgelse design og prøvetagning

Alle patienter enige om at deltage ved skriftligt samtykke og undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i Antwerpen universitetshospital (registreringsnummer : B30020108372). Undersøgelse-specifikke patientidentifikationskoderne blev tildelt og transmitteres på en sådan måde, at patient fortrolighed blev bevaret.

Alle prøver i denne prospektive, blindet, kohorteundersøgelse blev taget af den samme gynækolog (Waat). I tilfælde af unormale celleprøve resultater (på grund af HPV-infektion eller som en falsk positivt resultat), er både sunde og præcancerøse patienter rutinemæssigt underkastes en colposcopic undersøgelse, en procedure, der indbefatter skylning af skeden med 5% eddikesyre. Efter colposcopy denne vask væske (indeholdende den cervicovaginal væske) er normalt kasseres, men blev indsamlet til proteomisk analyse. Derudover blev cervikale cytologiske prøver indsamlet i løbet af denne colposcopic undersøgelse for at fastslå cytologi og HPV status som tidligere beskrevet ved hjælp af typespecifikke PCR’er [26]. Alle BD-SurePath flydende baserede cytologiske prøver blev sendt til patologi laboratorium (RIATOL, Institut for Molekylær Diagnostik, Sonic Healthcare Benelux, Antwerpen, Belgien) til forarbejdning. Baseret på en kombination af colposcopic resultater, cytologi resultatet og HPV genotypebestemmelse, sunde og forstadier kvinder kunne identificeres på en pålidelig måde. Vi valgte prøver stammer fra seks sunde (normal colposcopy /cytologi og HPV negativ, gruppe A) kvinder og 6 præcancerøse (unormal colposcopy /cytologi og HR-HPV positive, gruppe B) individer (tabel 1). Alle prøver blev afledt af postmenopausal ( tre år efter de sidste menstruation) kvinder fra tilsvarende alder (59 +/- 13 år). Patienter, som brugte medicin blev udelukket fra undersøgelsen. Desuden blev patienterne, som viste synlige tegn på gynækologiske infektioner (fx gonoré) eller lidt en HIV-infektion er udelukket som godt. Baseret på de cervicovaginal væskeprøver blev patienterne screenes for Trichomonas vaginalis. Under proteomikanalyser blev sunde og forstadier til CVF prøver altid analyseres i par for at minimere de tekniske variationer af LC-MS /MS-platformen.

proteomiske analyse

Efter samling, de cervicovaginal skylninger (25-40 ml) blev straks transporteret på is til laboratoriet og opbevaret ved -80 ° C. Efter centrifugering blev supernatanten koncentreret ved lyofilisering til et endeligt volumen på ca. 200 pL. Proteinprøver (1 mg /prøve) blev separeret og fraktioneret i den første dimension på en omvendt fase (RP) protein C4 HPLC-søjle. Enzymatisk spaltning med trypsin blev udført, og de resulterende peptider af hver fraktion blev adskilt i en anden dimension på en RP-C18 mikro-kapillar HPLC-system. Massespektrometrisk analyse blev udført under anvendelse af et MALDI-TOF /ToF instrument. Resulterende MS /MS Spectra fra hver prøve blev screenet mod den humane Swiss-Prot database (version: 57,1) ved hjælp af MASCOT søgemaskine. Analyse af de opnåede datasæt blev udført som tidligere beskrevet [25]. Nærmere oplysninger kan findes i dokumentet S1 og figur S1.

enzymbundet immunsorbentassay

For at bekræfte LC-MS /MS-resultater, enzymforbundet immun sorberende assays (ELISA) blev udført for

alpha-actinin-4

(ACTN4) og

pyruvatkinase isozym M1 /​​M2 Hotel (PKM2), i henhold til producentens anvisninger. Et humant ACTN4 ELISA-kit (Cusabio Biotech Co. LTD.) Og en human PKM2 ELISA-kit (USCNK Life Science Inc.) blev anvendt til at kvantificere ACTN4 og PKM2 i cervikale vaginale vaske fra sundt (n = 16) og HPV-inficerede (n = 12) kvinder (både præ- og postmenopausale). Derudover flere langsgående prøver (n = 29) blev også testet for disse to kandidat biomarkører.

Statistik

For at afgøre, om forskellen i protein mængderne var betydelig, normaliserede spektre overflod faktorer (NSAF værdier ) blev underkastet statistisk test. Fordi de udvalgte proteiner blev identificeret i flere prøver, og derfor også indeholdt flere NSAF-værdier, blev en ikke-parametrisk Mann-Whitney U-test anvendt. Desuden blev en chi-square test, hvorved frekvensen af ​​alle identificerede proteiner blev analyseret for at bestemme, om visse proteiner var mere eller udelukkende påvist mere under visse betingelser. Uparret Students t-test blev udført for at analysere de ELISA-resultater. Alle statistiske tests blev udført ved hjælp af statistiske Package of Social Science (SPSS-version 18).

Resultater

Differential undersøgelse til karakterisering af livmoderhalskræft biomarkører

For at identificere forskelligt rigelige proteiner, blev 12 prøver delt i to grupper og blev individuelt analyseret ved anvendelse af en analytisk proteomics platform (tabel 1). Gruppe A består af 6 prøver fra raske individer, hvorimod gruppe B bestod af 6 prøver fra præcancerøse individer. Proteomisk Analysen resulterede i 846 og 825 identifikationer for gruppe A og gruppe B,, altså 371 (gruppe A) og 341 (gruppe B) ikke-redundante proteiner (figur 1). Den gennemsnitlige overlap mellem alle prøver fra gruppe A var 54%, og fra gruppen var B 53% (tabel S1).

For de sunde proteom 371 unikke proteiner identificeret, mens 341 unikke proteomer for præcancer proteomanalyse. En overlappende sæt af 238 proteiner blev fundet i begge proteomer.

En semi-kvantitativ analyse blev også udført baseret på etiketten-fri NSAF metode (tabel S2). For begge grupper, de NSAF værdier af proteinerne til stede i mindst 5 af de 6 prøver blev gensidigt forhold. Variationen i protein overflod mellem prøver blev udtrykt som variationskoefficienten (CV). En gennemsnitlig CV på 60% (lavest: 19%; højest: 134%) blev opnået for gruppe A (sunde), mens en gennemsnitlig CV på 52% (lavest: 14%; højest: 99%) blev noteret for gruppe B .

Identifikation af forskelligt rigelige proteiner

for at identificere kandidat biomarkører, der korrelerer med præcancer tilstand af livmoderhalskræft, sunde og forstadier til CVF proteomer blev sammenlignet. blev udført en kvalitativ analyse mellem de 371 identificerede proteiner til den sunde gruppe, og de 341 identifikationer for præcancer gruppe, hvilket resulterede i 238 eller 67% overlappende proteiner. For at identificere proteiner med en statistisk signifikant forskel på forekomsten blev alle identifikationer udsat for statistisk test ved hjælp af en Pearson chi-square test. Proteiner med en p-værdi ≤0.05 listet (tabel 2). Ud fra disse beregninger blev ACTN4 identificeret i alle prøver fra forstadier patienter, men ikke i prøver fra raske patienter. Desuden ACTN4 primært identificeret baseret på flere unikke peptider med en gennemsnitlig MASCOT protein score på 162 (tabel S3). Forskellen i overflod af dette protein blev yderligere bekræftet ved ELISA (se nedenfor).

Desuden blev en semi-kvantitativ sammenligning udført for at bestemme, hvorvidt visse proteiner, som blev identificeret i både sunde og de præcancerøse grupper blev differentielt udtrykt. De NSAF-værdierne af tilsvarende proteiner blev statistisk testet ved anvendelse af en Mann-Whitney U-test. Kun proteiner med en statistisk signifikans på p ≤ 0,05 listet (tabel 3). Denne beregning resulterede i fire proteiner, der blev karakteriseret ved en betydelig forskel i overflod mellem begge betingelser. Kun ét protein,

haptoglobin

, viste en nedregulering i præcancer tilstand, mens tre andre proteiner,

ATP syntase subunit beta

,

annexin A2

og PKM2 blev opreguleret. PKM2 og

annexin A2

viste den laveste p-værdi (0,01 og 0,03, henholdsvis) og blev påvist i 5 af 6 prøver fra præcancer gruppe. Fordi meget varierende proteiner er ikke egnede kandidat biomarkører, blev variationen i mængderne af disse proteiner beregnes. Med CV-værdier på henholdsvis 40% og 29% for sunde og præcancer gruppe for PKM2 henholdsvis dette protein er mere egnet som en kandidat biomarkør sammenlignet med

annexin A2

, som havde værdier på 77% og 48%, henholdsvis.

Verifikation af kandidatlandene biomarkører

Et ELISA blev udført for at kontrollere differentierede profiler af ACTN4 og PKM2. Sund (n = 16) og HPV-inficerede prøver (både HR-HPV onkogen (n = 8) og LR-HPV ikke-onkogene prøver (n = 4)), som ikke var inkluderet i de tidligere forsøg, blev testet under anvendelse af kommercielt tilgængelige kits (tabel 4).

Niveauer af ACTN4 var signifikant højere i prøver fra HR-HPV inficerede individer sammenlignet med prøver fra raske, ikke-HR-HPV-inficerede patienter (p = 0,023), som bekræftet vores LC-MS /MS resultater. Bemærkelsesværdigt, prøve én, der stammer fra en ikke-HR-HPV-inficerede patient, synes at være en outlier grund af den høje ACTN4 koncentration på 85,6 pg /ml (se diskussionen). Derudover LR-HPV-inficerede patienter havde højere koncentrationer ACTN4 sammenlignet med de ikke-HPV-inficerede patienter (p = 0,052), men noget lavere værdier sammenholdes med HR-HPV-inficerede patienter (p = 0,114). Sammenligning af ACTN4 niveauer i HPV-inficerede (både HR- og LR-infektioner) versus ikke-inficerede prøver (raske patienter) viste en signifikant forskel, med en p-værdi på 0,009 (figur 2). Den højeste ACTN4 koncentration for den raske gruppe (med undtagelse af outlier) var 17,3 pg /ml, mens den laveste koncentration for HR-inficerede gruppe var 30,6 pg /ml. Den laveste koncentration af ACTN4 i LR-inficerede gruppe var 21,3 pg /ml, hvilket er højere end den højeste værdi af den sunde gruppe. Baseret på disse observationer, kan en tærskel på 18 pg /ml sættes som den største værdi af ACTN4 for den ikke-inficerede tilstand. Ingen lineær korrelation blev fundet mellem den virale belastning og den absolutte koncentration af ACTN4, hvilket forudsætter, at ACTN4 ikke bare er en markør for HPV-infektion, men snarere for præcancer fase.

Koncentration af ACTN4 for de raske individer (n = 16), HR-HPV-inficerede patienter (n = 8) og den inficerede patienter LR-HPV (n = 4). Statistisk test af ACNT-4 niveauer mellem sunde og HR-HPV inficerede patienter resulterede i en p-værdi på 0,023 og mellem sunde versus LR-HPV i en p-værdi på 0,052. Når HR- og LR-HPV-inficerede patienter blev grupperet som HPV inficerede patienter blev en p-værdi på 0,009 fundet mellem ikke-inficeret (raske patienter) og inficerede grupper.

Desuden mest lovende semikvantitativ kandidat, PKM2, blev verificeret med et kommercielt ELISA-kit. Til denne analyse blev de samme 28 prøver anvendt; imidlertid blev de LC-MS /MS resultater ikke bekræftet (data ikke vist).

Vi analyserede derefter de ACTN4 koncentrationer i yderligere 29 langsgående prøver (dvs. prøver fra den samme patient på flere tidspunkter) fra 9 patienter. For hver patient blev mindst tre langsgående prøver evalueret (figur 3). Fra disse ni patienter, fem patienter ryddet virus, to patienter havde persisterende HPV-infektion, en patient erhvervet en ny HPV-infektion og en patient var sund. Selvom antallet af patienter i hver gruppe er små, kan disse prøver hjælper os med at bekræfte vores resultater. En ACTN4 ELISA blev udført på flere af prøverne for at identificere sammenhænge mellem virus profiler og ACTN4 niveauer inden for én patient. Men udover virustiteren, forventede vi også genotypen og tidspunktet for infektion at påvirke ACTN4 ekspression fordi forskellige typer virus har forskellige kræftfremkaldende kapacitet og livmoderhalskræft normalt efter en vedvarende HR-HPV [2] infektion. For nylig blev det vist, at udviklingen af ​​livmoderhalskræft præcancer (cervikal intraepithelial neoplasi af grad tre; CIN3) indledes med en støt stigning i den virale belastning af en given HR-HPV-type, mens en hurtig eksponentielt stigende belastning generelt ryddes inden 6 til 18 måneder, og er normalt forbundet med lav kvalitet cytologiske abnormiteter [27]. Med disse faktorer i betragtning, blev følgende to tendenser observeret fra forsøgene: (1) patienter, som havde et tidligt stadie infektion (patient 1) eller ryddet virus (patienter 2, 6, 7 og 9) havde stigende eller faldende ACTN4 niveauer, henholdsvis og patienter uden eller lave infektioner (patient 5) eller kontinuerlig infektioner (patienter 4 og 10) havde stabile lave eller høje ACTN4 niveauer, henholdsvis; og (2) for en vedvarende infektion (patienter 1, 4 og 10), den ACTN4 akkumuleret.

Sammenligning af ACTN4 niveauer med genotype og viral belastning i langsgående prøver fra 9 forskellige patienter. Lignende genotyper er illustreret i de samme farver. På venstre side den virale belastning (i antal kopier /celle) er vist på en logaritmisk skala, mens på højre side er koncentrationen af ​​ACTN4 er udtrykt i pg /ml. Y-ax angiver tiden (udtrykt i dage), mens de patienter blev fulgt. En sort stiplet linie illustrerer ACTN4 tærskel på 17,3 pg /ml. ACTN4 niveauer blev bestemt på de tidspunkter, hvor en CVF prøve var til rådighed.

Diskussion

karakteriserer CVF proteomanalyse af sunde og præcancerøse patienter

I denne undersøgelse af CVF proteom fra 12 (6 sunde og 6 præcancerøse) individuelle prøver blev karakteriseret til at identificere kandidat protein biomarkører til detektering af den præcancerøse tilstand af livmoderhalskræft. Analysen af ​​disse 12 prøver blev udført ved både kvalitative (nuværende /fraværende) og semi-kvantitative niveau. Antallet af protein identifikationer for hver af prøverne er meget konsekvent med tidligere udførte proteom undersøgelser af CVF [28].

bestemmelse af mængden af ​​overlappende proteiner mellem prøverne inden for en gruppe viste signifikante forskelle. Kun 10% af alle proteiner blev observeret i hver enkelt prøve fra begge grupper. Denne gruppe består primært af proteiner, der er karakteristiske for CVF proteom, baseret på deres lokalisering og biologisk funktion. Vi opfordrer derfor disse proteiner “karakteristiske proteiner”. Men et betydeligt antal af identifikationer, såsom intracellulære proteiner, er mindre karakteristiske for CVF proteom. Dette resultat kan forklares ved processer, såsom afbrydelse af epitelcellelaget under prøvetagning samt afgivelse af døde epitelceller. Vi har derfor gruppere disse identifikationer som “ikke-karakteristiske” proteiner. Baseret på disse resultater, som er fælles for næsten alle omfattende CVF proteomics undersøgelse, kan man skelne mellem en “kerne proteomanalyse” hyppigt identificerede karakteristiske CVF proteiner og en “variabel proteom”, der indeholder ikke-karakteristiske CVF proteiner [28] .

i forhold til de gennemsnitlige CV værdierne af de fælles identifikationer mellem tre tekniske gentagelser (25%) [25], de gennemsnitlige CV værdier af protein overflod i det sunde og forstadier til prøver (60% og 52%, henholdsvis) var signifikant højere. Dette resultat var forventet, fordi, i modsætning til de tekniske replikater, prøverne ikke var identiske. I alle prøver blev proteiner med høj inter-individuelle forskelle observeret (op til 134%), mens den målte middelværdi CV værdien af ​​de “karakteristiske proteiner” var 38%. Disse resultater svarer til de andre proteom undersøgelser af kropsvæsker. F.eks Yamakawa

et al.

[29] fandt en middelværdi CV-værdi på 63% for sædplasma proteom, og ifølge Anderson

et al.

[30], den gennemsnitlige CV værdi af en række plasmaproteiner var ca. 45%.

Identifikation af forskelligt rigelige proteiner

for at undersøge differential rigelige proteiner, en etiket-fri spektral optælling metode blev udført. Da denne metode giver kun mulighed for en semi-kvantitativ analyse blev udestående effekter først undersøges, da disse normalt give de mest pålidelige resultater. Derfor vi først forfølges proteiner, for hvilke deres tilstedeværelse eller fravær i præcancer gruppe var karakteristisk for en given tilstand. Statistisk test (chi-square test) resulterede i 12 proteiner med en signifikant forskel på forekomsten (p 0,05), hvoraf 6 proteiner blev udelukkende identificeret i præcancerøse prøver (tabel 2). Den mest betydningsfulde protein var ACTN4 (Acc No: O43707), som blev identificeret i alle præcancerøse prøver, men ingen af ​​de raske prøver (p = 0,001). Især SCCA-1, anvendes ofte som plasma biomarkør for livmoderhalskræft [31], blev også identificeret, om end med en højere p-værdi (p = 0,046).

ACTN4 er en kritisk komponent i cytoskelettet og er involveret i dannelsen af ​​celle-celle sammenvoksninger [32]. Det er blevet vist, at inhiberingen af ​​visse membranbundne adhæsionsmolekyler forårsaget af en malign transformation resulterer i en reduktion af celle-celle-adhæsion styrke og opregulering af ACTN4 [33]. Baseret på en knockdown undersøgelse af ACTN4 hjælp brystkræftceller, Khurana

et al.

Viste, at ACTN4 var involveret i styremekanismen af ​​cellevækst [34]. Desuden blev den cytoplasmatiske akkumulering af ACTN4 forbundet med flere maligniteter og var forbundet med en dårlig prognose [35], og et akkumulerende genomisk gevinst på ACTN4 var forbundet med dannelsen af ​​æggestokkene adenocarcinomer [36]. Også RNAi-medieret nedregulering af ACTN4 viste en sammenhæng mellem overekspression af ACTN4 og en aggressiv fænotype af oral pladecellekræft [37]. For nylig blev proteinet fundet at være associeret med adskillige faktorer med varierende funktioner, hvilket tyder på andre roller for dette protein, bortset fra actin regulering [38]. Faktisk Khurana

et al.

Identificeret en LXXLL motiv, der var ansvarlig for interaktion af ACTN4 med østrogen-receptor og co-aktivatorer [39]. Nylige undersøgelser i HPV transgene musemodeller dokumenterer, at østrogen og dets nukleare receptor fremme livmoderhalskræft i kombination med HPV onkogener [40]. Det er således fristende at spekulere, at ACTN4 spiller en rolle i denne vigtige effekt.

Baseret på semikvantitative NSAF-metode blev proteiner udvalgt for deres differentielle ekspression mellem de to tilstande. Statistisk test (Mann-Whitney U) resulterede i fire proteiner med en signifikant (p 0,05) forskel i overflod (tabel 3). Selv om disse fire proteiner viser en statistisk signifikant forskel i løbet af denne opdagelse fase, er der behov for en verifikation skridt til at bekræfte disse resultater. Når både p-værdien og hyppigheden af ​​tilstedeværelse blev taget i betragtning,

annexin A2

og PKM2 var mest lovende (p 0,03), fordi begge blev identificeret i mindst 9 af 12 individuelle prøver, med en tre fold opregulering for præcancer tilstand (tabel 3). På trods af identifikation af en

nnexin A2

i næsten hver prøve (11/12 prøver) med en acceptabel forskel i overflod (p = 0,03), de inter-individuelle variationer (CV 77%) for den sunde gruppe var meget højere sammenlignet med PKM2 (35%). Derfor PKM2 (Acc No: P14618) blev udvalgt til kontrol ved ELISA

PKM2 er en glykolytisk enzym, der bidrager til energiforsyningen af ​​cellen.. Dette protein har to isoformer, en embryologisk isoform (M2) med forhøjet enzymatisk aktivitet og en voksen isoform (M1). For nylig blev det påvist, at maligne transformationer af celler ved HR-HPV-onkogener E6 og E7 inducerede en PKM skifte fra M1 til M2 [41]. Denne kontakt forårsager et skift fra normal cellulær metabolisme til forhøjet glycolysen, hvilket er til gavn for væksten og neoplasme af tumorceller [42]. Desværre var vi ikke i stand til at bekræfte forskellen i PKM2 fusioner og CVFs fra sunde og forstadier individer, selv om to ELISA kits fra forskellige leverandører blev brugt. Det er muligt, at den semikvantitative spektrale optælling metode kan være tilbøjelige til at være for stor variation. Alternativt har vi tidligere observeret, at CVF matrix er ikke optimal for nogle ELISA-konfigurationer, og dette kan være tilfældet for de to PKM2 ELISA assays.

Verifikation af alfa-actinin-4 niveauer

Alpha-actinin-4, den mest lovende kandidat biomarkør, blev bekræftet på 57 ekstra CVF prøver (28 individuelle prøver og 29 langsgående prøver) ved ELISA, et tal, der helt sikkert opfylder kravene til opdagelsen /verifikation fase af protein biomarkører [43] . ELISA Resultaterne viste, at koncentrationen af ​​ACTN4 er forhøjet i de HPV-inficerede patienter sammenlignet med ikke-inficerede patienter, hvilket bekræfter de LC-MS /MS resultater. Men infektion med LR-HPV (HPV-6 og HPV-11) resulterede i højere koncentrationer ACTN4 i CVF. Selvom koncentrationerne af ACTN4 målt i CVFs fra LR-HPV-inficerede personer er højere end fra ikke-inficerede individer, blev ingen signifikant forskel i den overflod niveauet observeret (p = 0,052). Fordi disse resultater er baseret på en analyse af prøver fra kun fire enkelt LR-HPV-inficerede patienter, skal vurderes mere af denne type prøve, før der kan drages konklusioner. En ikke-inficeret patient udviste en outlier værdi på 85,6 pg /ml ACTN4. Denne patient havde ikke en kendt historie om HR-HPV-infektion, men den kliniske filen viste iskæmisk hjertesygdom og en prævalens på brystkræft. Det er derfor muligt, at denne forhøjede koncentration af ACTN4 skyldes den medicinske behandling, eller en anden end HPV-6 eller HPV-11 LR-HPV-infektion. Derfor omfattende validering af denne markør på et større antal prøver, herunder dem fra patienter, der lider af andre sygdomme og infektioner (HIV, herpes, bakteriel vaginose,

Chlamydia

etc.), er det næste skridt at afgøre, om ACTN4 er egnet til diagnoseformål. I disse studier kunne man fastsætte en tærskel på 18 pg /ml til at skelne mellem prøver fra raske versus HPV-inficerede individer.

Selvom ACTN4 niveauer ikke numerisk korrelerer med de virale belastninger, en stigende og faldende tendens kunne klart iagttages i patienter, som enten startet en infektion eller nedbrød virus. Vi observerede også, at infektioner over længere perioder forårsaget akkumulering af markøren.