PLoS ONE: Forkhead Box L1 Er Ofte nedreguleret i galdeblære kræft og Hæmmer Cell Vækst gennem Apoptose Induktion af mitokondrie Dysfunction

Abstrakt

Baggrund

Forkhead box L1 (FOXL1), betragtes som en ny kandidat tumor suppressor, hæmmer proliferationen og invasion i visse kræftformer. Men reguleringen og funktionen af ​​FOXL1 i galdeblæren kræft (GBC) er fortsat uklart.

Metoder

FOXL1 udtryk på mRNA og protein niveauer i GBC væv og cellelinier blev undersøgt ved RT-PCR, immunhistokemi og western blot-assay. FOXL1 udtryk i GBC cellelinjer blev opreguleret ved transfektion med pcDNA-FOXL1. Virkningerne af FOXL1 overekspression på celleproliferation, apoptose, migration og invasion blev evalueret in vitro eller in vivo. Desuden blev status mæglerne er involveret i migration, invasion og apoptose undersøgt ved hjælp af western blot efter transfektion med pcDNA-FOXL1.

Resultater

FOXL1 blev ofte nedreguleret i GBC væv og cellelinier. Dens højere ekspression er forbundet med bedre prognose, mens dens nedre ekspression er korreleret med avanceret TNM stadie og dårlig differentiering. FOXL1 overekspression i NOZ-celler undertrykker signifikant celleproliferation, migration og invasion in vitro og tumorigenicitet i nøgne mus. FOXL1 overekspression forstyrret mitokondrie transmembrane potentiale og udløste mitokondrier-medieret apoptose i Noz celler. Desuden FOXL1 overekspression undertrykt ZEB1 udtryk og induceret E-cadherin ekspression i Noz celler.

Konklusion

Vores resultater foreslog, at dysreguleret FOXL1 er involveret i tumorigenese og progression af GBC og kan tjene som en indikator for klinisk udfald eller endda en terapeutisk mål for patienter med GBC

Henvisning:. Qin Y, Gong W, Zhang M, Wang J, Tang Z, Quan Z (2014) Forkhead Box L1 Er Ofte nedreguleret i galdeblære Kræft og hæmmer cellevækst gennem Apoptose induktion af mitokondriel dysfunktion. PLoS ONE 9 (7): e102084. doi: 10,1371 /journal.pone.0102084

Redaktør: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Faculty of Medicine, Chile

Modtaget: 10. januar, 2014 Accepteret: 14 Juni 2014; Udgivet: 10. juli 2014

Copyright: © 2014 Qin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.272.747 og nr 81.372.642). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Galdeblæren cancer (GBC), der repræsenterer den mest almindelige og aggressive form blandt galdevejene maligniteter er kendetegnet ved ikke-specifik præsentation, sen diagnosticering og mangel på effektiv behandling. Selv om de seneste fremskridt er blevet gjort i diagnosticering og behandling, har resultaterne af de nuværende behandlinger, såsom kirurgi, kemoterapi og strålebehandling (alene eller kombineret) vist sig at være trist. Det er forbundet med en dårlig prognose med median overlevelse varighed på 4 måneder [1] og 5-års overlevelsesrate under 10% [2]. Derfor er der et presserende behov for at udvikle nye og effektive terapi regimer til GBC patienter. Men den begrænsede viden om tumorigenese af galdeblæren kræft hindrer udviklingen af ​​diagnose og behandling for GBC. En bedre forståelse af den molekylære biologi og kræftfremkaldende mekanismer bag udviklingen og progressionen af ​​GBC kan bidrage til at skabe mere effektive behandlinger.

Forkhead boks (Fox) proteiner er en superfamilie af transkriptionsfaktorer, der deler et højt konserveret DNA-bindende domæne (den forkhead boks eller vingede helix domæne) styrer en række biologiske processer, herunder metabolisme, differentiering, proliferation og apoptose [3]. Da FOX proteiner regulere disse vitale processer i vækst og udvikling, en gevinst eller et tab af FOX funktion overraskende forårsager genetiske sygdomme hos mennesker, herunder kræft. Den dysregulering af flere FOX underfamilier såsom FOXO, FOXM, FOXP, FOXC og Foxa er impliceret i tumorigenese og progression af visse kræftformer [4]. Selvom FOX proteiner deler den meget konserverede DNA-bindende domæne, deres regulering og funktion varierer betydeligt mellem familier. FOX proteiner har forskellige funktioner og fungere som tumor undertrykkere eller onkogener under tumorigenese og progression af forskellige kræftformer. For eksempel FOXO1 virker som en tumorsuppressor, som kunne inducere apoptose og standsning af cellecyklus i cancerceller [5]. I modsætning til FOXO1, FOXM1 viser onkogene aktiviteter og målretning FOXM1 inducerer apoptose i cancerceller [6]. En voksende mængde beviser har på overbevisende måde vist, at FOX proteiner kan repræsentere attraktive mål for terapeutisk intervention mod mange kræftformer.

FOXL1 protein er et medlem af FOX superfamilien som oprindeligt blev opdaget i mesenchym af mave-tarmkanalen. Hidtil har forholdet mellem FOXL1 og gastrointestinal cancer, herunder maven, colon og pancreas blevet undersøgt i adskillige undersøgelser [7] – [8]. den biologiske funktion af FOXL1 i GBC er dog fortsat, at blive belyst. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi betydningen af ​​FOXL1 ekspression i patienter med GBC i forbindelse med kliniske træk og prognose. Vi har udført også funktionelle undersøgelser for at vurdere virkningerne af FOXL1 overekspression på proliferationen, apoptose, migration og invasion af GBC-celler in vitro eller in vivo. Desuden har vi foreløbig undersøgt ekspressionen af ​​E-cadherin og Zink-fingre E-box binding homeobox 1 (ZEB1), hvilket kan bidrage til de inhibitoriske virkninger af FOXL1 overekspression i GBC.

Materialer og metoder

Etik erklæring

de forsøg med mennesker og dyr blev godkendt af Etisk Komité Xinhua hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter.

Patienter og væv samling

35 af patienter med GBC (13 mænd og 22 kvinder, alder range 51-71 yrs, gennemsnitsalder 61,9 ± 5,4 år ) behandlet med radikal kolecystektomi (uden forudgående strålebehandling eller kemoterapi) mellem 2008 og 2013 ved Institut for almen kirurgi, Xinhua hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine blev indrulleret i denne undersøgelse. Tumorprøver (n = 35) og tilstødende nontumor prøver (n = 12) blev opsamlet umiddelbart efter operationen og nedsænket i flydende nitrogen. Ifølge TNM (AJCC, 7

th, 2010), blev tumorerne iscenesat (4 trin I, 12 trin II, 14 fase III, og 5 trin IV). Differentieringen karakter efter WHO kriterier var som følger: 13 sager var godt differentieret (WD), 15 moderat differentieret (MD) og 7 dårligt differentieret (PD). Den histologiske diagnose af alle GBC blev bekræftet af to patologer.

Immunhistokemi

Frosne vævsprøver blev indlejret i optimal skæring temperatur (OLT) sammensatte. 5-um tyk vævssnit af tumorer og nontumor væv blev skåret fra vævsblokke, og derefter fikseret i kold acetone ved 4 ° C i 20 minutter. Vævssnit blev inkuberet med 3% (v /v) H

2O

2 i methanol for at eliminere endogen peroxidaseaktivitet og derefter blokeret med normalt gedeserum. Bagefter blev snit behandlet til immunhistokemi ved anvendelse af antistoffer mod FOXL1 (1: 100 fortynding; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) og sekundært antistof (1: 500 fortynding; Santa Cruz Bio). Endelig blev snit inkuberet med peroxidase-kompleks og visualiseret ved 3,3′-diaminobenzidin tetrachlorid (DAB). Alle immunfarvede sektioner blev blindt revideret af to uafhængige patologer. Intensiteten blev evalueret under anvendelse af en 3-skala-system (0, negativ; 1, svag; 2, moderat, 3, stærk). Den procentvise positivitet blev også vurderet under anvendelse af en 3-skala-system (0, 5%, 1, 5% -25%; 2, 25% -50%, 3, 50%). Den overordnede kvantificering for immunhistokemi score blev beregnet ved at gange score på farvning intensitet og score på procentdelen af ​​positive celler. FOXL1 udtryk niveauer blev rangeret som følger: – (score 0-1), + (score 2-3), ++ (score 4-6) og +++ (score 6). Ifølge snesevis af FOXL1 immunfarvning blev GBC patienter klassificeres i to grupper: lav ekspression (- eller +) og høj ekspression (++ eller +++)

cellelinjer og dyrkningsbetingelser

Fire humane GBC cellelinier GBC-SD, SGC-996, NOZ og OCUG-1, blev anvendt i denne undersøgelse. GBC-SD-cellelinje blev købt fra Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina; SGC-996 cellelinje [9] blev leveret af Tumor Cell Biology Research Institute of Tongji Universitet, Shanghai, Kina; Noz og OCUG-1 cellelinjer blev købt fra Sundhedsvidenskab Research Resources Bank, Osaka, Japan. Celler blev dyrket enten i DMEM eller RPMI1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 1% penicillin /streptomycin (Invitrogen) og 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (HyClone, Logan, UT, USA) ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 inkubator.

Transfektioner

for at opregulere ekspression af FOXL1, pcDNA-FOXL1 (koder FOXL1 cDNA) blev konstrueret og transficeret ind GBC celler. Den tomme vektor pcDNA3.1 (Invitrogen) blev anvendt som kontrol. Kloningsstrategien og restriktionskort over rekombinante plasmider blev vist i fig S1. Den transfektionsreagens Lipofectamine 2000 blev brugt under transfektion ifølge producentens instruktioner (Invitrogen). At opnå stabile transfektanter blev mediet erstattet med frisk komplet medium suppleret med 300 ug /ml geneticin (G418) efter 48 timers transfektion. Det selektive medium blev fornyet hver 3-4 dage indtil G418-resistente kloner kan identificeres. FOXL1 ekspressionsniveauer i cellelinier blev undersøgt ved RT-PCR og western blot-assay.

RNA-isolering og RT-PCR-analyse

Totalt RNA blev ekstraheret fra frosne vævsprøver og GBC cellelinjer under anvendelse af Trizol reagenser kit (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA). RNA’er blev omdannet til cDNA under anvendelse af et Takara RNA PCR kit (Takara Bio Inc., Dalian, Kina). Det opnåede cDNA blev amplificeret under anvendelse af følgende procedure: 94 ° C (5 min), derefter 30 cykler ved 94 ° C (30 s), 59 ° C (45 s), 72 ° C (45 s). Sekvenserne af primerne til FOXL1 var som følger: Sense: cacggtactccacttccagt; Anti-sense:. Aacacttccctgaacccaca

Cell levedygtighed og kolonidannelse analyser

Vand opløselig tetrazolium (WST) -1 assay blev udført for at måle cellernes levedygtighed efter transfektion. 5 × 10

3 af transficerede celler pr brønd blev podet i plader med 96 brønde og dyrket i 24, 48, 72, eller 96 timer. Bagefter blev cellerne derefter inkuberet med WST-1-reagens i 2 timer ved 37 ° C. Absorbansen ved 450 nm blev målt med anvendelse af en automatiseret mikropladelæser (Bio-Rad 5 Model 550, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) blev og vækstkurven beregnet.

I kolonidannelse assayet , 1 × 10

3 af transficerede celler pr brønd blev podet i plader med 6 brønde og dyrket i komplet medium ved 37 ° C. Efter 14 dage for dyrkning blev kolonierne farvet med krystalviolet, og antallet af kolonier blev talt ved automatiseret koloni counter (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA).

xenograft tumor eksperimenter

Subkutan xenografter i nøgne mus blev udført for at vurdere virkningerne af FOXL1 overekspression på cellevækst og tumorigenicitet in vivo. Mandlige og kvindelige Athymiske (nu /nu) nøgne mus 6-8 uger gamle blev indhentet fra Shanghai Laboratory Animal Center of Chinese Academy Sciences og opstaldet under SPF-(SPF) tilstand. NOZ-celler blev stabilt transficeret med pcDNA-FOXL1 eller pcDNA3.1. Ca. 1 x 10

7 af FOXL1-overudtrykkende celler eller kontrolceller blev suspenderet i et totalt volumen på 200 pi 1/1 (v /v) PBS /Matrigel (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) og derefter subkutant injiceret i flankerne af musene. Ca 4 uger efter injektionen af ​​tumorceller blev synlige subkutane tumorvolumener målt ugentligt med passere og tumorvolumener i hver gruppe blev beregnet under anvendelse af formlen: volumen = længde x bredde

2/2. Alle mus blev aflivet efter 6 ugers observation. Xenotransplantattumorer blev fikseret i formalin og derefter indlejret i paraffin. Tumorvægt blev målt og registreret.

Flowcytometrisk analyse af apoptose

celleapoptosen in vitro blev bestemt ved flowcytometri under anvendelse Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Bioscience) ifølge producentens protokol. Kort fortalt, 24, 48 og 72 timer efter transfektion med pcDNA-FOXL1 eller pcDNA3.1, celler blev høstet, vasket med PBS og resuspenderet i 1 × Binding Buffer. Bagefter blev celler farvet med FITC-Annexin V og PI i 15 minutter og analyseret ved flowcytometri.

TUNEL assay

Apoptose i vævssnit fra xenotransplantattumorer blev vurderet ved Terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick endemærkning (TUNEL) farvning anvendelse af in situ celledød afsløring kit, fluorescein (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) ifølge producentens protokol. Kort fortalt blev xenograft tumorprøver afparaffiniseret under anvendelse xylen og ethanol. Vævssnit blev inkuberet med proteinase K opløsningen i 15 minutter, efterfulgt af inkubation med TUNEL reaktionsblandingen. Bagefter vævssnit inkuberet med omformer-POD og modfarvet med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI). Den fluorescens blev set af fluorescens mikroskopi ved hjælp af passende excitation og emission filtre.

Flowcytometrisk analyse af mitokondrie membranpotentiale

Ændringen i mitokondrie transmembrane potentiale blev bestemt ved flow cytomery hjælp mitokondriemembranen potentielle følsomme fluorochrom farvestof JC-1. Kort fortalt blev NOZ celler høstet 24, 48 og 72 timer efter transfektion med pcDNA-FOXL1 eller pcDNA3.1 og vasket med PBS. Celler blev inkuberet med JC-1 (10 ug /ml i PBS) ved 37 ° C i 10 min. Farvede celler blev vasket med PBS to gange og analyseret ved flowcytometri.

mitokondrie og cytosoliske ekstrakt forberedelse

Mængden af ​​mitokondrie cytochrom c og cytosol cytochrom c blev bestemt ved hjælp af mitokondrie ekstrakt og cytosolisk ekstrakt hhv. Mitokondrielle og cytosoliske fraktioner ekstraheret fra dyrkede celler ved Mitokondrier /Cytosol Fraktionering Kit (Abcam, Cambridge, UK) ifølge producentens protokol. Kort fortalt, efter vasket med iskold PBS, blev transficerede celler inkuberet med cytosol ekstraktionsbuffer blanding indeholdende dithiothreitol (DTT) og proteasehæmmere på is i 10 min. Celler blev homogeniseret forsigtigt ved anvendelse af en iskold glashomogenisator. Cellesuspensionen blev centrifugeret ved 3000 rpm ved 4 ° C i 10 min. Supernatanterne blev centrifugeret igen ved 13.000 rpm i 30 minutter for at separere intakte mitochondrier (pellets) og cytosoliske fraktion (supernatanter). Pelleterne blev resuspendere med 100 pi mitokondrie ekstraktionspuffer mix indeholdende DTT og proteaseinhibitorer og hvirvelbehandlet i 10 sekunder. Blandingen blev gemt som mitokondrie fraktion.

Western blot assay

I alt proteiner blev udvundet fra Noz celler 48 timer efter transfektion med pcDNA-FOXL1 eller pcDNA3.1. Proteinindholdet blev kvantificeret ved Bradford-proteinassay. 40 ug protein blev separeret ved 10-12% SDS-PAGE og elektrooverført til PVDF-membraner (Millipore, Billerica, MA, USA). Membranen blev blokeret med 5% fedtfri tørmælk, og probet med tilsvarende primære antistoffer (Santa Cruz Bio) natten over ved 4 ° C efterfulgt af inkubering med peberrodsperoxidase-koblede sekundære antistoffer (Santa Cruz Bio). Peberrodsperoxidase-aktivitet blev visualiseret under anvendelse af forøget kemiluminescens (ECL) kit (Pierce, Rockford, IL, USA) og eksponeret for X-OMAT-Blå film (Kodak, Rochester, NY, USA).

Cell migration og invasion assay

Cell migration og invasion assay blev udført under anvendelse af en 24-brønds transwell kammer (Corning Inc, Corning, NY, USA) med 8 um porer ifølge fabrikantens protokol. De transficerede celler blev podet i den uovertrukne (migration assay) eller Matrigelcoatede (invasion assay) øvre kammer compartement med serumfrit RPMI1640. RPMI1640 tilsat 10% føtalt bovint serum blev anbragt i de nedre kamre ifølge kemoattraktant. 24 timer efter inkubation blev celler på den øvre side af filtermembranen fjernes med en vatpind. Celler, der klæber til den nedre overflade af membranen blev fikseret med 4% paraformaldehyd i 30 minutter og derefter farvet med krystalviolet i 20 minutter.

Statistisk analyse

Data blev præsenteret som gennemsnit ± SD . Statistisk analyse blev udført med SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Forskellene mellem grupperne blev evalueret ved hjælp af Students t-test eller One-Way ANOVA eller Kaplan-Meier log-rank eller chi-sqaured test. Den statistiske signifikans blev defineret som P. 0,05

Resultater

FOXL1 udtryk i GBC og dens forhold til klinisk-patologiske variabler

FOXL1 mRNA og protein blev undersøgt i tumorvæv og nontumor væv ved RT-PCR, Western blot og immunhistokemi analyse hhv. Som vist i figur 1A og B, FOXL1 mRNA og protein niveauer blev reduceret i cancervæv sammenlignet med matchede nontumor væv. Desuden 2 af tumorprøver mangler FOXL1 mRNA ekspression og 3 i tumorprøver mangler protein-ekspression.

(A) FOXL1 mRNA-ekspression i GBC væv og matches nontumor væv. T: GBC væv; N, matchede nontumor væv. (B) FOXL1 proteinekspression i GBC væv og matchede nontumor væv. (C) Immunhistokemi analyse af FOXL1 i GBC væv og matches nontumor væv. Forstørrelsen er 200 × og skalaen bar er 50 um. a: Positiv farvning af FOXL1 i nontumor væv; b: Positiv farvning af FOXL1 i godt differentierede (WD) tumorer; c: Positiv farvning af FOXL1 i moderat differentierede (MD) tumorer; d: Positiv farvning af FOXL1 i fattige differentierede (PD) tumorer; (D) IHC score på GBC væv og nontumor væv (P 0,05). (E) IHC score på tidlige TNM fase (I og II) tumorer og sen TNM fase (III og IV) tumorer (P 0,05). (F) IHC score på WD tumorer og MD + PD tumorer (P 0,05). (G) Kaplan-Meier-kurver baseret på FOXL1 udtryk niveauer ved immunhistokemi i GBC. Patienter med høj ekspression af FOXL1 har bedre resultat sammenlignet med dem med lav ekspression af FOXL1 (P 0,05). (H) mRNA og protein udtryk for FOXL1 i GBC-SD, SGC996, NOZ og OCUG-1 cellelinjer. (I) Transfektion med pcDNA-FOXL1 restaureret ekspression af FOXL1 i Noz celler. * Angiver signifikant forskel.

immunhistokemisk analyse viste, at FOXL1 protein hovedsageligt blev lokaliseret i nukleare af cancerceller og normale epitelceller (Figur 1C). FOXL1 protein blev rigeligt udtrykt i normale væv, men blev relativt mindre udtrykt i cancervæv. Scoren af ​​FOXL1-positive immunfarvning i GBC væv var meget lavere end i normale væv (P 0,05, figur 1D). FOXL1 udtryk var signifikant højere i tumorer med tidligere tidspunkt (I og II) i forhold til dem med sent tidspunkt (III og IV) (P 0,05, figur 1E). Forskel i score på FOXL1-positive immunfarvning blev også målt mellem tumor kvaliteter (WD vs PD + MD) og blev fundet at være signifikant (P 0,05, figur 1F), med højere FOXL1 scores i WD grupper. Desuden blev et højere FOXL1 genekspression forbundet med bedre prognose. (P 0,05, figur 1G)

endogene FOXL1 mRNA og protein kunne påvises i GBC-SD, SGC996 og OCUG-1 cellelinier , men ikke i NOZ cellelinie, som vælges derfor til efterfølgende eksperimenter (Figur 1H). Transfektion med pcDNA-FOXL1 restaureret mRNA og protein niveauer af FOXL1 i NOZ cellelinje (figur 1 i).

FOXL1 overekspression undertrykker proliferation af NOZ cellelinie in vitro og in vivo

in vitro effekt af FOXL1 overekspression på spredning og vækst af Noz celler blev vurderet ved WST-1 analysen. Overekspression af FOXL1 signifikant inhiberede celleproliferation i NOZ celler (P 0,05; Figur 2A). Og denne væksthæmning var tidsafhængig

(A) Væksten af ​​Noz celler blev hæmmet betydeligt efter transfektion med pcDNA-FOXL1 (P 0,05).. (B) kolonidannelse med NOZ celler. De viste resultater er repræsentative for tre eksperimenter. (C) Transfektion med pcDNA-FOXL1 reducerede signifikant antallet af koloni i NOZ celler (P 0,05). (D og E) FOXL1 overekspression reduceret mængden og vægten af ​​xenograft tumor (P 0,05). * Angiver signifikant forskel.

De mere langsigtede hæmmende virkninger af FOXL1 overekspression på celleproliferation blev vurderet ved kolonidannelse assay. Et signifikant fald i koloni nummer blev observeret i FOXL1-overekspression celler sammenlignet med kontrol-celler (P 0,05, figur 2B og C).

For yderligere at undersøge den rolle FOXL1 i tumorgenicitet og vækst af GBC in vivo, xenografter i nøgne mus blev etableret ved subkutan implantation af FOXL1 overekspression og kontrol celler. Xenotransplantater dannet af FOXL1 overudtrykker celler voksede meget langsommere end dem dannet af kontrolceller. FOXL1 overekspression in vivo inducerede en signifikant reduktion i både tumor volumen (P 0,05, figur 2D) og tumorvægt (P 0,05, figur 2E). Disse resultater antydede, at FOXL1 undertrykker væksten af ​​GBC celler både in vitro og in vivo.

FOXL1 overekspression fremmes apoptose i NOZ cellelinie in vitro og in vivo

Induktion af apoptose med FOXL1 overekspression i vitro og in vivo blev undersøgt under anvendelse Annexin V /PI-assay og TUNEL-assay, hhv. Som vist i figur 3A og B, en betydelig stigning i andelen af ​​apoptotiske NOZ celler (tidlig apoptose plus sen apoptose) blev observeret efter transfektion med pcDNA-FOXL1 (P 0,05). Og andelen af ​​sene apoptotiske eller nekrotiske celler steg i en tidsafhængig måde (startet fra 24 timer og nåede toppen ved 72 h).

(A) apoptose af NOZ celler in vitro blev undersøgt ved Annexin V /PI dobbelt farvning. Celler, som farves negative for både Annexin V og PI er levedygtige celler (nederst til venstre). Celler, som farves positivt for Annexin V og negativ for PI undergår tidlig apoptose (nederst til højre). Celler, som farves positivt for både Annexin V og PI er enten i slutstadiet af apoptose, eller undergår nekrose (øverst til højre). De viste resultater er repræsentative for tre eksperimenter. (B) Antallet af apoptotiske NOZ celler (herunder tidlig apoptose, sen apoptose og nekrose) var signifikant forøget efter transfektion med pcDNA-FOXL1 (P 0,05). (C) apoptose af NOZ celler in vivo blev bestemt ved anvendelse TUNEL assay. Apoptotiske celler visualiseres så intenst grønt fluorescerende celler. Antallet af apoptotiske celler blev registreret under høj-power felter (400 ×). Lokalisering i kerner blev visualiseret ved modfarvning med DAPI (blå). (D) FOXL1 overekspression fremmes signifikant apoptose af NOZ-celler in vivo (P 0,05). * Angiver signifikant forskel.

TUNEL analyse viste, at FOXL1 overekspression fremmet apoptose af Noz celler i xenotransplantattumorer. Der var færre TUNEL-positive celler i xenotransplantattumorer dannet af kontrolceller. Derimod det gennemsnitlige antal TUNEL-positive celler steg betydeligt i xenotransplantattumorer dannet af FOXL1 overudtrykker celler (P 0,05, figur 3C og D)

FOXL1 overekspression inducerede mitokondriel transmembrane depolarisering og cytochromec-medieret apoptose

Tab af mitokondrie membranpotentiale (A ^ m) angiver indledningen og aktivering af nogle apoptotiske kaskader. I den foreliggende undersøgelse blev ATm undersøgt af JC-1-farvning. Tab af ATm blev bestemt ved ændringen i JC-1 fluorescens fra rødt til grønt. Som vist i figur 4A og B, er andelen af ​​rød fluorescens-positive celler faldet, mens andelen af ​​grøn fluorescens-positive celler steg efter transfektion med pcDNA-FOXL1 (P 0,05), hvilket tyder FOXL1 overekspression inducerede en tilsyneladende reduktion i mitochondriemembranpotential .

(a) tabet af mitokondrisk membranpotentiale (a ^ m) er angivet ved et fald i rød /grøn fluorescensintensitet ratio. X-aksen angiver grøn fluorescensintensitet; Y-aksen angiver rød fluorescens intensitet. De viste resultater er repræsentative for tre eksperimenter. (B) Andelen af ​​rød fluorescens-positive celler faldet, mens andelen af ​​grøn fluorescens-positive celler steg efter transfektion med pcDNA-FOXL1 (P 0,05). (C) Western blot-analyse viste niveauet af cytosolisk cytochrom c markant forøget, mens niveauet af mitokondrie cytochrom markant c faldt. (D) Niveauerne af kløvet caspase-9, 3 og PARP og bax blev forhøjet, mens niveauet af bcl-2 blev reduceret. * Angiver signifikant forskel.

mitokondrie og cytosoliske cytochrom c blev undersøgt ved Western blot analyse. Niveauet af cytosolisk cytochrom c blev markant forhøjet, mens niveauet af mitokondrie cytochrom c blev markant nedsat 48 timer efter transfektion med pcDNA-FOXL1, hvilket antyder, at FOXL1 overekspression fremmet cytochrom c-frigivelse fra mitochondrier til cytosol (figur 4C). Cytochrom c-oxidase-underenhed IV (Cox IV) og β-actin blev anvendt som kontrol for mitokondrie-protein og cytosoliske protein. Desuden fandt vi pcDNA-FOXL1 inducerede en stigning i Bax /Bcl-2-forhold, som kan udløse frigivelse af cytochrom c fra mitokondrier til cytosol.

Virkningerne af FOXL1 overekspression på caspaser aktivering i Noz celler var yderligere undersøgt ved Western blot. Vi fandt, at spaltning af caspase-9 og -3 var signifikant forøget 48 h efter transfektion med pcDNA-FOXL1. Desuden blev spaltningen af ​​poly (ADP) -ribose polymerase (PARP), der er kendetegnende for apoptose også steget bemærkelsesværdigt efter transfektion med pcDNA-FOXL1 (figur 4D). Disse resultater antydede, at FOXL1 overekspression aktiveret caspase kaskader i Noz celler.

FOXL1 undertrykt migration og invasion af Noz celler og induceret E-cadherinekspression

Da sammenslutningen af ​​FOXL1 udtryk med klinisk udvikling og lymfeknudemetastase af GBC var blevet påvist ovenfor, er det forventeligt, at FOXL1 kan spille en rolle i migration og invasion af GBC. Derfor vi næste evalueret rolle FOXL1 i migration og invasion af GBC. Som vist i figur 5A-C, transfektion med pcDNA-FOXL1 inducerede et signifikant fald i antallet af migrerende og invasive NOZ celler i sammenligning med kontrolgrupperne (P 0,05), hvilket antyder FOXL1 overekspression forringet vandrende og invasive evner af NOZ-celler . Endvidere fandt vi, E-cadherin-protein-niveauet blev signifikant forhøjet 48 h efter transfektion med pcDNA-FOXL1, mens niveauet af ZEB1 protein blev reduceret signifikant (fig 5D).

(A) Antallet af vandrende og invasive celler farvet med krystalviolet afspejlede deres vandrende og invasive kapacitet. Antallet af vandrende eller invasive NOZ celler pr synsfelt blev talt under mikroskopi efter krystalviolet farvning (× 100). (B og C) Transfektion med pcDNA-FOXL1 signifikant inhiberede migration og invasion af NOZ-celler (P 0,05). (D) ZEB1 ekspression blev undertrykt og E-cadherin ekspression blev induceret ved FOXL1 overekspression. * Angiver signifikant forskel.

Diskussion

roller Forkhead familiemedlemmer såsom Foxos, FOXMs og FOXPs i kræft er ofte blevet undersøgt. Men der er få undersøgelser om regulering og funktion FOXL1 i kræft. I den foreliggende undersøgelse blev den rolle FOXL1 i vækst, apoptose, migration og invasion af GBC celle foreløbigt undersøgt. Vi fandt niveauerne af FOXL1 mRNA og protein blev signifikant reduceret i GBC væv sammenlignet med matchede nontumor væv. Udover GBC, blev et fald i udtryk for FOXL1 også observeret af andre forskere i pancreas tumorer [10], [11]. Derudover blev FOXL1 ekspression negativt korreleret med avanceret TNM stadie og dårlig differentiering af GBC. Desuden blev en højere FOXL1 udtryk forbundet med bedre prognose hos patienter opereret for GBC. Disse resultater antydede, at downexpression af FOXL1 kan være involveret i tumorigenese og progression af GBC og FOXL1 kan tjene som en nyttig indikator for prognosen for disse patienter, der gennemgår kirurgi. Lignende resultater blev også observeret i myelom og bugspytkirtelkræft [8], [12]. Imidlertid har mekanismerne for downexpression af FOXL1 ekspression i disse kræftformer ikke klarlagt endnu. Adskillige mekanismer såsom kromosomal sletning [13], kromosom translokationer [14], [15], promoter methylering [16], ændring i opstrøms regulatorer [17], [18] og post-translationelle modifikationer [4] har vist sig at bidrage til deregulering af Fox faktorer. Baseret på de foreliggende resultater, er det svært at sige, hvilken mekanisme var ansvarlig for nedregulering af FOXL1 i GBC. Yderligere undersøgelse om genetiske og epigenetiske mekanismer til dereguleret FOXL1 genekspression bør gennemføres med afklare spørgsmålet.

Korrelationen af ​​højere FOXL1 udtryk med tidlig fase og bedre prognose foreslog dens potentielle undertrykkende rolle i GBC cellevækst og progression. Derfor udførte vi en række funktionelle undersøgelser for at evaluere effekten af ​​FOXL1 på væksten, apoptose, migration og invasion af GBC cellelinje.

Overekspression af FOXL1 signifikant hæmmet vækst af NOZ-celler in vitro og in vivo, og dette vækstinhibering kan tilskrives induktionen af ​​apoptose ved FOXL1 overekspression. Apoptose er en biologisk proces, der involverer en genetisk programmeret række af begivenheder, der fører til død af en celle. Under denne proces opstår flere vigtige begivenheder i mitokondrier, herunder frigivelse af cytochrom c fra mitokondrier til cytoplasmaet og tabet af mitokondrie transmembrane potentiale (A ^ m) [19], [20]. ATm er en vigtig parameter for mitokondriefunktionen og har været anvendt som en indikator for levedygtige celler. Bcl-2-familien bestående af pro- apoptotiske og anti-apoptotiske medlemmer regulerer mitokondrielle pathway af apoptose ved at styre permeabilisering af den ydre mitokondriemembran og åbningen af ​​spændingsafhængige anion kanal (VDAC). Pro-apoptotisk protein, såsom Bax accelererer åbningen af ​​VDAC, hvorimod det anti-apoptotiske protein Bcl-x (L) lukker VDAC ved binding direkte til den. Stigning i Bax /Bcl-2-forhold kan føre til forstyrrelser i A ^ m og åbning af VDAC. Efterfølgende kan mitokondrie cytochrom c translokere til cytosolen gennem VDAC og påbegynder processen af ​​apoptose [21].