PLoS ONE: S100A14 interagerer med S100A16 og regulerer sit udtryk i Human Cancer Cells

Abstrakt

Både S100A14 og S100A16 er medlemmer af den multifunktionelle S100 protein familie. Dannelse af homo /heterodimerer anses for at være en af ​​de store mekanismer for S100 proteiner til at udføre deres forskellige cellulære funktioner. Ved at anvende en klassisk Gær to-hybrid (Y-2 H) skærm, identificerede vi S100A16 som fælles interaktion partner S100A14. Denne interaktion blev bekræftet ved co-immunoudfældning, dobbelt indirekte immunofluorescens og dobbelt immunfarvning med enheder af oral planocellulært karcinom og normal mundslimhinden. Den funktionelle betydning af denne interaktion blev undersøgt af ansat retroviral medieret overekspression og knock-down af disse proteiner i flere cancer-cellelinjer. Over-ekspression og knock-down af S100A14 medførte samtidig op- og nedregulering af S100A16 protein i de undersøgte cellelinjer. Der var imidlertid ingen opregulering af S100A16 mRNA upon S100A14 overekspression, hvilket indikerer, at modulation af S100A16 ekspression ikke skyldtes øget transkriptionel aktivitet, men muligvis med post-transkriptionel regulering. I modsætning, overekspression af S100A16 var forbundet hverken med opregulering af S100A14 mRNA eller dens protein, hvilket tyder på en ensrettet regulering mellem S100A14 og S100A16. Cellular behandling med proteinsynteseinhibitor cycloheximid viste en tidsafhængig intracellulær nedbrydning af både S100A16 og S100A14 proteiner. Derudover regulering af S100A16 og S100A14 nedbrydning viste sig at være uafhængig af de klassiske proteasomalaktivitet og lysosomale veje for protein nedbrydning. Yderligere undersøgelser vil derfor være nødvendigt at forstå den funktionelle betydning af denne interaktion og mekanismerne om, hvordan S100A14 er involveret i reguleringen af ​​S100A16 udtryk

Henvisning:. Sapkota D, Costea DE, Ibrahim SO, Johannessen AC, Bruland O (2013) S100A14 interagerer med S100A16 og regulerer dets ekspression i humane cancerceller. PLoS ONE 8 (9): e76058. doi: 10,1371 /journal.pone.0076058

Redaktør: Zhihua Liu, Chinese Academy of Medical Sciences, Kina

Modtaget: 14. marts 2013; Accepteret: August 20, 2013; Udgivet: 27 september, 2013 |

Copyright: © 2013 Sapkota et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af universitetet i Bergen (ph.d.-fond, DS) og Bergen Medical Research Foundation (DEC). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

S100 proteinfamilien er en multifunktionel gruppe af EF-hand calcium-bindende proteiner. Denne familie består af små sure proteiner (10-12 kDa), som udtrykkes kun hos hvirveldyr i en celle og vævsspecifik måde. Til dato har 25 S100 protein medlemmer blevet beskrevet hos mennesker. Medlemmer af S100-proteinet er blevet vist at regulere et antal biologiske processer som cellecyklus, cellemotilitet, signaltransduktion, proteinphosphorylering, transkription, celleoverlevelse og apoptose, relateret til en normal udvikling og carcinogenese [1,2]. På trods af disse forskellige funktionelle roller, behøver S100 proteiner ikke i besiddelse af enzymatiske aktiviteter for at redegøre for deres cellulære aktiviteter [3,4]. En af mekanismerne for deres forskellige cellulære funktioner er evnen hos flertallet af S100-proteiner til at interagere direkte med en række andre cellulære proteiner, derved at modulere deres funktioner [3]. Flere medlemmer af S100-proteiner kan danne homodimerer /oligomerer (for eksempel: S100A4 [5], S100B [6]) eller heterodimerer (f.eks interaktioner mellem S100A8 og S100A9 [7], mellem S100A4 og S100A1 [8], mellem S100B og S100A6 [6]), og disse homo /heterodimer- formation anses for at være vigtige for deres cellulære funktioner.

S100A14 er en nyere tilføjelse til S100 proteinfamilien [9,10]. Differentiel ekspression af S100A14 er blevet rapporteret i et antal humane cancere [9,11]. Vi har for nylig rapporteret en rolle S100A14 i reguleringen af ​​spredning og invasion af orale planocellulære karcinomer (OSCCs) [12,13]. S100A14 fandtes at modulere ekspression af adskillige molekyler, herunder p21, MMP1 og MMP9 i OSCC-afledte celler [12,13]. Desuden har den biologiske rolle af dette protein blevet rapporteret i andre humane cancere, såsom spiserøret [14] og tyktarmskræft [15]. Imidlertid er den præcise mekanisme og molekylær signalering af S100A14 i human cancer ikke fuldt klarlagt. Bliver overvejende en membranøs protein [12] med N-myristoylering site ved N-terminus [9], kan det spekuleres, at S100A14 kan interagere med andre proteiner potentielt er involveret i signaltransduktion. Derfor har S100A14 blevet vist at interagere på en calciumafhængig måde med nucleobindin [10], et protein foreslået at være involveret i G-protein-koblede signaltransduktion [16]. Imidlertid har evne S100A14 til at danne heterodimerer med andre S100-proteiner ikke er blevet undersøgt. I denne undersøgelse, viser vi, at S100A14 interagerer med en anden S100 protein, det S100A16, og modulerer sit udtryk i humane kræftceller.

Materialer og metoder

Cell kultur og behandlinger

De orale pladecellecarcinom-afledte cellelinjer: CaLH3 [17], H357 [18], VB6 [19] og OSCC1 [13] blev dyrket som tidligere [12] beskrevet. HeLa-celler (ATCC, CCL-2

TM) blev rutinemæssigt opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (kat nr: D6429, Sigma) suppleret med 10% FCS. Alle cellelinier blev dyrket i befugtet miljø med 5% CO

2 ved 37 ° C. Fireogtyve timer før behandlingen med inhibitorer, 1,0×10

5 til 1,5×10

5 celler per brønd blev udpladet i 6-brønds plader. Celler blev behandlet med 0, 50, 100 eller 150 uM proteosomal inhibitor MG-132 (kat nr: C2211, Sigma) i 5 og 10 timer; 0, 50, 100 eller 150 uM lysosomale inhibitor chloroquin (kat nr: C6628, Sigma) i 24 timer og 200 ug /mL proteinsynteseinhibitor cycloheximid (kat nr: # 239.763, Calbiochem) i 0, 3, 5, 7 og 8 timer. Efter behandlinger blev celler lyseret med 1X RIPA-buffer og anvendt til immunoblotting. Ekspression af S100A16 protein blev beregnet i forhold til ekspression af GAPDH niveauer (ved hjælp af Multi Gauge software, Version 3.2, Fujifilm Corporation) og plottes som procent S100A16 protein tilbage efter cycloheximid behandling (data ikke vist). S100A16 halveringstid (

t

1/2) blev beregnet ved anvendelse af GraphPad prisme 5,03 til Windows (GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com).

Gær to- hybridscreening (Y-2H skærm)

de kodende sekvenser af human S100A14 blev fusioneret i ramme med GAL4 DNA-bindende domæne af pGBT9 vektoren til frembringelse pGBT9-S100A14 agn konstruktionen. Y-2H screening tjeneste blev købt fra tysk Cancer Research Center, Heidelberg, Tyskland. Kort fortalt pGBT9-S100A14 konstruktionen blev co-transficeret med humant cDNA keratinocytkulturer biblioteker i

Saccharomyces cerevisiae

. Positive kloner blev identificeret ved TRP1 udvælgelse på 0 mM 3-aminotriazol. Alle positive kloner blev sekventeret ved Sanger-sekventering. Detaljerne i pGBT9-S100A14 agn konstruktion og Y-2H screening protokoller er tilgængelige efter anmodning.

Co-immunopræcipitation (Co-IP)

CaLH3 celler blev lyseret i iskold lysisbuffer ( 1X RIPA buffer, kat nr: 89.901, Pierce Biotechnology), suppleret med protease (Halt proteaseinhibitorcocktail kit, kat nr: 78.410, Pierce Biotechnology) og phosphatase (phosphatase-cocktail 2, kat ingen p 5726, Sigma) hæmmere. Celleekstrakter blev klaret ved inkubation med protein A /G PLUS-Agarose (katalognr: sc-2003 Santa Cruz) i 30 minutter. Fem hundrede mikrogram-klaret celleekstrakt blev inkuberet med 3 ug polyklonalt kanin-anti-humant-S100A14 (kat nr: 10.489-1-AP, Proteintech) eller polyklonalt kanin-anti-humant-S100A16 antistof (11.456-1-AP, Proteintech) i 1 time ved 4 ° C på et roterende hjul i nærvær af 0-2 mM CaCl

2 eller 2 mM CaCl

2 med 5 mM EDTA. Kun lysat (uden antistof) og polyklonale anti-MMP9 antistof (kat nr: sc-10737, Santa Cruz, isotype matchet IgG) blev anvendt som kontroller til Co-IP. Derefter 70 pi af resuspenderet protein A /G PLUS-Agarose (katalognr: sc-2003 Santa Cruz) blev tilsat til lysatet-antistof blanding og inkuberet natten over ved 4 ° C på et roterende hjul. Efter inkubering blev perlerne centrifugeret ved 1000 x g i 5 minutter ved 4 ° C, og supernatanten blev kasseret. Perler blev vasket 4 gange med PBS, resuspenderet og koges ved 90 4 ° C i 5 minutter i 30 pi SDS-prøvebuffer og immunblottet med polyklonale kanin-anti-humant-S100A16 (11.456-1-AP, Proteintech, Chicago, IL, USA, 1 : 500 fortyndinger) eller polyklonale kanin anti menneske-S100A14 antistof (10.489-1-AP, Proteintech, 1: 1000 fortyndinger)

Konstruktion og transfektion af udtryk og shRNA vektorer

S100A14 ekspressionsvektor. blev konstrueret som tidligere [12] beskrevne. Humant cDNA kodende S100A16 blev amplificeret under anvendelse af primerparrene (F: 5′-ATCCCGCGGCAGGGAGATGTCAGACTGCTA-3 ‘og R: 5′-TGAGGATCCCTAGCTGCTGCTCTGCTG-3’) og subklonet i pRetroX-IRES-ZsGreen1 retroviral ekspressionsvektor (Clontech Laboratories, Inc., CA , USA). shRNA målretning

S100A14

mRNA blev konstrueret ved anvendelse af følgende oligonukleotider: shRNA1 (F: 5′- GATCCCCTTGTGTAAGAGCCAAAGAATTCAAGAGATTCTTTGGCTCTTACACAATTTTTGGAAA-3 ‘; R: 5’AATTTTTCCAAAAATTGTGTAAGAGCCAAAGAATCTCTTGAATTCTTTGGCTCTTACACAAGGG-3’), shRNA2 (F: 5’GATCCCCAGGGTCTTTAAGAACCTACTTCAAGAGA GTAGGTTCTTAAAGACCCTTTTTTGGAAA- 3 ‘; R: 5′- AATTTTTCCAAAAAAGGGTCTTTAAGAACCTAC TCTCTTGAAGTAGGTTCTTAAAGACCCTGGG-3′), shRNA3 (F: 5’- GATCCCCGAACCTACTTCCTAATCTCTTCAAGAGAGAGATTAGGAAGTAGGTTCTTTTTGGAAA-3 ‘; R: 5′- AATTTTTCCAAAAA GAACCTACTTCCTAATCTCTCTCTTGAAGAGATTAGGAAGTAGGTTCGGG-3’). Oligonukleotider blev udglødet og indsat i RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-DsRed-Express ekspressionsvektoren (kat nr.: 632.487, Clonetech). shRNA målretning

LacZ

genet blev anvendt som en kontrol for S100A14-shRNAs. Kræft cellelinjer blev inficeret med retrovirus afledt af emballage (Phoenix A) celler, sorteret (GFP /DsRed som en markør), formeret, verificeret for overekspression og knockdown af de respektive proteiner og anvendes til funktionelle assays.

RNA ekstraktion, cDNA syntese og kvantitativ RT-PCT (QRT-PCR)

Total RNA blev ekstraheret fra cancer cellelinjer hjælp RNeasy fibrøst væv mini kit-protokol (kat nr: 74704, Qiagen Inc. , Valencia, CA, USA). Efter fabrikantens anvisninger, blev 600 nanogram af total RNA omdannes til cDNA ved hjælp High-Capacity cDNA Archive Kit-system (kat nr: 4.368.814, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Alle QRT-PCR-amplifikationer blev udført på ABI Prism Sequence Detector 7900 HT (Applied Biosystems, Foster City, USA) som tidligere beskrevet [12]. TaqMan assay for

S100A16

(Hs00293488_m1) og SYBR grøn baserede QRT-PCR (med de samme primerpar som for konstruktion af S100A14 ekspressionsvektor) blev udført for at kvantificere

S100A16

S100A14

mRNA i cancer cellelinjer. Sammenligningseksempel 2

-ΔΔ Ct metode blev anvendt til at kvantificere relative mRNA-ekspression.

Immunblot

Femogtyve til fyrre ug protein blev løst i NuPAGE® Novex 4-12% eller 10 % Bis-TrisTris gel (Life Technologies, NY, USA) i NuPAGE® MOPS /MES SDS-løbebuffer (Life Technologies, NY, USA) og immunblottet med polyklonale kanin-anti-humant-S100A14 (10.489-1-AP, Proteintech, Chicago, IL, USA, 1: 1000 fortyndinger), polyklonale kanin-anti-humant-S100A16 (11.456-1-AP, Proteintech, Chicago, IL, USA, 1: 500 fortynding) og monoklonalt muse-anti human-p53 (sc-263, Santa Cruz bioteknologi, CA, USA, 1: 1000 fortyndinger) følgende standard western blot-protokol. Anti-GAPDH (sc-25.778, Santa Cruz, 1: 5000 fortyndinger) blev anvendt som en loading kontrol. Blots blev visualiseret ved hjælp af forøget kemiluminescens (Supersignal

® West Pico, Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) og billeder blev fundet på et Fujifilm Las-4000 scanner

Dobbelt indirekte immunofluorescens (DIF)

Anvendelse af OSCCs og deres tilsvarende normale slimhinde for DIF og immunhistokemi blev godkendt af det regionale udvalg for medicin og sundhed Etik, Western-Norge. Skriftligt samtykke blev opnået fra deltageren i undersøgelsen. Fem um sektioner af OSCCs og deres tilsvarende normale slimhinde blev de-paraffinized, rehydreret efter standardprocedurer og varmeinduceret epitopgenfinding blev udført i Tris-EDTA-buffer (pH 9,0) ved hjælp af mikrobølger (kat nr: NN-L564W, Panasonic, Osaka , Japan). Derefter blev første primære antistof (polyklonalt kanin-anti-S100A16 antistof, 11.456-1-AP, Proteintech, 1:50 fortyndinger) påført i 1 time ved stuetemperatur og vasket. Prøverne blev inkuberet med Fab-fragment ged anti-kanin IgG (katalog nr 111-007-003, Jackson ImmunoResearch, 1:50 fortyndinger) i 2 timer, for at muliggøre omskiftning af kanin IgG til gede Fab [20]. Derefter blev prøverne inkuberet med muse-anti-GoatDyLight 488IgG (kat nr 205-485-108, Jackson ImmunoResearch, 1:50 fortyndinger) sekundært antistof i 1 time, vasket, blokeret med 10% gedeserum i 1 time og det andet primære antistof , polyklonale kanin-anti-S100A14 (kat nr: 10.489-1-AP, Proteintech, 1: 600 fortyndinger), blev påført i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask, sekundært antistof gede-anti-kanin Alexa Fluor

® 568 (kat nr: A-11011, Invitrogen, 1: 200 fortyndinger) blev påført i 1 time, vasket og objektglassene blev monteret i forlænge

® Gold antifade reagens med DAPI (kat nr: P36935, Invitrogen). Prøver blev undersøgt ved hjælp af Leica TCS SP2 AOB’er (Leica Microsystems, Tyskland) konfokal laser mikroskop.

Enkelt og dobbelt immunhistokemisk (IHC)

Enkelt og dobbelt IHC blev udført på de serielle sektioner af OSCCs og deres tilsvarende normale slimhinde. Single IHC for S100A16 og S100A14 blev udført som tidligere [12] beskrevne. For dobbelt IHC blev fem um snit de-paraffinized, rehydreret efter standardprocedurer og varmeinduceret epitopgenfinding blev udført i Tris-EDTA-buffer (pH 9,0) ved hjælp af mikrobølger (kat nr: NN-L564W, Panasonic, Osaka, Japan) . Efter blokering med peroxidase blok og 10% gedeserum blev snit inkuberet med polyklonalt kanin-anti-S100A16 (kat nr: 11.456-1-AP, Proteintech Fortyndinger 1: 200) i 1 time ved stuetemperatur, vasket og anti-kanin sekundært antistof konjugeret med peberrodsperoxidase-mærket polymer (kat nr: K4011, DAKO, Golstrup, DK) blev påført, og reaktionsblandingen blev visualiseret under anvendelse IMMPACT VIP (kat nr: SK-4605, Vectorlabs, Californien, USA) som enzymsubstrat, hvilket resulterer i en lilla reaktionsprodukt. At forhindre krydsreaktivitet med efterfølgende immunhistokemisk reaktionen blev antistoffer af de første reaktioner denatureret ved opvarmning af prøverne i pH 6,0 Target Retrieval Buffer (kat nr: S1699, DAKO, Golstrup, DK) med mikrobølger er (1000 watt i 2 minutter og 250 watt i fem og et halvt minut, NN-L564W, Panasonic, Osaka, Japan) [21]. Bagefter blev snit inkuberet med peroxidase blok og 10% gedeserum igen og det andet primære antistof (polyklonalt kanin-anti-S100A14, 10.489-1-AP, Proteintech Fortyndinger 1: 1400) blev påført og vasket. Derefter anti-kanin sekundært antistof konjugeret med peberrodsperoxidase-mærket polymer (kat nr: K4011, DAKO, Golstrup, DK) blev påført og visualiseret med IMMPACT SG (kat nr: SK-4705, Vectorlabs, Californien, USA), hvilket resulterer i en grå reaktionsprodukt. Prøver blev derefter modfarvet med hæmatoxylin (kat nr: S3301, DAKO, Golstrup, DK), dehydreret og monteret med EuKit montering medium. Prøver blev undersøgt ved hjælp af Leica DMLB mikroskop.

Statistik

Data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse af middelværdien (SEM). Til statistiske analyser, Student’s-

t

test (parret) blev udført ved hjælp af GraphPad prisme 5,03 til Windows (GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com), med signifikansniveau på 5% .

Resultater

S100A16 blev identificeret som en vekselvirkning partner for S100A14 både

in vivo

i gærcellerne og

in vitro

i den mundtlige kræft- afledte celler

at identificere interagerende partnere S100A14, et humant cDNA keratinocyt bibliotek blev screenet med pGBT9-S100A14 agn konstruere i

Saccharomyces cerevisiae

. Ud af 54 positive kloner sekventerede blev menneske S100A16 identificeret 53 gange. DCAF8 blev identificeret til at være en falsk positiv interaktion partner S100A14. Interaktion mellem S100A14 og S100A16 proteiner blev verificeret ved co-immunoudfældning under anvendelse af oral cancer afledte CaLH3 cellelinje (figur 1A). Selvom tidligere rapporter viste øget samspil mellem andre S100 proteiner i nærværelse af stigende Ca

2 + koncentrationer, kunne vi ikke finde øget immunpræcipitation mellem S100A14 og S100A16 med stigende Ca

2 + koncentrationer (0,5 og 2 mM CaCl

2) (figur 1A). Imidlertid blev der ikke observeret nogen interaktion mellem S100A14 og S100A16 når 5 mM af divalent metalion chelator EDTA blev brugt sammen med 2 mM CaCl

2 (figur 1A). Omvendt co-immunoudfældning under anvendelse specifikt antistof for S100A16 yderligere bekræftet samspillet mellem S100A14 og S100A16 proteiner (figur 1B).

Fem hundrede mikrogram af præ-ryddet celle ekstrakt fra CaLH3 celler blev inkuberet med anti-S100A14 antistof i tilstedeværelsen af ​​0-2 mM CaCl

2 eller 2 mM CaCl

2 med 5 mM EDTA (A) eller anti-S100A16 antistof (B), efterfulgt af inkubation med protein A /G PLUS-Agarose. Immune komplekser blev immunoblottet med anti-S100A16 (A) eller anti-S100A14 antistof (B). Kun lysat (uden antistof) og anti-MMP9 antistof blev anvendt som kontroller til Co-IP. (A) M, molekylvægtmarkør; bane 1, input; bane 2, kun lysat; bane 3, kontrol-anti-MMP9 antistof; banerne 4-7 (anti-S100A14 antistof): bane 4, 0 mM CaCl

2; bane 5, 0,5 mM CaCI

2; bane 6, 2 mM CaCl

2; bane 7, 2 mM CaCl

2 med 5 mM EDTA. (B) bane 1, input; bane 2, kun lysat; bane 3, kontrol-anti-MMP9 antistof; bane 4, anti-S100A16 antistof med 0 mM CaCl

2.

S100A14 co-lokaliserer med S100A16 med eksemplarer af OSCCs og normal mundslimhinde

DIF og dobbelt IHC var udført i OSCCs og deres tilsvarende normale slimhinde til at undersøge sub-cellulære lokalisering af S100A14 og S100A16. DIF viste membranøs co-lokalisering af S100A16 og S100A14 proteiner i epitelcellerne af både normal mundslimhinden (figur 2A1-A4) og OSCC (Figur 2B1-B4). Parallelt med disse resultater blev membranøs co-lokalisering af disse proteiner også observeret på de serielle sektioner af normal mundslimhinden (figur 2C1-C3) og i den invaderende ø OSCC (godt differentieret læsion) (figur 2D1-D3) ved en enkelt og dobbelt IHC.

Cellulær lokalisering af S100A14 og S100A16 blev undersøgt ved at udføre DIF og IHC i sektioner af formalin faste og paraffinindlejret OSCC og normale orale slimhindevæv. Overvejende membranøs lokalisering af S100A16 (grøn), S100A14 (rød) og S100A16 /A14 (gul) blev visualiseret i epitelcellerne af normal mucosa (A1-A4) og OSCC (B1-B4) væv ved DIF (Epth, epitel; CT , bindevæv). Tilsvarende med enkelt og dobbelt IHC på serielle snit, overvejende membranøs ekspression af S100A16 (lilla), S100A14 (grå) og S100A16 /A14 (blandet farve) blev detekteret i den normale slimhinde (C1-C3) og i OSCC (D1 -D3).

S100A16 protein, men ikke mRNA-ekspression reguleres af S100A14 i forskellige humane cancer cellelinjer

den biologiske betydning af interaktionen mellem S100A14 og S100A16 blev næste undersøgt af overudtrykker S100A14 i et antal humane cancer cellelinier (CaLH3, VB6, H357, OSCC1 og HeLa) under anvendelse af en retroviral medieret genekspression strategi. S100A16 protein niveauer blev fundet at blive forøget i alle cellelinjer undersøgte efter overekspression af S100A14 (figur 3A). Desuden shRNA medieret knock-down af S100A14 var forbundet med undertrykkelse af S100A16 protein i CaLH3 og OSCC1 cellelinier (figur 3B). Der var imidlertid ingen stigning i mRNA ekspressionsniveauerne af S100A16 i disse S100A14 over-udtrykkende cancer cellelinjer (figur 3C).

(A) retroviralt forårsagede overekspression af S100A14 var forbundet med samtidig up- regulering af S100A16 protein i CaLH3, VB6, H357, OSCC1 og HeLa celle-linjer (-, kontrol konstruktion, +, S100A14 udtryk konstruktion). (B) Derudover shRNA medieret knock-down af S100A14 i CaLH3 og OSCC1 cellelinier blev forbundet med nedregulering af S100A16 protein (-, kontrol konstruktion, +, S100A14 shRNA konstruktioner). (C) Der var imidlertid ingen effekt på mRNA-ekspressionsniveauerne af

S100A16

ved overekspression S100A14 i CaLH3, VB6, og H357 cellelinjer.

S100A14

S100A16

mRNA ekspressionsniveauerne blev normaliseret til

GAPDH

mRNA-ekspression. Fejl- søjler repræsenterer SEM af 3 biologiske replikater gjort i 3 tekniske replikater. Student’s-

t

test (parret) blev udført til statistisk analyse.

S100A16 regulerer ikke udtryk for

S100A14

mRNA eller protein i human cancer celle- linjer

Vi undersøgte næste hvorvidt S100A16 overekspression er også forbundet med den samtidige ændring i ekspressionen af ​​S100A14 i cancer cellelinjer. Der var ingen væsentlig ændring hverken i mRNA (figur 4A) eller proteinniveauer (figur 4B) af S100A14 efter overekspression af S100A16 hjælp retrovirale ekspressionskonstruktioner.

Der var ingen virkning i mRNA (A) eller protein (B) ekspressionsniveauer af S100A14 efter retroviral medieret overekspression af S100A16 i CaLH3 og H357 cellelinier (-, kontrol konstrukt, +, S100A16 ekspressionskonstruktion).

S100A14

S100A16

mRNA ekspressionsniveauerne blev normaliseret til

GAPDH

mRNA-ekspression. Fejl- søjler repræsenterer SEM af 3 biologiske replikater gjort i 3 tekniske replikater. Student’s-

t

test (parret) blev udført til statistisk analyse.

Både S100A16 og S100A14 proteiner nedbrydes intracellulært af mekanisme (r) uafhængigt af proteasomalaktivitet og lysosomale veje

Brug cycloheximid behandling blev tidsafhængig nedbrydning af S100A16 og S100A14 observeret både i kontrollen og S100A14 overudtrykker CaLH3 celler (figur 5A). Der var ikke en signifikant forskel i S100A16 halveringstid (

t

1/2) mellem kontrol og S100A14 overekspression CaLH3 celler (~ 4,8 timer versus ~ 5,0 timer) (figur 5A). Proteasomalaktivitet og lysosomale veje er involveret i nedbrydningen af ​​størstedelen af ​​intracellulære proteiner. Den proteasomalaktivitet inhibitor MG-132 effektivt blokerer den proteolytiske aktivitet af proteasom [22], og den lysosomale inhibitor chloroquin hæmmer lysosomale hydrolaser ved at reducere forsuring af endosomale /lysosomale rum [23]. Ved behandling af de CaLH3 og HeLa-celler med proteasomalaktivitet (MG-132) og lysosomale (Chloroquin) inhibitorer, vi næste undersøgt, om disse veje var involveret i nedbrydningen af ​​S100A16. Ingen mærkbar stigning i niveauerne af S100A16 blev observeret efter inhibering af proteasomalaktivitet (data for 10 timers behandling med MG-132 ikke vist) (figur 5B) eller lysosomale pathways (figur 5C). Niveauet af p53, der anvendes som en positiv kontrol for de proteasomalaktivitet inhiberingsforsøg, blev forøget som forventet med MG-132 behandling (figur 5B). Desuden blev ingen mærkbar opregulering af S100A16 og S100A14 observeret enten i kontrollen eller i S100A14 overekspression CaLH3 celler med MG-132 (figur 5D) eller chloroquin behandlinger (figur 5E).

(A ) Kontrol og S100A14 over-udtrykkende CaLH3 celler blev behandlet med proteinsynteseinhibitor cycloheximid i en tidsforløbet (0, 3, 5, 7 og 8 timer), og hele cellelysater blev immunoblottet med anti-S100A16 og -S100A14 antistoffer. Relativ S100A16 ekspression (normaliseret til GAPDH protein ekspression) blev plottet mod tidsforløbet og halveringstid (

t

1/2) beregnedes for både kontrol- og S100A14 overudtrykker CaLH3 celler (data ikke vist). -, Kontrol konstrukt; +, S100A16 ekspressionskonstruktionen. Cyclo, cycloheximid.

(B) CaLH3 og HeLa cellelinier blev behandlet med forskellige koncentrationer af proteasomalaktivitet inhibitor MG-132 (0-150 uM) i 5 og 10 timer (data for 10 timer ikke vist) og helcellelysater blev immunoblottet med anti-S100A16 og p53 antistoffer. Behandling med MG-132 er associeret med opregulering af p53 (anvendt som en positiv kontrol for de proteasomalaktivitet inhiberingseksperimenter), men ikke S100A16 i både cellelinjer. Salg

(C) CaLH3 og HeLa cellelinier blev behandlet med forskellige koncentrationer af lysosomale inhibitor chloroquin (0-150 uM) i 24 timer og hele cellelysater blev immunoblottet med anti-S100A16 antistof. Chloroquin behandling er ikke forbundet med ændringer i S100A16 ekspression i både cellerne-linjer. Koncentrationer på over 50 uM chloroquin resulterede i overdreven HeLa celledød og således ikke anvendt i eksperimentet. Chlor, chloroquin.

(D) Kontrol og S100A14 overudtrykker CaLH3 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af proteasomalaktivitet inhibitor MG-132 (0-150 uM) i 5 timer og hele cellelysater blev immunoblottedes med anti- S100A16 og -S100A14 antistoffer.

(E) Kontrol og S100A14 overudtrykker CaLH3 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af lysosomale inhibitor chloroquin (0-150 uM) i 24 timer og hele cellelysater blev immunoblottedes med anti- S100A16 og -S100A14 antistoffer. Chlor, chloroquin.

Diskussion

På trods af de forskellige funktionelle roller af S100 proteiner udbyggede disse proteiner ikke besidder nogen enzymatisk aktivitet for at redegøre for deres forskellige cellulære funktioner [3,4 ]. En af de mekanismer, som S100 proteiner udfører deres forskellige cellulære funktioner er gennem interaktion med og modulerende funktioner andre effektor proteiner. Vi har for nylig [12,13] og andre [14,15] vist en funktionel rolle S100A14 i human carcinogenese. Inddragelse af S100A14 i reguleringen af ​​oral cancer celledeling og invasion, ved at modulere ekspressionen af ​​flere molekyler, herunder p21, MMP1 og MMP9, blev rapporteret af vores seneste undersøgelser [12,13]. Disse resultater førte os til at undersøge potentielle interaktion partnere S100A14 som kunne modulere dets cellulære funktioner. Brug Y-2H-skærm, identificerede vi S100A16, et andet medlem af S100 protein familien, som den eneste sande interaktion partner S100A14. Dette fund var temmelig overraskende af flere grunde. For det første, i betragtning af dens mange funktioner i tumorigenese med samtidig modulation af ekspressionen af ​​flere andre molekyler, blev S100A14 forventes at interagere med mange cellulære proteiner til at udføre sine forskellige funktioner. For det andet er tilstedeværelsen af ​​N-myristoylering site ved N-terminalen af ​​S100A14 protein antyder, at dette protein kan interagere med andre proteiner potentielt er involveret i signaltransduktion [9]. For det tredje, S100A14 er allerede blevet vist at interagere med andre cellulære proteiner, såsom nucleobindin [10] og RAGE [14], men disse proteiner blev ikke påvist i den aktuelle skærm Y-2H. Men resultaterne af vores aktuelle skærm Y-2H er i overensstemmelse med tidligere Y-2H-skærme til forskellige S100 proteiner. Svarende til vores resultater, interagerende partnere til andre S100 proteiner fra tidligere Y-2H skærme er også i høj grad domineret af S100 protein isoform (er) (revideret i 24). En af de foreslåede årsager til S100 isoform domineret interaktion i Y-2H kunne være en funktion af tæt kontrolleret intracellulær Ca

2+ koncentration (200 nM) i gærceller [25], som er langt under calcium

K

d-værdier for mange S100 proteiner (10-50 um) og som kan begrænse interaktionen mellem S100 bytte og dets ikke-S100 interaktionspartnere, der kræver streng Ca

2+ koncentration for interaktionen finder sted. Men i modsætning til mange andre S100-proteiner, har strukturelle analyser foreslået, at både S100A14 og S100A16 er lave affinitet Ca

2 + ion bindemidler med minimale konformationsændringer efter binding med Ca

2+ [26,27] og dermed streng Ca

2+ koncentration måske ikke nødvendig for samspillet mellem disse to proteiner. Faktisk ved at øge Ca

2+ koncentration, øget immunopræcipitation blev ikke observeret mellem S100A14 og S100A16 i den aktuelle undersøgelse (figur 1A). Der blev dog opdaget nogen interaktion mellem S100A14 og S100A16 når 5 mM af divalent metalion chelator EDTA blev anvendt (figur 1A). Tilsammen tyder disse resultater på, at samspillet mellem S100A14 og S100A16 er afhængig af de basale niveauer af Ca

2+ og muligvis andre divalente metalioner i cellerne og øger koncentrationen af ​​Ca

2+ ikke nødvendigvis forbedre interaktion muligvis fordi både S100A14 og S100A16 er fattige Ca

2 + ringbind med halvåbent konformation selv i apo-state, og denne kropsbygning måske ikke nødvendigvis ændrer selv efter binding Ca

2 + ioner.

i overensstemmelse med resultaterne af Y-2H og co-immunopræcipitation blev co-lokaliseret udtryk for S100A14 og S100A16 observeret i OSCCs og tilsvarende normale slimhinde (figur 2), hvilket indikerer en mulig funktionelle betydning af denne interaktion. Faktisk overekspression og knock-down af S100A14 i flere cancer-cellelinjer var associeret med samtidig op- og nedregulering af S100A16 protein (figur 3A og B), men ikke mRNA (figur 3C). Disse fund indikerer, at S100A14 regulerer ekspression af S100A16 ikke på det transskriptionelle niveau, men muligvis ved post-transkriptionel eller translationel regulering. I modsætning blev ingen mærkbar virkning observeret både på mRNA’et og proteinet niveauer af S100A14 når S100A16 var overudtrykt i cancer-cellelinjer (figur 4A og B), hvilket tyder på en ensrettet regulering mellem S100A14 og S100A16 hvor kun S100A14 regulerer protein overflod af S100A16. Svarende til S100A14, har nylige undersøgelser vist differentiel ekspression af S100A16 i forskellige humane maligniteter, hvilket tyder på en rolle af dette protein i humane cancere [28]. I betragtning af den rolle S100A14 i oral cancer celleproliferation og invasion [12,13], og dens evne til at regulere ekspressionen af ​​S100A16 kan det spekuleret på, at S100A14 \\ S100A16 heterodimer kan have en funktionel betydning i humane cancerceller.

Efter at have observeret en stigning kun i S100A16 protein og ikke i

S100A16

mRNA udtryk, når S100A14 var overudtrykt i kræftcellerne, vi spekuleret på, at S100A14 kan være involveret i reguleringen af ​​S100A16 protein nedbrydning.