PLoS ONE: Knock-Down af Core Proteiner Regulering MicroRNA Biogenese har ingen effekt på følsomhed Lung Cancer Cells for ioniserende Radiation

Abstrakt

Nylige undersøgelser understreger den vigtige rolle, microRNA (miRNA) i udviklingen af ​​lunge kræft. De vigtigste regulatorer af miRNA biogenese er ribonucleaser drosha, Dicer og Ago2. Her rolle kerneproteiner af miRNA biogenese maskiner i responset af humane ikke-små og småcellet carcinom-cellelinier til behandling med ioniserende stråling blev vurderet. Vi fandt, at drosha og Dicer blev udtrykt ved højere niveauer i radioresistente men ikke i følsomme cellelinjer. Men nedregulering af enten Dicer eller drosha havde ingen effekt på følsomheden af ​​celler til bestråling. Fjernelse af komponenter af RNA-inducerede lyddæmpning kompleks Ago2 og Tudor stafylokoknuklease heller ikke bevidstgøre celler til den samme behandling. Således modulation af miRNA biogenese maskiner er ikke tilstrækkeligt til at forøge radiosensitivitet af lunge tumorer og andre strategier er forpligtet til at bekæmpe lungekræft

Henvisning:. Surova O, Akbar NS, Zhivotovsky B (2012) Knock-Down af Core Proteiner Regulering MicroRNA Biogenese har ingen effekt på følsomhed Lung Cancer Cells for ioniserende stråling. PLoS ONE 7 (3): e33134. doi: 10,1371 /journal.pone.0033134

Redaktør: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, USA

Modtaget: November 29, 2011; Accepteret: 5 feb 2012; Udgivet: 30 marts, 2012 |

Copyright: © 2012 Surova et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra den svenske Forskningsråd, den svenske og Stockholm Cancer Societies, den svenske Childhood Cancer Foundation, svensk Selskab for Medicinsk Forskning, det russiske ministerium for High Uddannelse og Videnskab (11.G34.31.0006), EF-RP 6 (Chemores) samt FP7 (APO-SYS) programmer. OS blev støttet af et stipendium fra det svenske institut og Karolinska Institutet og NA af Higher Education Kommissionen Pakistan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft (LC) er en førende årsag til kræft dødelighed på verdensplan i både kvinder og mænd. Der er to hovedtyper af denne neoplasi, småcellet lungecarcinom (SCLC) og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), som adskiller sig betydeligt i deres histopatologiske træk og reaktioner på behandling. Ioniserende stråling, alene eller i kombination med kirurgi eller kemoterapi, er en effektiv behandling for mange cancertyper, herunder LC. Men både iboende og erhvervet tumor radioresistance høj grad reducere effekten af ​​strålebehandling for NSCLC og SCLC og ofte fører til tilbagefald og metastaser. Derfor er det af stor betydning at udforske de molekylære mekanismer bag modstanden i LC celler til stråling.

MikroRNA’er (miRNA), ikke-protein kodning, enkelt-strengede RNA af 19-25 nukleotider, udgør en roman klasse af gen regulatorer og er blevet rapporteret at spille en kritisk rolle i transformation kræft [1]. Nylige undersøgelser viste den afvigende ekspression af miRNA i LC [2] – [5]. Produktionen af ​​miRNA kræver et sæt af proteiner kollektivt benævnt miRNA maskiner. Afvigende ekspression af komponenter af miRNA maskiner er blevet impliceret i tumorigenese, herunder LC [6], [7]. Der er rapporteret opregulering af Dicer i lungeadenocarcinom og dens mulige rolle i udviklingen af ​​perifere adenocarcinomer [7]. Høj ekspression af andre RNA-induceret silencing kompleks (RISC) proteiner, fragilt X mental retardering syndrom-relateret protein 1 (FXR1), Tudor-SN (TSN) og protein aktivator af interferon-inducerede protein kinase (PACT), er blevet demonstreret i SCLC [7]. En anden gruppe beskrevet en sammenhæng mellem reduceret Dicer udtryk og dårlig prognose i LC patienter [8]. Således er yderligere undersøgelser nødvendige for yderligere at belyse den rolle, miRNA maskiner i den molekylære patogenese LC. For nylig er der rapporteret den potentielle terapeutiske virkning Dicer udtømning på kemosensitivitet og proliferation af brystcancerceller. Den knock-down af Dicer af siRNA ført til nogen betydelig G1 arrest og øget følsomhed over for DNA-beskadigende middel, cisplatin, i brystcancer-cellelinie MCF-7 [9]. I betragtning af de fundamentale og flere biologiske roller miRNA i forskellige cellulære processer, kan modulation af ekspressionen af ​​proteiner involveret i miRNA biogenese være en lovende terapeutisk tilgang til videre klinisk anvendelse. Til dato er der ingen data om den rolle, miRNA-producerende proteiner i resistensmekanismer /følsomhed LC celler til behandling. Derfor undersøgte vi, om udtømningen af ​​kerneproteiner involveret i miRNA biogenese påvirker modstanden af ​​LC til strålebehandling. Overraskende knock-down af ekspressionen af ​​drosha, Dicer, Argonaute2 og Tudor-SN ved RNA-interferens ikke øge følsomheden af ​​NSCLC celler, der var resistente over for behandling med ioniserende stråling.

Materialer og Metoder

Cell Kultur og behandlinger

Menneskelig NSCLC cellelinjer U1810, U1299 (begge fra UU samling), A549, H661, H157, H23 (alle fra ATCC); og SCLC-cellelinier H69 (ECACC), H82 (ATCC), U1906, U1690, U2020, U1285 (alle fra UU samling) blev opretholdt i RPMI 1640 medium suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), glutamin ( 2 mM), penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 ug /ml) (alle opnået fra Gibco) ved 37 ° C, 5% CO

2 og 95% fugtighed. Celler blev udsat for bestråling i en dosis på 8 Gy ved hjælp af en

60Co kilde (Karolinska BIOMICS Center, Karolinska Universitetshospital) for de angivne perioder i figuren legender.

Evaluering af Apoptose

Apoptose blev bestemt af mængden af ​​celler i sub-G1-fasen. Cellerne blev trypsinbehandlet og resuspenderet i phosphatpufret saltopløsning (PBS) indeholdende 0,1% FBS. I alt 1 × 10

6 celler blev anvendt til analyse. Cellerne blev pelleteret ved 2000 rpm og vasket en gang i PBS. Pelleten blev resuspenderet i 250 pi iskold PBS og blandet med 2 ml iskold 70% ethanol dråbevis under vortexbehandling. Prøver blev holdt ved 4 ° C i 24 timer og derefter pelleteret ved 2000 rpm og vasket to gange med PBS. Efter den sidste vask blev cellerne resuspenderet i 360 pi PBS indeholdende 100 ug /ml RNase-A (Fermentas) og inkuberet ved 37 ° C i 1 time. Forty pi propidiumiodid opløsning (lager ved 0,5 mg /ml) blev tilsat til prøverne, efterfulgt af inkubation i 30 minutter ved stuetemperatur under forsigtig svingning og beskyttelse mod lys. Celler blev analyseret med flowcytometri (FACScan, Becton Dickinson), og data blev vurderet ved anvendelse Cell Quest software.

Caspase aktivitetsassay

Celler blev vasket med iskold PBS, resuspenderet i 25 pi PBS, lyseret ved frysning i flydende nitrogen, inkuberet med caspase-3-lignende substrat og analyseres som beskrevet tidligere [10]. Caspase aktivitet blev udtrykt som fold stigning i forhold til passende kontroller.

siRNA transfektion

siRNA’er rettet mod human Dicer1, drosha, Argonaute2 og ikke-targeting siRNA som en negativ kontrol blev opnået fra Thermo Scientific Dharmacon® og opbevaret ved en koncentration på 20 uM. Fireogtyve timer inden transfektion blev celler podet på plader med 6 brønde i vækstmedier uden antibiotika. siRNA’er blev fortyndet i 100 pi RPMI 1640-medium (Gibco) og blandet med 1 pi DharmaFECT®1 siRNA transfektionsreagens (Thermo Scientific Dharmacon®). Efter 20 minutters inkubation blev komplekserne tilsat til cellerne til opnåelse af en slutkoncentration på siRNA’er i mediet på 50 nM. Otteogfyrre timer efter transfektion blev mediet udskiftet, og cellerne blev udsat for bestråling.

Western Blot Detection

Celler blev lyseret ved anvendelse af Hel lysepuffer (Roche) plus proteasehæmmer cocktail (PIC, Komplet-M, Roche). Proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse af BCA-proteinassay (Pierce). Efter blanding med Laemmli buffer blev prøver underkastet SDS-PAGE og Western blotting. For immunodetektion blev følgende antistoffer anvendt: anti-Dicer, anti-spaltet PARP, anti-spaltet caspase-3, anti-spaltet caspase-9 (alle opnået fra Cell Signaling Technology), anti-Ago2, anti-drosha (begge fra Millipore), anti-XPO5, anti-PRKRA (PACT) (begge fra Abnova), anti-FXR1 (Santa Cruz Biotechnology), anti-β-actin (Sigma-Aldrich), og anti-GAPDH (Trevigen). Peberrodsperoxidase-mærket anti-muse- eller anti-kanin-sekundære antistoffer (Pierce) og en forøget kemiluminescens-kit (Western blot-påvisningsreagens, GE Healthcare UK Limited) blev anvendt til påvisning af anerkendte proteiner. Densitometrisk analyse til kvantificering af det relative niveau af protein-ekspression blev udført ved hjælp af ImageJ software (https://rsbweb.nih.gov/ij/).

Real-Time kvantitativ PCR

RNA var isoleret fra celler ved anvendelse af en PureLink ™ RNA Mini Kit (Invitrogen). Revers-transkriberede cDNA’er fra prøverne blev anvendt som templates. Argonaute2 (Ago2 venstre ctaccttcccctggaggtctg og Ago2 højre cgacctagcagtcgctctga) og 18S ribosomale RNA (18S-1 cgctactaccgattggatggtt og 18S-2 agtcaagttcgaccgtcttctc) primere (Invitrogen) blev designet til at matche målet cDNA sekvensen. Tyve ng af revers-transkriberede cDNA-skabelon blev blandet med SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) og amplificeret ved anvendelse af en 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) med følgende program: 40 cykler, hvor hver cyklus bestod af en denatureringstrin ved 95 ° C i 15 s og en annealing /forlængelsestrin ved 60 ° C i 1 min.

statistisk vurdering

resultaterne af tre uafhængige forsøg blev udtrykt som middelværdien ± SEM Statistisk vurdering blev udført ved hjælp af en ikke-parret t-test.

Resultater

Angivelse af proteiner involveret i miRNA Biogenesis i NSCLC og SCLC

For at identificere molekylære mål for den radiosensibilisering af LC-celler blandt proteiner involveret i miRNA biogenese udførte vi et protein ekspression analyse af syv centrale miRNA maskinkomponenter i et panel af NSCLC og SCLC (seks cellelinier i hvert panel). For hver LC undertype cellelinierne blev udvalgt på grundlag af deres radiosensitivitet, som målt ved den del overlevende efter udsættelse for 2 Gy (SF2) i en klonogen overlevelse assay og grupperet i radiosensitive (RS) med SF2 0,3 Gy eller radioresistente (RR) med SF2 ≥ 0,3 Gy [11] – [14]. De basale niveauer af alle proteiner (drosha, Dicer, exportin-5 (XPO5), Tudor-SN (TSN), protein aktivator af interferon-inducerede protein kinase (PACT), fragilt X mental retardering syndrom-relateret protein 1 (FXR1) og Argonaute2 (Ago2) blev vurderet ved Western blot i alle valgte cellelinjer før bestråling (figur 1A). Begge RNase III enzymer (drosha og Dicer) blev udtrykt ved forholdsvis høje niveauer i NSCLC celler sammenlignet med SCLC. Et medlem af karyopherins protein familie, XPO5, som er involveret i den nukleare eksport af miRNA, blev udtrykt på et højere niveau i H661, mens lave niveauer af udtryk blev set i H69 og U1690 forhold til de resterende cellelinjer. niveauet af ekspressionen af ​​TSN, PACT, FXR1 og Ago2 proteiner ikke varierede dybt mellem de forskellige cellelinjer, med undtagelse af H69, som udviste lavere ekspression af alle de undersøgte proteiner. som vores panel bestod af både RS og RR celler blev H23-cellelinje valgt som repræsentative for radiosensitive celler, blev og U1810 og H661 brugt som repræsentanter for radioresistente celler i yderligere undersøgelser. Densitometrisk analyse af protein-ekspression afslørede, at Dicer, drosha og XPO5 blev udtrykt ved højere niveauer i RR celler sammenlignet med RS, hvorimod der ikke var nogen klar sammenhæng mellem niveauerne af ekspressionen af ​​Ago2, TSN, PACT og FXR1 og SF2 værdier (Figur 1B) .

(A) Western blot-analyse af niveauet af proteinekspression af drosha, Dicer, exportin 5 (XPO5), Tudor-SN (TSN), protein aktivator af interferon-inducerede protein kinase (PACT), fragilt X mental retardering syndrom-relateret protein 1 (FXR1) og Argonaute 2 (AGO2) i et panel af NSCLC (U1810, U1299, A549, H661, H157, H23) og SCLC (U1285, H82, H69, U1690, U1906, U2020 ) cellelinier. (B) Densitometrisk analyse af relative niveauer af proteinekspression i H23, H1299, U1810 og H661 cellelinier. Cellelinjer fordelt på radiosensitivitet, målt som fraktionen overlevende 2 Gy (SF2). Lige belastning blev verificeret ved anvendelse af anti-p-actin-antistoffer. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Effekt af ioniserende stråling på miRNA Maskiner i NSCLC

For yderligere at undersøge den rolle miRNA maskinkomponenter i svaret fra LC celler til bestråling, to RR cellelinier (U1810 og H661) og en RS linje (H23) fra panelet af NSCLC blev udsat for gamma-bestråling og proteinekspression blev analyseret 6, 24 og 48 timer efter behandling. Som forventet blev massiv apoptotisk celledød observeret i H23 ved 6 timer efter ioniserende stråling, som vurderet ved spaltningen af ​​PARP, mens H661 og U1810 reagerede på behandling på senere tidspunkter efter 24 og 48 timer, henholdsvis (figur 2). blev påvist nogen synlige ændringer i ekspression af nogen af ​​de undersøgte proteiner enten i RR eller RS ​​celler, som målt ved Western blot ved 6, 24 og 48 timer efter IR behandling (figur 2). Således ikke gammastråling ikke påvirker ekspressionen af ​​kerneproteiner af miRNA maskiner i NSCLC uanset RR eller RS ​​fænotype af disse cancerceller.

Spaltningen af ​​PARP og niveauet af ekspression af drosha, Dicer, exportin 5 (XPO5), Tudor-SN (TSN), protein aktivator af interferon-inducerede protein kinase (PACT), og fragilt X mental retardering syndrom-relateret protein 1 (FXR1) i U1810, H661 og H23 celler blev detekteret ved Western skamplet på 6, 24 og 48 timer efter bestråling med 8 Gy. Lige belastning blev verificeret ved anvendelse af anti-p-actin-antistoffer. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Knock-down af Core proteiner involveret i det første skridt af miRNA Biogenese er ikke tilstrækkeligt at bevidstgøre NSCLC Celler til Bestråling

Da niveauet af proteinekspression af mindst tre miRNA maskinkomponenter, Dicer, drosha og XPO5, var positivt korreleret med radioresistance af NSCLC celler, kan det høje niveau af deres udtryk bidrager til tumorcellerne reaktion på behandling i et miRNA-styret måde. For at undersøge denne mulighed, vi besluttede at undersøge mulighederne sensibiliserende virkning af nedregulering af Dicer og drosha proteiner i U1810 cellelinje. Det nukleare ribonuklease drosha og cytoplasmatiske ribonuklease Dicer er de to vigtigste regulatorer af det første trin af miRNA produktion og fremme spaltning af lange primære udskrifter i hårnål mellemprodukter (pre-miRNA) og efterfølgende spaltning til modne miRNA. Ved at fjerne en af ​​disse to kerneproteiner forventede vi derfor at mindske miRNA produktion og påvirke radioresistance af NSCLC-celler.

knock-down af Dicer i U1810-celler blev udført under anvendelse af RNA-interferens, hvorefter cellerne blev udsat for gamma-bestråling og analyseret 48 timer efter behandling. Den komplette silencing af Dicer proteinekspression blev bekræftet ved Western blot før og efter bestråling (figur 3A). Nedregulering af Dicer blev efterfulgt af nedsat produktion af flere miRNA (miR1301, miR1249, miR1227, miR532-3p, miR625, miR1827, miR324-5p) som vurderet ved real-time PCR (data ikke vist). Imidlertid U1810 celler med forarmet Dicer udviste så stærk reaktion på ioniserende stråling, som gjorde vildtypeceller. Der var ingen forskelle i spaltningen af ​​PARP mellem kontrol og Dicer bankede-down-celler (figur 3A). Procentdelen af ​​apoptotiske celler efter bestråling var den samme i alle undersøgte grupper (figur 3B). Analyse af aktivering af caspaser viste, at caspase-3 og -9 lige blev forarbejdet efter bestråling, og at caspase-3-lignende aktivitet var næsten identisk i begge vildtype og Dicer-udtømte celler (figur 3A og C). En lignende effekt på radioresistance var tydelig, når drosha blev udtømt i U1810 celler. Der blev ikke påvist ændringer i PAPR spaltning (figur 3D) eller antallet af apoptotiske celler (figur 3E) blandt kontrol og drosha bankede-down celler 48 timer efter ioniserende radiaiton. Lignende resultater blev opnået efter fjernelse af Dicer og drosha fra andre NSCLC cellelinjer (figur S1 og S2). Samlet antyder disse data at knock-down af enten Dicer eller drosha, ikke var tilstrækkelig til at sensibilisere NSCLC celler for gamma-bestråling

(A) Niveauet for Dicer ekspression, spaltning af PARP og behandling af caspase-3 og. – 9 i U1810-celler transficeret (48 h) med kontrol (si scr) eller Dicer (siDicer) siRNA vurderes af Western blot 48 timer efter bestråling. Lige belastning blev verificeret ved hjælp af anti-GAPDH antistoffer. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (B) Påvisning af apoptotisk celledød i U1810 bedømmes ved at måle sub-G1 befolkning efter transfektion (48 h) med kontrol eller Dicer siRNA og strålebehandling (48 h). (C) Caspase-3-lignende aktivitet (fold stigning i forhold til kontrol) i U1810-celler efter behandling med enten alene eller i kombination med transfektion af bekæmpelse, Dicer siRNA bestråling (for detaljer se materialer og fremgangsmåder). (D) Niveauet af drosha ekspression og spaltning af PARP i U1810-celler transficeret (48 h) med kontrol (si scr) eller drosha (siDrosha) siRNA analyseret ved Western blot 48 timer efter behandling med bestråling. Lige belastning blev verificeret ved hjælp af anti-GAPDH antistoffer. Alle data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (B) apoptotisk celledød i U1810 målt ved analyse af sub-G1 befolkning efter transfektion (48 h) med kontrol eller drosha siRNA og strålebehandling (48 h). De viste resultater er middelværdien ± middelfejl. af tre uafhængige forsøg.

nedregulering af hovedkomponenter i RNA-induceret Silencing Complex (RISC) ikke oplysningsvirksomhed over for NSCLC Celler til Bestråling

Siden udtømning af centrale proteiner af første skridt af miRNA biogenese påvirkede ikke radiosensitivitet af NSCLC, er det muligt, at RNA-interferens-medieret knock-down af enten Dicer eller drosha resulterer i en betydelig reduktion, men ikke det fulde tab, af modent miRNA på grund af den lange halv- livet af modne molekyler. miRNA er stabile, når de træder ind i effektor-komplekset. Derfor besluttede vi at blokere det andet trin af miRNA biogenese af knock-down af de to vigtigste komponenter i RISC, Argonaute2 og Tudor-SN, og dermed etablere deres rolle i radioresistance af LC celler. Den effektive nedregulering af ekspression af Ago2 i U1810-cellelinien blev bekræftet ved måling af dets mRNA-ekspression, som blev reduceret med op til 95% efter transfektion med anti-Ago2 siRNA (figur 4A). Alligevel den apoptotiske respons (vurderet ved PARP-spaltning og behandling af caspase-3 og -9) udvises af Ago2-udtømte celler efter bestråling var så stærk som i vildtype U1810-celler (figur 4B). Derudover var der ingen væsentlige ændringer i den procentdel af sub-G1 befolkning eller aktiveringen af ​​caspase-3 efter ioniserende stråling, selv om begge parametre faldet lidt i Ago2-down-regulerede celler sammenlignet med vildtype-celler (figur 4C og D).

(A) niveauet for Argonaute2 (AGO2) mRNA i U1810-celler transficeret med kontrol (skrid) eller AGO2 siRNA normaliseret mod 18S ribosomale RNA. Resultaterne er middelværdien ± middelfejl. af tre uafhængige forsøg. (B) Spaltning af PARP og behandling af caspase-3 og -9 i U1810-celler transficeret (48 h) med kontrol (si scr) eller AGO2 siRNA, og derefter udsat for bestråling i 48 timer. Lige belastning blev verificeret ved hjælp af anti-GAPDH antistoffer. Alle data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (C) Påvisning af apoptotisk celledød i U1810-celler efter transfektion (48 h) med kontrol eller AGO2 siRNA og efterfølgende behandling med bestråling (48 h). (D) Caspase-3-lignende aktivitet (fold stigning i forhold til kontrol) i U1810-celler efter behandling med enten alene eller i kombination med transfektion med kontrol eller AGO2 siRNA bestråling. Alle viste resultater er gennemsnittet ± middelfejl. af tre uafhængige forsøg.

Endelig blev det samme sæt af eksperimenter udført for at knock-down ekspressionen af ​​en anden RISC-komponent, Tudor-SN. Udover sin funktion som en komponent af den multiproteinkompleks involveret i miRNA funktion, er TSN kendt for at virke som en transkriptionel aktivator og onkogen i mange cancertyper. Desuden er det spaltes under apoptose. Selvom betydelig nedregulering af TSN ekspression under anvendelse siRNA blev opnået i U1810-celler som vist ved Western blot-analyse, de bankede-down celler udviste lignende spaltning af PARP som vildtypen ved behandling med ioniserende stråling (figur 5A). Procentdelen af ​​apoptotiske celler afveg ikke mellem styring og TSN bankede ned grupper efter bestråling (Figur 5B). Lignende resultater blev opnået for to andre cellelinjer fra NSCLC panel (A549 og H661) efter nedregulering af TSN (figur 5C og D).

Niveauet af Tudor-SN ekspression og spaltning af PARP i U1810 (A), A549 (C) og H661 (D) celler transficeret (48 h) med kontrol (si scr) eller Tudor-SN (si TSN) siRNA analyseret ved Western blot 48 timer efter bestråling. Lige belastning blev verificeret ved hjælp af anti-GAPDH antistoffer. (B) Den apoptotisk celledød i U1810-celler efter transfektion med TSN siRNA og bestråling. Alle data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Diskussion

Strålebehandling er en stor terapeutisk våben i LC. Imidlertid er effektiviteten af ​​denne form for terapi begrænses af den oprindelige eller erhvervet radioresistance af tumorcellerne. NSCLC er kendetegnet ved en lav tumorresponsrate for bestråling og en 5-års overlevelse på kun 7% til 10% [15]. SCLCs oprindeligt reagerer godt på konventionel kemo- og strålebehandling, men udvikler erhvervet kemo- og radioresistance løbet af de efterfølgende tre til 12 måneder, og den samlede 5-års overlevelse er kun 5% [16]. De mekanismer, der fører til radioresistance af disse tumorer er endnu ikke fuldt forstået.

miRNA er blevet rapporteret til at være potentielle diagnostiske eller terapeutiske mål i kræftbehandlingen, herunder lunge tumorer. Der er stigende tegn på sammenhængen mellem miRNA udtryk i tumorer og kemo- og radiosensitivitet, både med hensyn til at forudsige og modulerende følsomhed [17] – [20]. En nylig undersøgelse af NSCLC identificeret en delmængde af miRNA viser robuste ændringer i udtryk som reaktion på bestråling. Således ikke en global miRNA reaktion findes i alle tumorceller, herunder lungecancer og miRNA kan være komponenter af det cellulære respons på cytotoksiske insult [20]. Lignende resultater vedrørende ændringerne i den globale miRNA udtryk blev rapporteret efter anticancer behandling med forskellige kemoterapeutiske stoffer i forskellige cancer cellelinjer og patientprøver [21]. Ekspressionen af ​​miRNA proceskomponenter blev vist at blive dereguleret i forskellige humane cancere [8], [22], [23] og dermed kan bidrage til tumorceller reaktion på behandling i et miRNA-styret mode eller uafhængigt af RNA-interferens pathway. Nedregulering af Dicer i MCF-7-brystcancercellelinier ved siRNA blev vist at forårsage G1 arrest og forøge følsomheden til DNA-beskadigende middel, cisplatin, hvilket antyder, at kombinationen af ​​anti-Dicer strategi og traditionel kemoterapi kan forbedre effektiviteten af kræftbehandling [9]. En anden undersøgelse viste, at Dicer nedregulering kan øge den proliferative og invasive evne af tumorceller in vitro og tilsvarende fremme subkutan tumor xenograft proliferation in vivo 24. Samlet set antyder disse data at miRNA maskiner spiller enten en negativ eller positiv rolle i tumor transformation og respons på behandlingen i forskellige typer af kræft. I den foreliggende undersøgelse, vi havde til formål at præcisere, hvilken rolle miRNA biogenese komponenter modulering af stråling respons i NSCLC og SCLC-cellelinjer. For at identificere molekylære mål for radiosensibilisering, proteinekspressionen analyse af syv kerneproteiner af miRNA maskiner, drosha, Dicer, XPO5, TSN, PACT, FXR1 og Ago2, blev udført i et panel af NSCLC og SCLC-cellelinier. Vores resultater demonstrerede højere ekspression af drosha og Dicer proteiner i celler er resistente over for stråling sammenlignet med følsomme linjer. Men knock-down af disse to essentielle proteiner påvirkede ikke følsomheden af ​​NSCLC-celler til behandling med gammabestråling. Dette kan delvist skyldes den lange halveringstid af modent miRNA. Adskillige undersøgelser har vist, at RNA-interferens-medieret knock-down af drosha, XPO5-5 eller Dicer resulterer i en betydelig reduktion, men ikke det fulde tab, af modent miRNA [25] – [28]. Da miRNA synes at være ret stabilt, når de træder ind i effektor-komplekset, vi undersøgt muligheden for at øge den radiosensitivitet lunge tumorceller ved udtømning af down-stream komponenter af miRNA biogenese vej, dvs to RISC proteiner, Ago2 og Tudor-SN. Alligevel har nedregulering af disse proteiner ikke påvirke følsomheden af ​​NSCLC-celler til behandling. Så kan der være alternative biogenese pathway (s), der kan aktiveres ved afbrydelse af en af ​​de mange trin i den kanoniske miRNA biogenese proces. Nogle miRNA viste sig at blive genereret via en Dicer-uafhængig biogenese vej: efter at være blevet behandlet af drosha, kan de pre-miRNA indlæses direkte til siden og spaltes af Ago katalytiske center at generere en mellemliggende 3 fastsatte stikprøver ende, som yderligere trimmet [29]. Der er også en klasse af ikke-kanoniske miRNA, der omgår drosha mikroprocessor, men stadig kræver Dicer for deres biogenese [30]. Det skal bemærkes, at analysen af ​​proteinet udtryk for alle centrale komponenter i miRNA maskiner i U1810 celler udføres efter nedregulering af Dicer, drosha, TSN eller Ago2 viste, at ingen af ​​de knock-downs haft en betydelig effekt på ekspressionen af andre proteiner i vejen, dvs. vi observeret nogen stigning i ekspressionen af ​​miRNA maskinkomponenter efter knock-downs (Figur S3). På den anden side, en nylig undersøgelse foretaget på udødeliggjorte og primære endotelceller viste, at den globale suppression af miRNA ekspression opnås gennem nedregulering af enten Ago2 eller Dicer proteiner under anvendelse siRNA ført til øget celledød efter bestråling [31]. Dette indikerer, at bidraget af miRNA maskiner til reaktion på strålebehandling kan stærkt afhængige af celletype og være anderledes i normale og cancerceller.

En anden rapport viste, at miRNA biogenese globalt induceres ved DNA-skader i en ataksi -telangiectasia muteret (ATM) kinase-afhængig måde i muse embryonale fibroblaster (MEF’er) efter behandling med radiomimetiske lægemiddel neocarcinostatin (NCS), som genererer dobbeltstrengede afbrydelser (DSB’er). KH-typen splejsning regulatorisk protein (KSRP) viste sig at være en central aktør, der oversætter DNA skader signalering til miRNA biogenese. ATM kinase binder direkte til og phosphorylerer KSRP, hvilket fører til øget samspil mellem KSRP og pri-miRNA og øget KSRP aktivitet i miRNA behandling [32]. Hvorvidt KSRP aktiveres og bidrager til miRNA forarbejdning i NSCLC på nedregulering af centrale dele af miRNA maskiner og behandling med gammastråling er endnu ikke afklaret.

Derudover er det kendt, at de fleste miRNA har snesevis til hundredvis af mål, og at mål mRNA kan binde flere miRNA. Måske størrelsen af ​​faldet i miRNA produktion og aktivitet som følge af fjernelsen af ​​et enkelt protein fra en miRNA pathway er ikke nok til at påvirke de mekanismer, der er ansvarlige for resistensen af ​​LC-celler for bestråling behandling. Med andre ord, er det sandsynligt, at en reel indflydelse på radioresistance af NSCLC celler via miRNA maskiner ikke kan opnås ved fjernelse af enkelte proteiner fra biogenesen vej, og dermed yderligere identifikation og målretning af bestemte miRNA er involveret i svaret fra LC celler til strålebehandling er påkrævet.

sammenfattende i den foreliggende undersøgelse ekspressionen af ​​et sæt af proteiner involveret i miRNA biogenese blev vurderet for første gang i et panel af humane LC cellelinier. Selvom ekspressionen af ​​kerneproteiner af miRNA pathway korreleret med resistensen af ​​cellerne til radioterapi, knock-down af disse proteiner ikke var tilstrækkeligt til at udløse sensibilisering af LC-celler til denne type behandling. Dette antyder, at lunge tumor radioresistance ikke kan overvindes ved modulation af miRNA biogenese maskiner og at andre strategier er forpligtet til at bekæmpe lungekræft.

Støtte oplysninger

figur S1.

Ekspressionen af ​​Dicer og PARP-spaltning i A549 og H661-celler transficeret med kontrol (si scr) eller Dicer (si Dicer) siRNA analyseret ved Western blot 48 timer efter behandling med bestråling (A). Lige belastning blev verificeret ved hjælp af anti-GAPDH antistoffer. (B) apoptotisk celledød i A549 og H661 celler målt ved analyse af sub-G1 befolkning efter transfektion (48 h) med kontrol eller drosha siRNA og strålebehandling (48 h)

doi:. 10,1371 /journal.pone. 0033134.s001

(TIF)

Figur S2.

niveau af drosha og spaltes PARP i A549 (A) og H661 (C) celler efter knock-down af drosha. Lige belastning blev verificeret ved hjælp af anti-GAPDH antistoffer. (B) Procentdelen af ​​apoptotiske celler i A549 transficeret med drosha siRNA og behandlet med bestråling (48 h). . (D) Caspase-3-lignende aktivitet (fold stigning i forhold til kontrol) i H661-celler efter behandling med enten alene eller i kombination med transfektion med kontrol eller drosha siRNA bestråling

doi: 10,1371 /journal.pone.0033134. S002

(TIF)

figur S3.

Niveauet af drosha, Dicer, XPO5, TSN, PACT efter knock-down af Dicer, drosha, TSN og Ago2 i U1810 celler. Lige belastning blev verificeret ved hjælp af anti-GAPDH antistoffer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0033134.s003

(TIF)

Tak

Forfatterne vil gerne udtrykke taknemmelighed til Hogir Salim, Dali Zong og Birgitta Mörk (Karolinska BIOMICS center, Onkologisk afdeling-Patologi, Karolinska Institutet) til teknisk bistand.