PLoS ONE: Påvisning af Methyleret CDO1 i plasma af kolorektal cancer; En PCR Undersøgelse

Abstrakt

Baggrund

Cystein biologi er vigtigt for kemosensitivitet af kræftceller. Vores forskning har fokuseret på epigenetisk inaktivering af cystein dioxygenase type 1 (CDO1) i kolorektal cancer (CRC). I denne undersøgelse beskriver vi detektion af

CDO1

methylering i plasmaet af CRC patienter ved hjælp af methylering specifik PCR (Q-MSP) og omfattende analyse af PCR-reaktionen.

Metoder

DNA blev ekstraheret fra plasma og analyseret for methylering af

CDO1

gen ved anvendelse af Q-MSP. Den opdagelse sats af

CDO1

gen methylering blev beregnet og sammenlignet med fortyndet DNA ekstraheret fra “positiv kontrol” DLD1 celler.

CDO1

gen methylering i plasmaet fra 40 CRC patienter, der var clinicopathologically analyserede blev derefter bestemt.

Resultater Salg

(1) Den klonede sekvens analyse detekteret 93,3% methylering af promoter CpG øer i

CDO1

gen af ​​positive kontrol DLD1 celler og 4,7% methylering af den negative kontrol HepG2

CDO1

gen. (2) DLD1

CDO1

DNA kunne ikke påvises i denne analyse, hvis det ekstraherede DNA blev fortyndet ~1000 fold. Jo mere DNA, der blev anvendt til PCR-reaktionen, jo mere effektivt det blev amplificeret i Q-MSP. (3) Ved at øge mængden af ​​DNA anvendes, methyleret

CDO1

klart kunne påvises i plasma af 8 (20%) af de CRC-patienter. Men andelen af ​​CRC patienter detekteret ved methyleret

CDO1

i plasma var lavere end påvist ved CEA (35,9%) eller CA19-9 (23,1%) i præoperativ serum. Kombination af CEA /CA19-9 plus plasma methylerede

CDO1

kunne øge hastigheden af ​​påvisning af helbredelige CRC patienter (39,3%) sammenlignet med CEA /CA19-9 (25%).

konklusion

Vi har beskrevet detektering af

CDO1

methylering i plasmaet fra CRC patienter. Selvom

CDO1

methylering blev ikke fundet så hyppigt som konventionelle tumormarkører, analyse af plasma

CDO1

methylering i kombination med CEA /CA19-9 niveauer øger opdagelse sats af helbredelige CRC patienter.

Henvisning: Yamashita K, Waraya M, Kim MS, Sidransky D, Katada N, Sato T, et al. (2014) Påvisning af Methyleret

CDO1

i plasma af kolorektal cancer; En PCR Study. PLoS ONE 9 (12): e113546. doi: 10,1371 /journal.pone.0113546

Redaktør: Diego Calvisi, University of Medicine, Greifswald, Tyskland

Modtaget: Juni 7, 2014, Accepteret: 25 Okt 2014; Udgivet: December 3, 2014

Copyright: © 2014 Yamashita et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Indledning

cytosin DNA-methylering af promotorregionen af ​​tumorsuppressorgener er et almindeligt cancer fænomen [1], [2], og kunne give god kandidat biomarkører til detektering af minimal residual disease med methylering specifikke PCR-amplifikation [3], [4]. DNA methylering ændringer adskiller sig fra genomiske ændringer såsom mutationer i at methylering abnormiteter forekommer hyppigt nok til anvendelse til klinisk diagnose [5]. For eksempel har vi identificeret

N-methyl-D-aspartat receptor typen 2A

(

NMDAR2A

) [6],

døvhed, autosomal dominant 5 fotos (

DFNA5

) [7],

Oncostatin M receptor

β (

OSMR

) [8], og

cystein dioxygenase 1 Hotel (

CDO1

) [9] som cancer-tilbøjelige ofte methylerede gener i kolorektal cancer (CRC) ved anvendelse farmakologiske afsløring microarrays [1], [2]. Af disse gener, kræft-tilbøjelige gener, der blev hyppigst methylerede i primær CRC var

CDO1

[9].

Cystein biologi har for nylig fået opmærksomhed i form af tumor biologi fordi det involverer reaktiv ilt (ROS) produktion og påvirkninger det kemosensitivitet af kræftceller gennem CD44-XCT (kræft stamceller markør-cystein transporter) akse [10], [11]. CDO1 påvirker cytosin metabolisme, hvilket resulterer i dannelsen af ​​reaktive oxygenarter (ROS) og reduktionen af ​​cellelevedygtigheden og vækst [12], [13]. Derfor

CDO1

menes at være en kritisk tumorsuppressorgen, og kunne være en markør af kemo-resistens af cancerceller.

Da DNA methylering først blev påvist i plasma hos esophageal kræftpatienter [14], methyleret DNA er gentagne gange blevet fundet i plasmaet fra forskellige cancerformer, herunder CRC [15].

SEPT9

promotor blev anset for at være den mest lovende tumor markør, fordi 69% af de primære CRC væv var positive for denne methylering, mens det ikke blev påvist i 86% af kontrollerne. Yderligere valideringsundersøgelser bevist, at et plasma

SEPT9

methylering assay kunne registrere CRC med høj følsomhed [16], [17].

I den foreliggende undersøgelse, vi rettet den udestående

CDO1

hypermethylering, der blev observeret i primære CRC væv: 91% af tumorvæv var positive for

CDO1

methylering, mens det ikke blev påvist i 93% af kontrollerne [9]. Vi beskriver påvisning af CDO1 methylering i plasmaet af CRC patienter og omfattende analyse af PCR-reaktionen.

Metoder

cellelinjer og plasmaprøver

CRC cellelinje DLD1 blev venligst stillet til rådighed af Cell Resource Center for Biomedical Research, Institut for Udvikling, Aldring og Kræft, Tohoku Universitet (Sendai, Japan). Den hepatocellulært carcinom HepG2 blev købt fra Riken Bioresource Centre (Ibaraki, Japan). DLD1 celler blev dyrket i RPMI 1640 medium (GIBCO, Carlsbad, CA) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS). HepG2-celler blev dyrket i DMEM-medium (GIBCO), suppleret med 10% FBS.

Plasma fra 20 (for forundersøgelsen) og 40 (for valideringsundersøgelsen) patienter med primær CRC blev indsamlet før patienterne gennemgik kirurgisk resektion ved Kitasato Universitetshospital i september 1, 2009 til 30. juni 2011. den foreliggende undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i Kitasato Universitet. Deltagerne forudsat at deres skriftligt informeret samtykke til deltagelse i denne undersøgelse før operation.

CRC etape blev kategoriseret efter TNM klassifikationen, 7

th udgave af Union for International Cancer Control (UICC) og 7

th udgave af den japanske Klassificering af kolorektal cancer (JCCC) iscenesættelse system. Patient karakteristika er vist i tabel 1.

DNA-ekstraktion

Gratis flydende cirkulerende DNA blev ekstraheret fra plasma ved hjælp Magna Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) og en Roche Magna Pure enhed. Plasma (400 pi: små mængder, og 1 til 2,5 ml: store mængder) blev fordelt i Magna Pure brønde og blev ekstraheret efter kit protokol. Genomisk DNA blev elueret i 100 ul alikvoter. Og genomisk DNA fra cellelinier blev ekstraheret under anvendelse af QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN Sciences, Hilden).

bisulfitbehandling af DNA og sekventeringsanalyse

I DNA denaturering, DNA ekstraheret fra plasmaet af CRC patienter (slutvolumen 100 pi) eller 2 ug af genomisk DNA opnået fra cellelinjer, blev inkuberet med 5 ug laksesperma-DNA i 0,3 mol /l NaOH i 20 minutter ved 50 ° C. DNA-prøven blev derefter fortyndet med 500 pi 2,5 mol /l natriummetabisulfit (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO) /125 mmol /l hydroquinon (Sigma) /0.4 mol /l natriumhydroxidopløsning, og anbragt ved 70 ° C i 1,5 timer. Prøven blev efterfølgende påført på en søjle (Wizard DNA Clean-UP system, Promega Inc., Madison, WI), inkuberet med 0,3 mol /l NaOH i 10 minutter og derefter behandlet med 3 mol /l ammoniumacetat i 5 min. Prøven blev udfældet i 100% ethanol, og DNA’et blev resuspenderet i 25 eller 50 pi Lote sammensat af 10 uM Tris-HCI, pH 8 og 2,5 uM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), pH 8. DNA fra cellelinier var efterfølgende amplificeret ved anvendelse af en polymerasekædereaktion (PCR). Bisulfit behandling resulterer i kemisk modifikation af ikke-methylerede, men ikke methylerede, cytosiner til uraciler, tillader skelnen mellem methyleret og umethyleret genomisk DNA. Primersekvenser for generne af interesse blev designet til at genkende disse DNA forandringer (tabel S1). Primer-produkter blev sekventeret under anvendelse af en Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Til analyse af de klonede sekvenser, PCR-produkterne blev indsat i pCR4-TOPO-vektor ved anvendelse af et TOPO TA kloning kittet til sekventering (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Ti kloner blev selekteret for hver prøve, som derefter blev sekventeret under anvendelse semi-nested primere (tabel S1).

Quantitative-Methylering-specifik PCR (Q-MSP)

TaqMan methylering specifik PCR ( Q-MSP) blev udført in triplo ved hjælp af iQ Supermix (Bio-Rad), og iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). PCR-betingelser og primersekvenserne er vist i tabel S1. Seriefortyndinger af bisulfit modificerede DNA fra DLD1 blev anvendt som methyleringen positiv kontrol til at konstruere en kalibreringskurve på hver plade, og modificeret DNA fra HepG2-celler blev anvendt som negativ kontrol.

Statistical Analysis

kategoriske variabler blev vurderet ved Fishers eksakte test. Overlevelse blev beregnet af Kaplan-Meier-metoden. Univariate analyser af prognostiske faktorer for progressionsfri overlevelse (PFS) blev udført ved hjælp af log-rank-metoden. PFS blev defineret som tiden fra kirurgi til progression (tilbagefald eller R1 /2 drift) eller dødsfald fra alle årsager, og data om overlevende patienter blev censureret i sidste opfølgning. Den mediane opfølgning var 46 måneder. (Interval: 0-55 måneder)

Resultater

Promotor DNA hypermethylering af

CDO1

gen ved analyse af klonede sekvens fra humant cancer cellelinjer for etablering af positive og negative kontroller til kvantitativ methylering analyse

Selvom

CDO1

klart hypermethyleret i kræft cellelinjer [9], graden af ​​

CDO1

promotor hypermethylering af klonet

CDO1

promotorsekvenser er ikke blevet fastlagt. Brug af behandling med bisulfit af DNA efterfulgt af sekvensanalyse, analyserede vi methylering af den

CDO1

promotorsekvens klonet fra PCR amplificeret genomisk DNA fra DLD1 (methylering positiv) og HepG2 (methylering negative) celler. Dette assay er angivet methylering af 93% og 4,7% af CpG-stederne i

CDO1

promotorregion i DLD1 og HepG2-celler, (fig. 1a). Vi fandt derfor, at DLD1 og HepG2 cellelinjer var egnet til brug som positive og negative kontroller, henholdsvis for

CDO1

methylering analyse.

(a) Sekvensanalyse af det klonede

CDO1

promotor. Hyppigheden af ​​methylerede CpG øer i det klonede

CDO1

promotor fra den positive kontrol, DLD1 celler, og den negative kontrol, HepG2-celler. (B) Q-MSP effekt for PCR-amplifikation af

CDO1

og β-actin var fremragende. (C) Følsomhed af

CDO1

methylering påvisning ved Q-MSP blev analyseret ved hjælp af to-folds fortyndinger (fra 100 til 3,125 ng /PCR) af klonet

CDO1

initiativtagere fra DLD1 og HepG2-celler. (D) Q-MSP af

CDO1

methylering i i DLD1 celler ved anvendelse af 10 gange fortyndinger (100, 10, 1, 0,1 og 0,01 ng /PCR) af den klonede

CDO1

promotor . En koncentration så lav som 1 ng /klart kan påvises PCR-reaktion af den positive kontrol DLD1 celle-DNA. Imidlertid kan næppe påvises DNA ved 1000 ganges fortynding (0,1 ng /PCR). Bemærk, at afsløring er mindre følsom, når lavere mængder af DNA anvendes.

Q-MSP af de methylerede CpG steder af

CDO1

gen klart forstærket et specifikt signal i den positive kontrol, DLD1, men ikke i den negative kontrol, HepG2

Vi kvantificeret næste methyleret

CDO1

efter bisulfit DNA behandling under anvendelse af Q-MSP med det samme sæt af primere og probe, som tidligere er blevet rapporteret [9] . Ved hjælp af denne metode, kunne forstærkede signaler klart identificeres. Effekten af ​​PCR-amplifikation af methyleret

CDO1

var fremragende og viste sig at være sammenlignelige med β-actin amplifikation effekt (fig. 1b). Q-MSP af

CDO1

methyaltion indikerede, at methylering klart kunne påvises, når DNA-skabelon fra DLD1 celler blev brugt i koncentrationer på 100, 50, 25, 12,5, 6,25, og 3,125 ng /PCR-reaktion, mens ingen methylering overhovedet kunne påvises i negativ kontrol HepG2 DNA-templates (fig. 1c). Vi anvendte fluorescens på 0,35 som tærskel linje i dette assay, fordi den negative kontrol er altid under denne tærskel. Når DNA-skabelonen blev yderligere fortyndet koncentrationer på 100, 10, 1, 0,1 og 0,01 ng /PCR-reaktion blev analyseret, Q-MSP af

CDO1

DNA fra DLD1 detekteret methylering i PCR-reaktioner under anvendelse af 100, 10, eller 1 ng /reaktion, hvorimod det næppe kunne registrere methylering i PCR-reaktioner ved hjælp af 0,1 eller 0,01 ng /reaktion. Nr methylering blev påvist ved enhver koncentration af DNA i reaktioner under anvendelse HepG2 negativ kontrol-DNA (fig. 1d). Disse resultater viste, at selv tætte

CDO1

methylering, som konstateret i DLD1 celler kan næppe påvises ved anvendelse af Q-MSP når DNA fortyndes ca. 1000 gange, og at påvisningen er mindre følsom, når mindre DNA anvendes. Derfor, for at detektere minimalt residual sygdom af kræft i legemsvæsker, ville det være bedre at kunne anvende en større mængde af DNA end der normalt anvendes til kvantitativ analyse af DNA-methylering.

Påvisning af methylering af CpG ø sekvens af

CDO1

gen i plasma hos CRC patienter ved Q-MSP ved hjælp af en lille mængde template-DNA

Vi derefter undersøgt følsomheden af ​​påvisning af

CDO1

methyleret DNA i plasmaet fra 20 CRC patienter. I dette indledende forsøg, vi ekstraherede DNA fra 400 pi CRC patienter plasma. Halvdelen af ​​det ekstraherede DNA blev anvendt til tredobbelte assays af både

CDO1

og β-actin. plasmavolumen for hver enkelt analyse var således 33,3 pi, der er udpeget som en skabelon volumen.

CDO1

methylering blev påvist i kun 2 (10%) af de 20 CRC patienter, mens β-actin methylering blev påvist i alle prøver (Fig. 2). Fig. 2a viser en

CDO1

positive tilfælde; methylering af

CDO1

-3 var klart opdaget, men af ​​

CDO1

-1 og

CDO1

-2 var marginal, fordi signalerne var under tærsklen. dette niveau af methylering kan imidlertid være gyldig, da PCR af 1/1000 fortynding af den positive kontrol udviste en lignende signal (fig. 1d). I modsætning hertil

CDO1

negative sager aldrig udstillet noget signal på alle forstærket

CDO1

methylering (fig. 2b). Til disse eksperimenter de mængder DNA ekstraheret fra de første 400 pi plasma gennemsnit 435 ng, der spænder fra 160 ng til 2000 ng. Derfor mængden af ​​DNA påført til 1 PCR-reaktion svarede til mindst 16,7 (1/6) ng /reaktion. Denne mængde DNA menes at være tilstrækkelig til Q-MSP, hvis methylerede alleler er inkluderet (se fig. 1c). Imidlertid Ct værdi for β-actin varierede fra 34 til 38, som var helt anderledes end den, der opnås ved udførelse af Q-PCR af cellelinier, i hvilke den sædvanlige Ct værdien af ​​β-actin er omkring 28. Dette resultat antydede, at detektion af plasma DNA var mindre følsom end den for DNA fra cellelinier, hvilket sandsynligvis skyldes DNA-nedbrydning eller andre ukendte årsager. Tilstrækkelig DNA til PCR-reaktionen var kun til stede i 1 ud af 2

6 (64 gange) til 2

10 (1024 gange). Dette betød, at det oprindelige plasmavolumen anvendt til DNA-ekstraktion ideelt bør forhøjes 100 til 1000 gange (dvs. til 4-40 ml plasma) til assay af plasma-DNA under anvendelse af Q-MSP. Derfor, for at opnå nok plasma DNA til påvisning minimal residual sygdom, mere DNA end det, der anvendes i denne forundersøgelse ville være nødvendig. vores indledende forundersøgelse havde således ikke brugt optimale betingelser til påvisning af

CDO1

methylering i plasma.

(a) En repræsentant positivt tilfælde blev vist. Den β-actin-genet blev analyseret som en intern kontrol for bisulfit behandlede DNA. Selv for denne positive tilfælde, påvisning af methylerede

CDO1

ikke er stabil, fordi alle skabelonerne ikke overvinde tærskelværdien. (B) Et repræsentativt negativ tilfælde er vist. Bemærk at β-actin er lavere end forventet.

Påvisning af den methylerede CpG ø sekvens af

CDO1

gen ved Q-MSP ved hjælp af forøgede mængder DNA fra plasmaet af CRC patienter

Vi derefter undersøgte DNA ekstraheret fra hvad der svarer til 3 template mængder til påvisning af

CDO1

methylering i plasmaet fra de 20 CRC patienter. Denne analyse opdaget 4 tilfælde (20%), der var positive for methylering af

CDO1

i plasma. Endvidere opnåedes klarere signaler end når blev anvendt en skabelon volumen, hvilket indikerer, at analysens følsomhed kan blive kraftigt forøget ved at forøge mængden af ​​plasmaafledt DNA (fig. 3).

(a) E -1-69 (b) E-2-10 (c) E-2-31 (d) E-2-32, der var positive for methylering af

CDO1

i plasma når skabelon-DNA’et blev ekstraheret fra en højere mængde plasma.

Vi undersøgte derefter 40 uafhængige CRC tilfælde af Q-MSP anvendelse af DNA ekstraheret fra et større volumen af ​​plasma (1,0 til 2,5 ml plasma svarende til 5 til 12,5 skabelon volumener baseret på vores indledende skabelon definition volumen). Den gennemsnitlige mængde af DNA ekstraheret DNA var 1491 ng, (fra 580 ng til 2590 ng). Denne analyse opdaget klar

CDO1

methylering i 8 de 40 CRC tilfælde (20%). Klar methylering blev påvist i 1 af 6 (16,7%), 2 af 10 (20,0%), 1 af 13 (7,7%), og 4 af 11 (36,4%) af I, II, III, og IV CRC tilfælde stadium, (fig. 4a). Jo højere trin, jo højere methylering niveau, der blev påvist (fig. 4b). Patienternes baggrunde er vist i tabel 1. Selv

CDO1

methylering er oftere findes i CRC patienter med fjernmetastaser, prognosen for patienter med methylerede

CDO1

i plasma var ikke signifikant dårligere end patienter hvor der ikke methylerede

CDO1

blev påvist i plasma (fig. 4c). Mindre end signal svarede til 1/1000 fortynding af den positive kontrol (fig. 4d). Hvis en sådan marginal under tærsklen signal om

CDO1

methylering blev inkluderet som et positivt signal, blev derefter detekteret methylering i alle 40 af CRC patienter.

(a) Q-MSP analyse af methyleret

CDO1

ved hjælp af en stor mængde plasma-afledt DNA af CRC patienter på differentierede stadier. (B) Repræsentative positive tilfælde er vist i henhold til scenen. Et billede af kolon fiber i den primære kræft er inkluderet i hver figur. (C) Overlevelse kurve af CRC patienter i henhold til methylerede

CDO1

niveauer i plasma. (D) Repræsentative tilfælde, der viser marginal positiv tilfælde vises.

Kombination af methylerede

CDO1

med øget serum CEA /CA19-9 til påvisning af helbredelig fase I-III kolorektal cancer

af de ovennævnte 40 patienter, 39 var informativ vedrørende den præoperative værdi af serum CEA og CA19-9. CEA var positiv ( 5,0 ng /ml) i 14 af disse 39 patienter (35,9%), mens CA19-9 var positiv ( 37,0 IU /ml) i 9 af disse 39 patienter (23,1%). Hastigheden for påvisning af CRC efter scenen blev beregnet i forhold til CEA, CA19-9 den /CA19-9 kombinationen CEA eller CEA /CA19-9 /plasma

CDO1

kombination methylering (fig. 5a ). Hastigheden for detektion af stadie IV CRC af CEA, CA19-9, eller CEA /CA19-9 var høj. Men at kombinere plasma

CDO1

methylering data med CEA /CA19-9 ikke øge afsløring satser. På den anden side,

CDO1

øge afsløring satser i fase I, II og III CRC, der betragtes som helbredes (fig. 5a). Selv kunne påvises kun 21% af disse helbredelige patienter baseret på CEA niveauer,

CDO1

kombination øgede opdagelse sats af sådanne helbredelige patienter til 39,3% (fig. 5b).

(a) CRC opdagelse sats af CEA, CA19-9, kombination af CEA /CA19-9, og kombinationen af ​​CEA /CA19-9 /plasma

CDO1

methylering ifølge CRC scenen. (*) Angiver p 0,01. (**) Angiver p 0,05. (B) helbredes CRC (fase I-III) opdagelse sats blev forøget ved at kombinere plasma

CDO1

methylering data.

Diskussion

Da det blev opdaget, at kræft kan detekteres -specifikke ændringer i blod hos cancerpatienter, har talrige tumormarkører blevet udviklet til klinisk anvendelse. I CRC, er serum CEA og CA19-9 godt anerkendt som sådanne nyttige markører [18], [19]. Eftersom høje værdier af serum CEA og CA19-9 ofte påvises i trin IV kolorektal cancer, disse markører er egnede til forudsigelse af prognose eller til tilfælde af tidlig påvisning af tilbagefald i ambulant center [18]. Fordi disse markører til tider kan afsløre tilbagefald tidligere end diagnostisk billeddannelse, såsom CT eller ekko, de er uundværlige for læger, der behandler CRC som et klinisk redskab. På den anden side, desværre disse markører er ikke tilstrækkeligt til at påvise cancer, når den anvendes til påvisning af hærdelige CRC. De præ-operative CRC afsløring satser CEA og CA19-9 er omkring 30~50% eller Trin I CRC og 10~20% for fase III CRC [20]. Hvis et hidtil ukendt tumormarkør i blod kan anvendes i kombination med sådanne klassiske tumormarkører, vil dette øge detektionsraten af ​​hærdelig CRC og disse markører vil lovende med henblik på screening CRC i lægeundersøgelse [21].

Ændringer, der skal anvendes som tumormarkører skal være cancer specifik. Methylering af

CDO1

promotorregion, der blev analyseret i den aktuelle undersøgelse blev oprindeligt identificeret ved robust screening af en farmakologisk demaskering microarray der blev udført for at udforske cancer-tilbøjelige methylering [1], [2], [ ,,,0],9]. Ved at anvende et sådant array har vi identificeret talrige hidtil ukendte gener med cancer-tilbøjelige methylering.

NMDAR2A

[6],

DFNA5

[7],

OSMR

[8], og

CDO1

[9]. Af disse gener,

CDO1

stod ud med hensyn til sensitivitet og specificitet for den differentierede detektion af CRC fra det tilsvarende normale slimhinde. Tilsvarende

CDO1

methylering træk blev bekræftet i forskellige andre cancere, såsom bryst, esophageal, lunge, blære, og gastrisk cancer. Fordi sådan cancer-tilbøjelige methylering er sjælden, analyse af

CDO1

methylering har stor klinisk potentiale for detektion af minimal residual sygdom i humane kropsvæsker såsom blod.

SEPT9

anses for at være den første molekyle, hvori hyppig methylering blev succesfuldt påvist i plasma hos CRC patienter ved hjælp af real time PCR [16], [17]. Den opdagelse sats af methylerede

SEPT9

i plasmaet af helbredelige CRC patienter med fase I-III er bemærkelsesværdig høj, være over 60% [22]. Interessant nok blev en så høj detektionsrate på en methyleret DNA i plasma hos patienter med hærdelig CRC også vist ved hjælp af en anden metode. Ved således at anvende methyl- strålende metode, Li et al. viste, at plasma methyleret

vimentin

kunne påvises i ca. 40-60% af hærdelig CRC på stadium I-III, og at følsomheden af ​​påvisningen var højere end for serum værdien af ​​CEA [21]. Baseret på disse resultater, analyse af methyleret DNA er et meget lovende kandidat værktøj til blod diagnose af kræft, og plasma

CDO1

methylering, der var i fokus i denne undersøgelse betragtes som en sådan kandidat DNA. Kræft specificitet og følsomhed

CDO1

methyaltion viste sig at være lig med dem enten

SEPT9

eller

Vimentin

methylering i CRC, hvor AUC af ROC-kurven til at differentiere kræft væv fra den tilsvarende normale slimhinde var 0,96 [9].

i modsætning til disse lovende rapporter har der været nogle skuffende rapporter med hensyn til afsløring satser denatureret gener i plasma [14]. Påvisningen på methyleret

CDO1

i plasma er en skuffende 20% af de samlede CRC patienter analyseret, og er omkring 35% i trin IV CRC. I vores aktuelle undersøgelse, vi gjorde DNA skabeloner af

CDO1

promotor af DLD1 celler, positiv kontrol for

CDO1

methylering, udvandet DNA’et op til 100.000 gange, og sammenlignede

CDO1

påvisning methylering niveau af forskellige fortyndinger. Dette assay viste, at jo mindre mængde DNA-skabelon, der anvendes, jo dårligere er effektiviteten af ​​PCR-detektion. Giver mulighed for actin amplifikation virkningsfuldhed, mængden af ​​DNA i det totale DNA-indhold af plasma, der kunne fungere som en skabelon for Q-MSP PCR-amplifikation

fra CDO1

“var uventet meget små (virkningen blev beregnet som 1 /100 til 1/1000). I vores nuværende undersøgelse, følsomheden af ​​methyleret

CDO1

ved konventionel Q-MSP er over 1/1000 fortynding af det ekstraherede DNA (fig. 1d), som er meget ringere end indstrålingen assayet (som viste 1 /10.000 fortynding følsomhed) [23]. Når volumenet af plasma anvendt til DNA-ekstraktion blev forøget med 3X (defineret som tre skabelon volumener), klarere signal blev opnået i Q-MSP. Men øget plasmavolumen bruges til DNA-ekstraktion med 10X (ti skabelon volumen) ikke giver så god en opdagelse sats som den, der opnås ved hjælp af tre skabelon volumen. Siden 10 til 12 skabelon mængder blev anvendt til Q-MSP PCR-amplifikation af methylerede

SEPT9

[16], at antallet af DNA-skabeloner af vores undersøgelse ikke var så lille som dem, der anvendes i SEPT9 undersøgelsen. Men methylerede DNA afsløring satser var meget lavere i nærværende undersøgelse end i

SEPT9

undersøgelse, da methylerede

SEPT9

blev påvist i ca. 60% af helbredes CRC [16].

på grund af den lave følsomhed for analysen (20%) af plasma methylerede

CDO1

, anvendeligheden af ​​testen for befolkningen screening for CRC vil kræve forbedret følsomhed til påvisning af tidlige kræft og avancerede adenomer. Der kan være måder at opnå eventuelle forbedringer som følger; 1) skal indsamles 3,5 til 5 ml plasma til DNA-ekstraktion. 2) CDO1 PCR primer koncentrationer blev forøget. 4) Et individ var positiv, hvis nogen af ​​de tre PCR replikater var positive, fordi et tredje PCR måling nødvendigvis øger følsomheden og reducerer specificitet. Vores næste udfordring ville nås med sådanne anordninger til at forbedre følsomheden for påvisning af ganske små cancerceller. Hvis vi kan øge følsomheden af ​​de ovennævnte udtænker, vil vi indsamle plasma fra raske personer og kan bestemme den mest optimale cut-off værdi methyleret CDO1 i CRC patienter.

Der er 2 mulige forklaringer på det faktum, at opdagelse sats af

CDO1

methylering var langt ringere end

SEPT9

methylering i plasma hos CRC patienter. Således kunne detekteringshastigheden som bestemt ved anvendelse af Q-MSP hæves ved at reducere tærskelværdien. For eksempel i fig. 4d, denne fase IV blev bedømt som negative for

CDO1

methylering. Men tærsklen blev reduceret, kunne dette tilfælde betragtes som positiv. Det er muligt, at tærsklen kan reduceres yderligere. Selvom vi ikke analysere plasmaet fra en rask person bør tærsklen bestemmes i sammenligning med påvisningen sats af en sund kontrol som vist tidligere [16]. Den anden forklaring er, at niveauet af methylerede

CDO1

i plasma er mindre end methylerede

SEPT9

. CDO1 er involveret i cystein stofskifte, og cystein biologi har for nylig fået opmærksomhed i form af kræft stamceller teori. Cystein transportør XCT er associeret med canceren stamcellemarkør CD44, og med en koncentration forøget cystein i cytoplasmaet af cancer stamceller, hvilket resulterer i hæmning af ROS-generering og kemoresistens. Cancer stamceller menes at overleve længere i primære cancervæv, hvilket antyder, at mindre DNA kan være afledt af cancer stamceller end fra ellers celler. Hvis sidstnævnte teori er korrekt, methyleret

CDO1

er ikke egnet til brug som et plasma tumormarkør. Hvis den tidligere teori er korrekt, afsløring satser for kræftceller baseret på plasma methylerede

CDO1

kunne øges ved forbedring af påvisning system. I vores nuværende undersøgelse blev mængden af ​​DNA der er nyttige for sådan detektion vist at være lav i plasma. Derfor er brugen af ​​nested PCR er en lovende fremgangsmåde til en sådan analyse i den nærmeste fremtid.

Det kan konkluderes, analyse af methyleret

CDO1

i plasma er skuffende med hensyn til påvisning sats. Men plasma methylerede

CDO1

er uafhængig af serum CEA /CA19-9, så kombinationen af ​​disse markører kunne øge opdagelse sats af helbredes CRC. På den anden side blev den CRC opdagelse sats ikke forøges ved kombination af plasma methyleret

CDO1

data med CEA /CA19-9 niveauer i trin IV CRC. Derfor, hvis CRC opdagelse sats baseret på methylerede

CDO1

i plasma skulle øges ved hjælp af nye afsløring ovenfor beskrevne, plasma methylerede

CDO1

analyse ville være et lovende redskab til påvisning af helbredes CRC ved lægeundersøgelse af blod. Da

CDO1

methylering er universelt findes i andre kræftformer, kan denne teknik være en bredt anvendelig metode til påvisning af kræft ved hjælp af blod.

Støtte oplysninger

tabel S1.

PCR produktion og sekvens af primere og fluorescerende probe

doi:. 10,1371 /journal.pone.0113546.s001

(XLSX)