PLoS ONE: STK31 er en celle-cyklus Reguleret protein, der bidrager til tumorfremkaldende i epitelcancerceller

Abstrakt

Serin /threonin kinase 31 (STK31) er en af ​​de nye cancer /testis-antigener, for hvilke dets biologiske funktioner forbliver stort set uklar. Her viser vi, at STK31 overudtrykkes i mange humane colorektale cancercellelinier og væv. STK31 co-lokaliserer med pericentrin i centrosomal region i alle faser af cellecyklus. Det er interessant, når cellerne undergår mitose, STK31 lokaliserer også de centromerer, central spindel og midterskrog. Denne lokalisering adfærd svarer til den for kromosomale passager proteiner, som vides at være vigtige spillere i spindelkonstruktion checkpoint. Udtrykket af STK31 er cellecyklus-afhængige gennem regulering af en formodet D-box nær dens C-terminale region. Ektopisk-udtrykte STK31-GFP øger celle migration og invasive evne uden at ændre spredning på kræftceller, mens knockdown udtryk for endogene STK31 ved lentivirusafledte shRNA resultater i mikrotubuli montage defekter, der forlænger varigheden af ​​mitosen og føre til apoptose. Tilsammen tyder vore resultater, at den afvigende ekspression af STK31 bidrager til tumorigenicitet i somatiske cancerceller. STK31 kunne derfor virke som et potentielt terapeutisk mål i humane somatiske kræftformer

Henvisning:. Kuo PL, Huang YL, Hsieh CC-J, Lee JC, Lin BW, Hung LY (2014) STK31 er en celle-cyklus reguleret Protein, som bidrager til Tumorigenicitet af epitelcancerceller. PLoS ONE 9 (3): e93303. doi: 10,1371 /journal.pone.0093303

Redaktør: Cayetano Gonzalez, Institut for Forskning i biomedicin, Spanien

Modtaget: December 30, 2013; Accepteret: 3 marts 2014; Udgivet: 25 Mar 2014

Copyright: © 2014 Kuo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud NSC101-2325-B-006-001 og NSC102-2325-B-006-001 fra National Science Rådet, give IBMs-CRC100-P01 fra Academia Sinica, Projekt Fremme akademisk ekspertise og udvikle World Class Research Centers , og center for smitsomme sygdomme og Signaling transduktion Forskning, National Cheng Kung University. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Celledeling i pattedyrceller reguleres af en række proteinkinaser, der styrer progression gennem forskellige faser af cellecyklussen. Tidligere undersøgelser indikerede, at fejlagtig regulering af cellecykluskinaser kan resultere i ubegrænset proliferation og afvigende deling af celler, der fører til genomisk ustabilitet, som begge er kendetegnende for carcinogenese [1], [2]. Akkumuleret data viser, at mitotiske kinaser er ansvarlige for at beskytte celler fra kromosomaberrationer og aneuploidi. Mitotiske kinaser lide Polo-lignende kinaser (PLK’er) og Aurora-kinaser er involveret i regulering af centrosom cyklus og mitosespindelen formation. Når bipolar spindel er dannet, er spindel samling checkpoint (SAC) proteiner såsom Bub1 og BubR1 påkrævet for at sikre en korrekt bipolar orientering søsterchromatider og ordentlige forbindelser mellem kinetochores og spindel mikrotubuli [2]. Ændringer i signalveje involveret i disse mitotiske kinaser kan resultere i en udgang fra mitose med en dermed afvigende kromosom nummer, hvilket fører til aneuploidi og til sidst kræft [3].

centrosom har været betragtet som en vigtig komponent i dyr celledeling. Det består af to centrioler med en ortogonal arrangement omgivet af elektron-tætte pericentriolar materiale (PCM) [4], [5]. Mange centrosomal proteiner placeret i PCM er blevet opdaget, og de spiller en vigtig rolle, der er stærkt korreleret med centrosomal funktioner [6]. Disse centrosomal proteiner kan inddeles i forskellige klasser efter deres funktioner. Den første klasse omfatter proteiner, der tjener som skeletter til samling af andre proteiner, og således er påkrævet for at opretholde strukturen af ​​centrosom. Der er også en gruppe af proteiner, der fungerer i mikrotubulus nukleering. Endelig er mange regulatoriske molekyler, herunder kinaser, phosphataser og signalmolekyler, impliceret i cellecyklusregulering [7]. Adskillige rækker af beviser indikerer, at den afvigende ekspression af centrosomal proteiner eller centrosom dysfunktion kan knyttes til tumorigenese [8] – [10].

Målretning de mitotiske kinaser er blevet betragtet som et meget vellykket strategi for kræftbehandlingen [11 ], [12]. Små molekylære inhibitorer målretning CDK’er har Aurora kinaser, eller PLK’er blevet undersøgt for deres evne til at afbryde udviklingen af ​​kræft [13] – [16]. Disse hæmmende forbindelser viser effekt

in vivo

på humane tumorxenoplantater, og nogle af dem bliver i øjeblikket undersøgt i kliniske forsøg [17]. På den anden side, cancerterapi involverer immunterapi under anvendelse af T-celler, som genkender cancerantigener, er blevet en lovende kræftbehandling tilgang [18], [19]. Således identifikation af nye tumorantigener og tumorspecifikke T-celleepitoper er nyttigt i cancerimmunterapi. En gruppe af tumorantigener kaldes cancer /testis-antigener (CTA’er), dets ekspression normalt at være begrænset til testiklerne [20]. Immunogene cancervacciner målrettet CTA’er ikke udgør en væsentlig risiko for bivirkninger, fordi deres udtryk er begrænset til mandlige kønsceller, en immunologisk privilegeret sted af kroppen, og dermed er ideelle mål for behandling af kræft.

Vores tidligere rapport angivet at

serin /threonin kinase 31

(

STK31

) mRNA niveau i testikel væv af patienter uden modne kønsceller er betydeligt lavere end for normale mænd [21]. En tidligere rapport har vist, at STK31 er en roman CTA [22]. Her undersøger vi det engagement og fysiologiske rolle STK31 i udviklingen af ​​kræft. Vi fandt, at STK31 lokaliserer til centrosom i alle faser af cellecyklus. Under mitose, STK31 deler lignende subcellulære lokaliseringer med de mitotiske kinaser Aurora-B og PLK1. Cellecyklussen-afhængige ekspression af STK31 styres af ubiquitin-proteasom nedbrydning. Udtømning af STK31 påvirkede mikrotubulussamling processen under interfasen, tyder på potentielle rolle i mikrotubuli kimdannelse. Derudover en mangel på STK31 forsinkelser mitotisk progression, resulterer i en manglende forlade mitose, og fører til apoptose. Tilsammen vores undersøgelse giver en potentiel kræft terapeutisk strategi, der kan komme i betragtning til de fremtidige ansøgninger.

Materialer og metoder

patientprøver

Humane kolorektal cancer væv blev opnået i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen. Undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Board for National Cheng Kung University Hospital. Den skriftlige informerede samtykke fra donor blev lagret i National Cheng Kung University Hospital database og bruges til forskning.

plasmider, cellelinjer og transfektion

Menneskelig STK31 fuld længde cDNA blev klonet i vektor pEGFP -N1. AZ521, en human colorektal cancer cellelinie, blev dyrket i DMEM-medium (Sigma) plus 10% MEM (GIBCO) og 1% NEAA (Bio-West). HCT116, en human colorektal cancer cellelinje, blev opretholdt i RPMI-1640 medium (GIBCO). Alle medier blev suppleret med 10% FBS (Bioscience), 100 enheder /ml penicillin, og 100 ug /ml streptomycin (GIBCO). For transient transfektion blev celler dyrket op til 80% konfluens og transficeret transient med STK31-GFP under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens protokol.

Lentiviral Short-hårnål RNA (shRNA) Transfektion

pLKO.1 Mission korte RNA (shRNA) vektorer mod

STK31

(TRCN0000003274, TRCN0000003275, TRCN0000003276, og TRCN0000028838-A4, TRCN0000028841-B4, TRCN0000028758-F3, TRCN0000028817-G1, TRCN0000028819-H2) var fås fra National RNAi Core Facility (Institut for Molekylær Biologi /Genomisk Research center, Academia Sinica, Taiwan). Effektiviteten af ​​

STK31

shRNA blev overvåget ved både immunoblot og Q-PCR-analyse (fig S2A og S2B). For STK31 knockdown blev celler dyrket op til 80% konfluens og inficeret med

STK31

shRNAs ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på fire suppleret med 8 ug /ml polybren (Sigma). Efter 48 timers infektion blev 1 ug /ml puromycin (Sigma) tilsat til vækstmediet for udvælgelse. Efter yderligere 48 h dyrkning blev cellerne opsamlet for total RNA oprensning eller total cellelysat ekstraktion.

Western blot-analyse og antistoffer

Cellelysater fremstilledes i lysepuffer (150 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% Na-deoxycholat, 1 mM EDTA og 50 mM Tris-HCI, pH 7,4) med tilsætning af 1X proteaseinhibitorcocktail (Roche Molecular Diagnostics) og 1X phosphatase inhibitor cocktail (P0044, Sigma). Anti-α-tubulin (DM1A), anti-γ-tubulin (GTU88), anti-actin, anti-GAPDH, anti-cyclin B, anti-phospho-Histon 3 /serin 10, og anti-Aurora-B-antistoffer blev indkøbt fra Sigma. Anti-myc-antistof blev opnået fra Invitrogen. Anti-pericentrin (Ab4448) blev købt fra Abcam. Anti-GFP-antistof (JL-8) blev købt fra Clontech.

Real Time PCR og primere

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens illustration. Revers transskription blev udført med 1 ug totalt RNA ved anvendelse Improm-II revers transkriptase (Promega). Real-time PCR blev udført under anvendelse af SYBR fordel qPCR premix (Bio-Rad) i en CFX96 Real-Time systemet og C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad), og reaktionen blev udført ved anvendelse af følgende betingelser i 44 cykler: 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 10 s og 72 ° C i 5 s. Sekvenserne af anvendte primere er som følger: forward primer og reverse primer til human

STK31

er 5′-CAGGACCAGAAACTGATTGAAG-3 ‘og 5′-TCCATTCAAAGAAGCTGGAGTAG-3’. Real-time fluorescensovervågning og smeltekurveanalyse blev udført med Bio-Rad ifølge producentens anbefalinger (Bio-Rad). Data blev analyseret ved Bio-Rad CFX Manager version 1.5 for at bestemme den tærskel cyklus (

Cp

) over baggrund for hver reaktion. Den relative mængde af målgenet blev normaliseret med den for

actin

af samme cDNA.

immunfluorescensfarvning

celler dyrket på dækglas blev skyllet med PBS og derefter fikseret med 3,7% formaldehyd i 6 min ved stuetemperatur, eller som fastsættes af iskold methanol /acetone (vægt /vægt, 1:01) i 10 minutter ved -20 ° C. Efter fiksering blev cellerne permeabiliseret ved inkubering med 0,01% Tween-20 i PBS i 3-5 minutter ved stuetemperatur. For at detektere centrosomer eller mikrotubuli blev celler farvet med monoklonalt anti-γ-tubulin (GTU-88, 1:200 fortynding) eller anti-α-tubulin (DM1A, 1:200 fortynding), henholdsvis, efterfulgt af inkubation med Alexa Fluor 488 eller 568 kanin-anti-muse-IgG (1:200 fortynding, Invitrogen). For at detektere endogen STK31 blev celler farvet med monoklonalt muse STK31 antistof, 1G10, efterfulgt af inkubation med Alexa Fluor 488 eller 568 kanin-anti-muse-IgG. Billeder blev observeret med et fluorescensmikroskop (Personal DV Applied Precision, Issaquah, WA), der har en udfoldning funktion (

softWORX

).

flowcytometri

AZ521 celler med forskellig cellecyklus behandling blev fikseret med 80% ethanol i 24 timer ved -20 ° C og derefter farvet med propidiumiodid (PI) i 30 minutter ved stuetemperatur. Cellecyklusfase fordeling blev analyseret ved en FACS Calibur-instrument (BD Biosciences).

TUNEL Assay

Celler blev fikseret med 4% paraformaldehyd og permeabiliseret med 0,1% Triton X-100 i PBS leveres med 0,1% natriumcitrat. Den TUNEL-analysen blev udført med en

In Situ

Cell Død Detection Kit, TMR, (Roche) i overensstemmelse med producentens protokol.

sårheling Assay

AZ521 celler og HCT116 celler blev podet i 3 cm skåle med en koncentration på 1 × 10

5 celler pr. Efter 24 timers transfektion med GFP og GFP-STK31 blev celler såret ved forsigtig tip-ridser. Bredden af ​​læsionen området varierede fra 500 um til 1 mm og er afbildet i mikroskop ved 0 timer, 6 timer, 12 timer og 24 timer. Migration effektivitet blev målt ved viklet interval.

Transwell assay

A Transwell med en porestørrelse på 3,0 um (Millipore, Bedford, MA) blev coatet med 5 ug /cm

2 collagen gel og lufttørret natten eller 0,5 mg /ml matrigel (BD Biosciences) i 1 time. GFP- eller GFP-STK31-transficerede celler blev resuspenderet i dyrkningsmedium uden 10% føtalt bovint serum (FBS) og podet i en transwell anbragt i en 24-brønds plade indeholdende vækstmedium med 10% FBS. Efter 24 timers inkubation blev transwell skyllet med PBS og fikseret med 3,7% formaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur. Endelig blev filtre fjernet fra brøndene og monteret med forlænger Guld antifade reagens med DAPI, og cellerne på filtrene blev talt under en immunofluorescens mikroskop (Olympus, BX51).

Resultater

Expression af STK31 i forskellige humane cancercellelinier og kliniske Humane tyktarms væv

STK31

overekspression i kliniske kolorektal cancer prøver er tidligere blevet rapporteret [23]. For at analysere ekspressionen af ​​

STK31

i cancer cellelinjer, Q-PCR blev udført på menneskelige kræftceller AZ521, A549, HeLa og A375. Blandt disse, som stammer fra forskellige væv, AZ521, en gastrisk adenocarcinom, viste den højeste

STK31

mRNA-ekspression (figur 1A). Udtrykket af

STK31

mRNA blev yderligere vurderet i mange kolorektale cancerceller sammenlignet med AZ521. Resultaterne viste, at alle disse celler udtrykte høje niveauer af

STK31

(figur 1B). Det samme resultat forekom i humane kliniske colorektale væv, som udtrykte høje niveauer af

STK31

i cancervæv forhold til normale væv fra den samme person (figur 1C). Baseret på det høje niveau af endogen

STK31

mRNA, AZ521 blev anvendt som celle model i denne undersøgelse.

(A) Samlet RNA fra fire humane cancercellelinier af forskellige væv, AZ521 ( en human colorektal cancer cellelinje), A549 (en human lungecancer-cellelinje), HeLa (en human cervix-cancer-cellelinje), A375 (en human melanoma cancer cellelinje), og en normal human mammae epitelcelle (normal), der var isoleret for real-time PCR til at bestemme

STK31

mRNA-niveauer.

STK31

var signifikant overudtrykt i den humane gastrisk cancer cellelinje, AZ521, i forhold til andre menneskelige kræftceller. (B) Total RNA fremstillet fra seks gastrointestinale kræft cellelinjer blev anvendt til at detektere

STK31

mRNA-ekspression niveau ved real-time PCR, som beskrevet i A. (C) Parret humane tyk- og endetarmskræft væv (N, normalt væv; T, tumor væv) blev opsamlet til isolering af totalt RNA til detektering ekspressionsniveauerne af

STK31

ved RT-PCR.

Actin

blev anvendt som en intern kontrol. Otte repræsentant parrede prøver blev vist.

Endogen STK31 er beliggende i centrosom, Kinetochore, Central spindel, og midterstykke under mitosen

For yderligere at undersøge de fysiologiske roller STK31 i somatiske kræftceller, specifik STK31 monoklonale (1G10, figur 2A) og polyklonale (19717) antistoffer blev genereret mod forskellige menneskelige STK31 peptider (figur 2A, øvre). Specificiteten af ​​disse to antistoffer blev påvist ved Western blot-analyse af totale lysater fra AZ521 celler eksogent udtrykker EGFP-tagget humant STK31 protein (STK31-GFP) eller muse Stk31 protein (Stk31-GFP) (figur 2A). Resultaterne viser, at endogen STK31 (figur 2A, bane 7), exogent STK31-GFP (figur 2A, bane 8), og Stk31-GFP-fusionsproteinet (figur 2A, bane 9) kan detekteres af det monoklonale antistof, 1G10. Polyklonale STK31 antistoffer, 19.717, kan kun detektere det exogene STK31-GFP (figur 2A, bane 5), men ikke det endogene STK31 og Stk31-GFP (figur 2A, bane 4 og 6). Specificiteten af ​​det monoklonale antistof, 1G10, på A549-celler og AZ521 celler blev også bekræftet at detektere det endogene STK31 (fig S1). De differential proteinniveauer af A549-celler og AZ521 celler er i overensstemmelse med mRNA-ekspression som bestemt ved real-time reverse transkription-PCR (figur 1A).

(A) Skematisk repræsentation af STK31 polypeptid. To epitoper, aminosyrer 231-350 og 982-996, blev anvendt som antigener til at generere det monoklonale antistof, 1G10, og polyklonale antistoffer, 19.717 hhv. Efter oprensning blev specificiteten af ​​19717 (bane 4-6) og 1G10 (bane 7-9) bekræftet ved immunoblot (IB) analyse ved anvendelse AZ521 samlede lysat (bane 1, 4 og 7), STK31-GFP (indeholder den humane formular STK31 banerne 2, 5 og 8), eller Stk31-GFP (indeholder mus formular Stk31 banerne 3, 6, og 9) transficeret AZ521 cellelysater. Anti-GFP blev anvendt som en positiv kontrol for IB til påvisning af ekspression af STK31-GFP og Stk31-GFP (bane 1-3). α-tubulin blev anvendt som en loading kontrol. (B) AZ521 celler blev dobbelt farvet med 1G10 (grøn) og pericentrin (rød, en kendt centrosomal protein). DNA blev visualiseret ved anvendelse af DAPI (blå). Profase, a-d; metafase, e-h; anafase, i-l; og telofase, m-s. Flettede billeder er vist til højre (d, h, l, og p). (C) AZ521 celler blev co-immunfarvet med 1G10 (grøn, a-e) og anti-Aurora B (rød, f-j) antistoffer. De fusionerede billeder vises (k-o). (D) Celler blev dobbelt farvet med STK31 (grøn), Aurora-B (rød), og DNA (blå). Kun blev vist flettede billeder. Pile indikerede colokalisering af STK31 og Aurora-B hele cellecyklus.

For at få indsigt i den biologiske funktion af STK31 i kræftceller, den subcellulære lokalisering af endogen STK31 blev bestemt. AZ521 celler blev co-immunfarvet med antistoffer mod STK31 (1G10) og pericentrin (PCNT), en centrosom-associeret protein ved immunofluorescens-analyse. Under profase og metafase, STK31 co-lokaliseret med PCNT, hvilket tyder på en forening med spindel poler (figur 2B, a-h). Desuden blev STK31 fundet at opholde sig centromerregionen under metafase (figur 2B, e-h), spindel Mellemzone under anafase (figur 2B, i-l), og til slut koncentreret ved midterskrog under telofase (figur 2B, m- p).

for yderligere at bekræfte lokaliseringen af ​​STK31 under mitose, AZ521 celler blev co-immunfarvet med antistoffer mod STK31 og det kromosomale passager kompleks (CPC) protein, Aurora-B (figur 2C). CPC er sammensat af Aurora-B-kinase, INCENP, overlevende, og borealin [24], og er kendt for at migrere fra indre centromerer til spindlen Mellemzone og ækvatoriale celle cortex under metafase-anafase overgang. Immunofluorescens-farvning viste, at Aurora-B viser den cellulære re-lokalisering adfærd, der er blevet anført i tidligere undersøgelser (figur 2C, f-j). Bemærkelsesværdigt blev STK31 farvning (figur 2C, a-e) fundet at være co-lokaliseret med Aurora-B ved centromerregionen, spindel zone, og midterskrog (figur 2C, k-o). Bemærk, at ud over den co-lokalisering med Aurora-B, blev STK31 sig også at have stærke signaler ved spindel poler (Figur 2D, pile). Denne subcellulære fordeling af STK31 er svarende til den i Polo-like kinase 1 (PLK1) [25].

Ekspressionen af ​​STK31 er cellecyklus-afhængig

For at undersøge cellecyklus ekspressionsmønsteret af STK31 blev AZ521 celler synkroniseres af nocodazol (NZ) eller dobbelt thymidin behandling bekræftet ved flowcytometri (figur 3A), og ekspressionen af ​​endogent STK31 protein blev bestemt ved Western blot analyse. Resultatet viste, at STK31 proteinekspression er faldet i G2 scenen og nåede sit laveste niveau i M-fasen (figur 3B). Western blot-analyse fra totale cellelysater frigivet fra nocodazol behandling viste, at STK31 proteinniveauer var lavest i NZ-behandlede celler (figur 3C, bane 2), og efter frigivelse, STK31 øges gradvist under mitose (figur 3C, bane 3-10). Efter at have forladt mitose, cellecyklus igen ind i G1 fase, som blev angivet af cyclin-B1 nedbrydning ved 180 minutter efter udgivelsen, og STK31 niveauet steget (figur 3C, bane 7). Ektopisk-udtrykte STK31-GFP præsenterer den samme ekspressionsmønster med endogent STK31 (figur 3D). To vigtige strategier er involveret i cellecyklus-regulerede proteiner. Først kan protein overflod kontrolleres på transkriptionsniveauet. For det andet, protein omsætningen med proteolytisk nedbrydning, som er den vigtigste mekanisme, der regulerer udgang fra mitose, er målrettet efter APC /C-CDH1 kompleks gennem sin ødelæggelse boks (D-box). Vi først tjekket udtryk for endogene

STK31

mRNA ved Q-PCR, og fandt, at

STK31

mRNA faldt på prometafasen (figur 3E). Interessant er endda proteinet ekspression af STK31 præsenteret på et lavere niveau i G2 fase (figur 3B), og mRNA-niveauet har nogen klar forskel med de asynchronized celler (figur 3e). Desuden ved at analysere aminosyresekvensen for STK31, fandt vi, at STK31 indeholder det konserverede D-kassemotiv ved Arg

643 positionen (R

643) (figur 4A). For at bekræfte, at det lavere niveau af STK31 ved mitose exit skyldes APC /C-induceret ubiquitin-proteasom nedbrydning, blev D-box mutant af GFP-STK31 genereret til at analysere sin cellecyklus udtryk mønster (figur 4A). Fra figur 4B, udtryk for STK31-GFP D-box mutant blev øget betydeligt i G2 fase i forhold til vildtype STK31-GFP.

(A) Asynchronized eller nocodazol (NZ) -behandlede AZ521 celler opsamlet for at analysere deres cellecyklus population ved flowcytometri. Procentdelene af G1, S og G2 /M er vist nedenfor. De runde-up celler efter NZ behandling var shake-off og defineret som M-fase celler, og de vedhæftede celler tilbage efter shake-off blev anset for at være den G2 fase. (B) I alt AZ521 lysater fra asynchronized (Asy), M-fase (M), og G2 fase af celler blev indsamlet til Western blot-analyse med anti-STK31 polyklonale antistoffer. Phospho-histon H3 serin 10 (P-H3 /S10) er en markør for mitotiske celler. (C) AZ521 celler frigivet fra nocodazol behandling med forskellige tidspunkter (fra 0 til 360 minutter) blev opsamlet til analyse af ekspressionsmønsteret for STK31 af IB-analyse. Anti-Cyclin-B og anti-phospho-histon H3 (p-H3 /S10) antistoffer blev anvendt som mitotiske markører. (D) AZ521 celler ektopisk udtrykker GFP eller STK31-GFP blev behandlet med nocodazol. M-fase-sammendrag celler blev opsamlet ved ryste op, og forbliver fastgjort celler opsamlet som G2 fase. Asynchronized celler (Asyn) er vist. α-tubulin eller GAPDH blev anvendt som intern kontrol for IB. (E) Total RNA fra forskellige cellecyklus faser af AZ521 blev høstet for at analysere ekspression af

STK31

mRNA ved real-time PCR. Tre uafhængige forsøg blev udført (N = 3), og midler med standardafvigelser er vist.

(A) En formodet D-kassemotiv ligger inden aminosyrerne 643-651 af STK31. Den bevarede position, Arg643 (R643), inden for D-box blev vist. (B) Asynchronized (Asy), M-fasen, og G2 fase AZ521 celler med STK31-GFP eller STK31-GFP /D-box mutant ekspression blev opsamlet at udføre IB-analyse under anvendelse af anti-GFP-antistof. Ekspressionsniveauer af STK31-GFP vises som forhold. Phospho-histon H3 serin 10 (P-H3 /S10) er en markør for mitotiske celler. GAPDH er en belastning kontrol.

overekspression af STK31 Øger Cell Migration og invasiv

På grund af overekspression af STK31 i kræft cellelinjer og kolorektal cancer væv (figur 1), den fysiologiske rolle STK31 i tumorigenese var under undersøgt ved ektopisk-overudtrykt STK31-GFP. STK31-GFP forøgede ikke celleproliferation sats i AZ521 og HTC116 celler (figur 5A) eller den cellecyklusfordeling (figur 5B). Imidlertid overekspressionen af ​​STK31-GFP gjorde forøge cellemigrering evne AZ521 og HTC116 (figur 5C). Baseret på Transwell migration og invasion-assays, overudtrykt STK31-GFP aktiveret mere AZ521 og HTC116 celler at passere gennem matrigel eller Collegen-coatede brønde (figur 5D). Ved Q-PCR-analyse, ekspressionsniveauet af

matrix metallopeptidasen 2

(

MMP2

), en migration markør, blev øget i STK31-GFP-udtrykte celler, men i høj grad deprimeret i sh

STK31

transficerede celler (figur 5E).

(A) Svarende mængde AZ521 eller HCT116 celler med GFP eller STK31-GFP udtryk var seedet, og cellevækst blev derefter overvåget ved at beregne levedygtige tal celle på den angivne tid. Tre uafhængige forsøg blev udført, og deres kvantitative resultater er vist. Ekspressionen af ​​GFP eller STK31-GFP ved dag 1 og dag 5 blev påvist med IB under anvendelse af anti-GFP-antistof. α-tubulin er en intern kontrol. (B) AZ521 celler med GFP eller STK31-GFP-ekspression blev opsamlet til analyse cellepopulation fordeling ved flowcytometri. (C) AZ521 eller HCT116 celler med GFP eller STK31-GFP-ekspression blev anvendt til at udføre sårhelende migration assay. Intervallet af cellemigrering på forskellige tidspunkter (0-24 h) blev målt og er vist. Kvantitative resultater er vist nedenfor. (D) AZ521 (øvre) eller HCT116 (lavere) celler med GFP eller STK31-GFP-ekspression blev podet til type II-collagen-coatede eller Matrigelcoatede trans-brønde til at udføre cellemigration eller invasion assays. Efter farvet med DAPI, en DNA-specifik farvestof blev celler talt og de kvantitative resultater er vist. Tre uafhængige forsøg blev udført. (E) Celler transfekteret med STK31-GFP eller smittet i lentiviral-baseret

STK31

shRNA (sh

STK31

) blev indsamlet til at detektere udtryk for

MMP-to

ved real-time PCR (højre). Overudtrykt STK31-GFP blev detekteret ved IB-analyse (til venstre). Udtrykket af

STK31

i sh

STK31

celler blev bestemt ved real-time PCR og normaliseret af

β-actin Hotel (midten).

udtømningen af ​​STK31 Årsager mikrotubulussamling Mangler under Interfase

STK31 blev postuleret at inddrage mikrotubuli organisation på grundlag af sin centrosomal lokalisering. For at teste dette, brugte vi en kold behandling for at fremkalde mikrotubulusdepolymerisation og derefter fremkalde mikrotubuli fornyet vækst. Celler blev efterfølgende fikseret og immunfarvet med anti-α-tubulin at observere genmontering og forlængelse af mikrotubuli. Celler med

STK31

shRNA tagget med EGFP (sh

STK31

GFP, den knockdown effektivitet se figur S2B) viste fejl på tre niveauer: små /ingen defekter (Figur S3A), moderate defekter (Figur S3B) og alvorlige defekter (figur S3C). Vi sammenlignede celler transficeret med sh

STK31

GFP og cellerne transficeret med Luciferase shRNA tagget med EGFP (shLuc-

GFP

) som kontrol, og bestemmes antallet af celler for hver type ( Figur S3D). Resultaterne viste, at cellerne forarmet i STK31 undladt at vise en forsvarlig organisation af mikrotubuli.

Den Knockdown ekspression af STK31 af shRNA Resultater i Mitotisk Progression Forsinkelse i GC-1 Cell

For at analysere, hvordan udtømningen af ​​STK31 påvirker mitotisk progression, brugte vi live-cell time-lapse mikroskopi til at overvåge skæbne GC-1 celler transficeret med sh

STK31

GFP og sammenlignet dem med celler transficeret med sh

Luc

GFP (figur S4) efter frigivet fra en dobbelt thymidin blok. Vi fik timeout varigheden af ​​mitotisk progression fra kromosom kondens (mitotisk indgang) til cytokinese (mitotisk exit). Vi fandt, at det tog 185 minutter for sh

Luc

GFP celle for at fuldføre mitosen (fig S4A-S4H), hvorimod 357 min er nødvendige for sh

STK31

GFP celle at nå telofase (fig S4i-S4P). Varigheden af ​​intervallet af celler transficeret med sh

STK31

GFP steget to gange sammenlignet med transfektion med sh

Luc

GFP (figur S4, P og H henholdsvis). Dette antyder, at STK31 mangel forårsager en forsinkelse i mitotisk progression i GC-1 celle.

Den Knockdown ekspression af STK31 af shRNA Årsager Mitotisk Catastrophe og fører til apoptose i cancerceller

Vi derefter undersøgte potentielle rolle STK31 hjælp af knockdown tilgang. Western blotting blev udført på AZ521 celler inficeret med lentiviral STK31 shRNA (sh

STK31

) opnået fra Academia Sinica at teste knockdown effektivitet (figur 6A). Vi først kontrolleres virkningen af ​​lentiviral sh

STK31

-inficerede celler interfererer med cellepopulationen grund subcellulære lokalisering og cellecyklussen-afhængig ekspression mønster af STK31. Flowcytometri-analyse indikerede, at en øget subG1 og en nedsat G2 /M blev observeret i lentiviral sh

STK31

inficerede celler (figur 6B). For at bekræfte, om STK31 mangel fører til apoptose, både aktiv caspase 3 og en TUNEL analyse blev udført på AZ521 celler inficeret med lentiviral sh

STK31

. Fra figur 6C og 6D, viste STK31 knockdown celler en oplagt apoptose befolkning.

(A) Efter 72 h infektion af lentiviral-baseret

STK31

shRNA (sh

STK31

) eller kontrol shRNA (shCtrl) blev AZ521 celler høstet for at bestemme STK31 udtryk ved IB. (B-D) Kontrol (shCtrl) eller sh

STK31

-inficerede celler (sh

STK31

) blev opsamlet til analyse cellecyklus befolkning ved flowcytometri (B), til påvisning af ekspression af aktivt caspase-3 ved IB (C), og til at udføre TUNEL-assayet (D). Celler behandlet med DNase I blev anvendt som positive kontroller i C og D. celler uden behandling var de negative kontroller for TUNEL-assayet. Den røde signal i 6D repræsenterer de apoptotiske celler. ***,

P

værdi 0,001. (E) Time-lapse billeder af celler transficeret med

STK31

shRNA tagget med EGFP (sh

STK31

GFP) (A-H). Cellerne blev synkroniseret med nocodazol (150 ng /ml) i 16 timer. Efter frigørelse fra nocodazol blev cellerne observeret med time-lapse mikroskopi. Nabolandet utransficerede celler (angivet ved den hvide pil) med succes gennemgik mitose og komplet cytokinese, mens knockdown celle (angivet af den gule pil) forblev på et længerevarende mitose-lignende scene. Vi fik timeout varigheden af ​​mitose fra nedbrydning nukleare kuvert (ved 0 min, a) og fandt, at ved 272 min den knockdown celle endte med en apoptotisk-lignende funktion (h).

Vi spurgte yderligere om udtømning af STK31 inducerer samme effekt på mitotisk progression i kræftceller. Ligeledes blev time-lapse mikroskopi anvendes til at overvåge AZ521 celler transficeret med sh

STK31

GFP. Cellerne blev behandlet med nocodazol i 16 timer og derefter gennemgik live-cell imaging. Den sh

STK31

GFP celler undladt at forlade mitose, mens kontrolcellerne gennemført mitose og trådte G1 fasen (figur 6E).