PLoS ONE: Kemisk Genomic-baserede Pathway Analyser for epidermal vækstfaktor-medieret signalering i Migrering Cancer Cells

Abstrakte

At udforske mangfoldighed og sammenhæng i de signalveje, der regulerer tumor celle migration, valgte vi tre humane tumorcellelinjer der migrerede efter behandling med EGF. Vi kvantificeres derefter virkningen af ​​femten inhibitorer på niveauerne af ekspression eller phosphoryleringsniveauerne af ni proteiner, der blev induceret af EGF-stimulering i hver af disse cellelinier. Baseret på dataene opnået i dette studie og kemisk-biologiske forudsætninger, vi udledes cellemigration veje i hver tumorcellelinie, og derefter sammenlignet dem. Som et resultat heraf fandt vi, at både MEK /ERK og JNK /c-Jun pathways blev aktiveret i alle tre migrerer cellelinier. Desuden GSK-3 og p38 blev fundet at regulere PI3K /Akt pathway på kun EC109 celler, og JNK fandtes at krydstale med p38 og Fos relateret pathway i kun TT-celler. Tilsammen kunne vores analysesystem nemt skelne mellem de fælles og celle typespecifikke veje er ansvarlige for tumor celle migration

Henvisning:. Magi S, Saeki Y, Kasamatsu M, Tashiro E, Imoto M (2014) Chemical genomisk-baserede Pathway Analyser for epidermal vækstfaktor-medieret signalering i Migrering kræftceller. PLoS ONE 9 (5): e96776. doi: 10,1371 /journal.pone.0096776

Redaktør: Laszlo Buday, Ungarsk videnskabsakademi, Ungarn

Modtaget: November 10, 2013; Accepteret 11. april 2014 Udgivet: 12 maj, 2014

Copyright: © 2014 Magi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev understøttet af en Grant-in-Støtte til Udfordrende Forberedende forskning og JSP’er Fellows, Ministeriet for Uddannelse, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi, Japan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Cellemigration er centralt for mange fysiologiske processer, herunder fosterudvikling, sårheling, immunresponser, samt tumorcelleinvasion og metastase [1]. Når en tumorcelle bevæger sig, er adskillige signalveje, der indledes med receptortyrosinkinaser (RTK’er), G-protein-koblede receptorer (GPCR’er), integriner og andre receptorer. Et bemærkelsesværdigt eksempel på en RTK er den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR), som aktiveres ved binding af dens ligand, epidermal vækstfaktor (EGF) [2]. Aktiveringen af ​​EGFR fører til aktivering af én eller flere mellemliggende signalnet grene, som regulerer cellemotilitet, såsom det ekstracellulære-regulerede kinase (ERK) pathway [3], phosphoinositid 3-OH-kinase (PI3K) pathway [4], Janus kinase (Jak) vej [5], c-Jun-NH2 terminal kinase (JNK) vej, og p38 vej [6], [7].

de centrale elementer i den intracellulære migration-signalering netværk er blevet påvist i tidligere undersøgelser. er imidlertid sandsynligt, at de signalmolekyler, der regulerer cellemigrering i en cancercelle ikke kan regulere cellemigrering i andre genetisk forskellige cancerceller. Adskillige tidligere rapporter har indikeret, at hver type kræft celle initierer migration i forskellige sammenhænge ved hjælp distinkte molekylære repertoirer, selvom den samme grundlæggende proces med cellemigration induceres [8], [9]. Derfor forstå mangfoldighed og generelle i signalveje, der regulerer tumorcellemigration i forskellige celletyper er ikke kun vigtigt for grundforskningen i cellemigrering, men også til udvikling af anti-metastatiske antitumorlægemidler.

for at løse dette problem, vi tidligere undersøgt effekten af ​​småmolekyleinhibitorer på ti celle migration systemtyper. Vi skelnes mellem de fælles og celle typespecifikke signaler er ansvarlige for celle migration [10]. Tidligere forskning har indikeret hvilke molekyler faktisk involveret i cellemigrering af hver kræft celletype. Imidlertid signaleringsdata net af disse molekyler, der regulerer cellemigrering fortsat uklare. I denne rapport, at løse dette problem, vi udnyttet en tilgang, der kombinerer kemiske genetik og systembiologi, som er gradvist blevet anerkendt som en nyttig metode til at udlede signalvej net [11]. I vores tidligere rapport, fandt vi, at tre cancercellelinier (dvs., epidermal carcinoma A431 celler, esophageal carcinoma EC109 celler og thyreoideakarcinom TT celler) erhvervede celle motilitet af EGF-stimulering, men kemosensitivitet klynge-analyse viste, at A431-celler og EC109 celler er samlet i den samme klynge, på den anden side er TT-celler klassificeres i den anden klynge. Derfor i denne undersøgelse, at afsløre mangfoldighed og ensartethed i EGF-induceret signalvej regulering cellemigrering i disse tre celler, vi kvantitativt undersøgt effekten af ​​kemiske inhibitorer på EGF-induceret ekspressionsniveauer eller phosphoryleringsniveauet af flere signalmolekyler at identificere som signalmolekyle virker opstrøms for andre signaleringsmolekyler. Anvendelse af resultaterne af disse eksperimenter, vi kortlagt en cellemigrering vej hos hver cancercellelinie, og sammenlignede pathway kort for at afsløre netværkstopologien som værende enten fælles for alle cancerceller eller specifikke for bestemte celletyper.

Resultater

de forskellige aktivering mønstre af EGF-signalering blandt tre cancer cellelinjer

for det første, vi har registreret phosphorylering eller ekspressionen af ​​signalmolekyler induceret af EGF i tre kræft celle linjer over et tidsforløb (figur 1 og S1). Autophosphorylering af EGF-receptoren og efterfølgende EGF-induceret phosphorylering af p38 blev begge observeret i alle cellelinier efter 5 min efter EGF-stimulering, som det er velkendt. Stigningen i ekspressionen af ​​c-Fos og phosphorylering af c-Jun blev observeret i alle cellelinier 1 time efter EGF-stimulering. På den anden side viste adskillige andre molekyler forskellige tid-afhængig aktivering profiler mellem de tre cancercellelinier. For eksempel blev phosphorylering af Akt (p-Akt, S473 og T308 rester) induceret mellem 5 min og 1 time efter EGF-stimulering i EC109 celler og TT-celler. Imidlertid phosphoryleringsniveauerne af p-Akt (S473) og p-Akt (T308) i A431-celler var noget konstant selv efter EGF stimulering af op til 12 timer. Desuden den relative intensitet af p-Akt (T308) viste en maksimal intensitet 5 min efter EGF-stimulering i TT-celler, men efter 1 time i EC109 celler. Mønsteret af ERK-phosphorylering (p-ERK) er også forskellig blandt de tre cancercellelinier. ERK blev forbigående phosphoryleret af EGF-stimulering i alle tre celler, mens der blev observeret sit højdepunkt 5 min efter EGF stimulering i A431 celler og EC109 celler, og efter 1 time i TT celler. Ekspressionsniveauet af EGFR begyndte at falde efter EGF stimulering i EC109 celler og TT-celler, men ikke i A431-celler.

A431-celler, EC109 celler, og TT-celler blev stimuleret med EGF (30 ng ml

-1) i den angivne tid og totale cellelysater blev underkastet western blotting. A.U., vilkårlig enhed normaliseret ved intensiteten af ​​actin. Midlerne og SDS af tre uafhængige forsøg er vist. Grafen farver repræsenterer hver cellelinje data: A431 celler (rød), EC109 celler (grøn), og TT-celler (blå). Den stiplede linje angiver, at EGF-stimulation ikke forårsage en væsentlig ændring af A.U. af hvert molekyle (One-way ANOVA). Originale immunoblot billeder er vist i figur S1.

Virkningerne af migrationshæmmere om migration EGF-induceret signalering

Dernæst vi undersøgt virkningerne af 15-hæmmere, der påvirkede evne celler til at migrere i vores tidligere rapport [10], på EGF-induceret phosphorylering eller ekspression af disse signaleringsmolekyler til tiden viser den højeste intensitet af hver signalmolekyle som angivet ved tidsforløbet data (tabel S1) i hver cancercellelinie ( Figur S2). Tabel S2 viser de navne og de eksperimentelle anvendte koncentrationer af de kemiske inhibitorer af signaltransduktion anvendt i denne undersøgelse, og deres virkemåder. Immunblottet billeder i figur S2 omfatter bands for hver af fire betingelser: negativ kontrol (EGF – og inhibitor -, bane 1), positiv kontrol (EGF + og inhibitor -, bane 2), både EGF og inhibitor-behandlede tilstand (EGF + og inhibitoren +, bane 3), og inhibitor-behandlede tilstand (EGF – og inhibitor +, bane 4). For at kvantificere virkningen af ​​inhibitorerne, vi derefter normaliseret signalintensiteten så bane 1 (dvs. ikke-behandlede betingelse) blev betegnet som 0, og bane 2 (dvs. EGF-behandlede betingelse) blev betegnet 1. På grundlag af disse standarder, vi kvantificeret den relative signalintensitet af bane 3 og 4, og endelig vi opnåede kvantitativ datasæt af effekten af ​​kemiske inhibitorer på EGF-induceret migration signalering i hver cellelinje (figur 2).

Heat maps afbilder virkningerne af småmolekylære inhibitorer for EGF-induceret signalering i A431-celler (top), EC109 celler (i midten), og TT-celler (nederst). Data blev normaliseret ved centrering ikke-treat tilstand som 0, og skalering EGF-behandlede tilstand til 1. Alle cellelinjer blev behandlet med EGF efter forbehandling med inhibitorer i 15 minutter. Efter den angivne tid, blev cellerne opsamlet og underkastet western blotting. AMD; Actinomycin D, CHX; Cycloheximid HMA; Herbimycin A. Koncentrationen af ​​kemiske inhibitorer er anført i tabel S2. Originale immunoblot billeder er vist i figur S2.

Fradrag af migration signalering i tre cancer cellelinjer

Vi forsøgte derefter at udlede signalering netværk regulerer celle migration i hver kræft cellelinjebaseret på kemosensitivitet profiler opnået på udtrykket status EGF-induceret signalmolekyler. På området kemisk biologi kan en signalvej udledes ved hjælp af begrebet beskrevet i figur 3 (se også, eksperimentelle procedurer). For at bestemme om inhibitorer perturberede de signalmolekyler eller ikke definerede vi ± 0,5 som en tærskel. I tilfældet i fig 3a, MEK inhibitor U0126 undertrykt EGF-induceret phosphorylering af ERK (p-ERK) med mere end 50%. I sådanne tilfælde vi definerede to positive signal bestemmelser; en fra EGFR til MEK, og den anden fra MEK til p-ERK. I tilfælde af figur 3b, PI3K-inhibitoren LY294002 øgede EGF-induceret c-fos-ekspression med mere end 50%. I disse tilfælde vi defineret eksistensen af ​​en positiv regulering forhold fra EGFR til c-Fos og en negativ regulering forhold fra PI3K til c-Fos. I tilfælde af figur 3c, GSK-3 inhibitor SB415286 forøget c-Jun-ekspression uden EGF-stimulering. I disse tilfælde vi defineret eksistensen af ​​en positiv regulering forhold fra EGFR til c-Jun og en negativ regulering forhold fra GSK-3 til c-Jun. På denne måde, baseret på den semikvantitative profil (figur 2 og beskrevet i figur 3 koncept), vi udledes et signalnet for hver cancercellelinie som en underskrevet orienteret graf (figur 4). EGF-induceret migration vej hos A431-celler bestod af 19 knuder og 39 kanter (figur 4A), vejen i EC109 celler bestod af 22 knuder og 62 kanter (figur 4b), og vejen i TT-celler bestod af 21 knudepunkter og 51 kanter (figur 4c). Grunden til, at antallet af veje i A431-celler er mindre end i de andre to cellelinjer kan være, at niveauet af p-Akt (T308) og p-Akt (S473) ikke kunne vurderes på A431-celler.

Detaljeret beskrivelse præsenteres i afsnittet Resultater og eksperimentelle procedurer afsnittet.

EGF-induceret migration signalering netværk i (a) A431 celler, (b) EC109 celler, og (c) TT celler. Tærsklen blev fastsat til ± 50% fra den positive kontrol. Kanten farve er besluttet på baggrund af tegn på kanterne; rød indikerer positiv signalering, og blå indikerer negativ signalering. Størrelsen af ​​knudepunktet angiver antallet af forbindende kanter. Farven på node angiver antallet af output-veje: a. Gradient farve skala fra grøn til rød, interpoleret over gul

Sammenligning af signalveje i hver kræft cellelinje

Baseret på disse pathway kort, vi udvindes den fælles struktur for signalveje for celle migration i alle tre kræft celle undersøgt i denne undersøgelse linjer. Figur 5a viser den fælles topologi blandt de tre cellelinjer. Denne fælles syntesevej omfatter MEK /ERK /c-Fos-vejen og JNK /c-Jun-vejen, som begge er almindeligt forsket på cellemigrering [6], [7], [12], [13]. Vi fandt også, at MEK reguleret ekspressionsniveauer af c-Fos og p21, og at PI3K undertrykkes ekspressionsniveauerne af c-Fos i de tre cancercellelinier. På den anden side, havde andre EGFR-regulerede signaler, såsom ROCK og CysLT1 ikke har nogen output pathways, hvilket antyder, at de nedstrøms signaler af disse molekyler kan variere mellem hver cancercellelinie. Dernæst vi vurderet de specifikke strukturer af migrationsrelaterede signalveje i hver af kræft cellelinier (figur 5b~d). Den specifikke vej hos A431-celler omfatter kun 11 veje, herunder p-JNK → c-Jun-ekspression og 5-lipoxygenase (5-LO) → c-Fos. Antallet af specifikke veje i EC109 celler og i TT-celler er 24 og 13, hvilket viser, at omkring en femtedel til en tredjedel af veje i disse celler er celle-type-afhængige veje.

(a ) fælles EGF-induceret signalering netværk blandt tre kræft cellelinjer. (B~d) Specifik EGF-induceret signalering netværk i (b) A431-celler, (c) EC109 celler, og (d) TT-celler. Kanten farve er besluttet på baggrund af tegn på kanterne; rød indikerer positiv signalering, og blå indikerer negativ signalering.

I en tidligere undersøgelse, vi forudsagde, at lignende veje inducere og regulere celle migration i A431 celler og EC109 celler, men disse veje kan være forskellige fra TT celler [10]. At tydeliggøre forskellen i signaleringsveje mellem de to grupper, sammenlignes derefter vi signalvejene af EC109 celler og TT-celler, som indeholder alle de samme knudepunkter (figur 6). Figur 6a viser den overlappende pathway topologi i begge cellelinier. Denne vej kort omfatter PI3K → p-Akt, JNK → p-Akt (S473) og ROCK → p-p38, hvilket tyder på, at disse veje spiller en konsekvent rolle i celle migration. Figur 6b, c viser de specifikke pathway topologier i EC109 celler og TT-celler, hhv. I alt 29 pathways (47% af veje i EC109 celler), såsom MEK → c-Jun, GSK-3 → p-Akt (S473) og HMG-CoA → Pakt (T308), er specifikke for EC109 celler, og 18 veje (35% af veje i TT-celler), herunder p-JNK → p-p38, og ROCK → c-Fos, er specifikke for TT celler. Phosphorylering af p-Akt er opreguleret af p38, GSK-3, og HMG-CoA i EC109 celler, mens der ikke var nogen specifik positiv vej til p-Akt i TT celler. På den anden side, er JNK påkrævet til forøgelse af både c-Fos-ekspression og fosforylering af p38 i TT celler, hvorimod en sådan regulering ikke blev observeret i EC109 celler. Desuden er der en EGFR-p38 positiv feedback loop i TT-celler, men der er ikke sådan vej hos EC109 celler. Disse resultater viser, at aktivering af Akt kan være afgørende for cellemigrering af EC109 celler, men Akt aktiveringsvej afhænger cancer celletyper. Desuden kan stress-responsive MAPK pathway være dominerende i regulatorisk vej af celle migration af TT celler.

(a) Fælles signalering netværk mellem EC109 celler og TT celler. (B) Særlig EGF-induceret signalering netværk i EC109 celler. (C) Specifik EGF-induceret signalering netværk i TT-celler. Kanten farve er besluttet på baggrund af tegn på kanterne; rød indikerer positiv signalering, og blå indikerer negativ signalering.

Diskussion

I denne undersøgelse har vi kortlagt de regulatoriske signalveje for celle migration i epidermal carcinom A431 celler, esophageal carcinoma EC109 celler og thyreoideakarcinom TT celler. Ved at sammenligne dem, afslørede vi de fælles veje i de tre cellelinjer og identificeret de celle-typespecifikke signalveje, baseret på en kemisk genetisk og systembiologi tilgang. For at opnå dette mål, vi først sammenlignet tidsafhængighedsaspekterne aktivering mønstre af signalmolekyler i hver cellelinje involveret i EGF-induceret celle migration. De aktiveringsmønstre af nogle signalmolekyler er delvis forskellig mellem de tre cancercellelinier (figur 1). For eksempel aktiveringsmønstre af c-Fos og p-p38 er ret ens blandt de tre cancer testede cellelinjer, mens de mønstre af p-ERK og p-c-Jun er forskellige. De relative intensiteter af vedvarende p-ERK og p-c-Jun i TT-celler er højere end dem i A431-celler og EC109 celler. Interessant, denne forskel er konsistent med tidligere rapporterede klassifikationer af kemosensitivitet profiler af disse tre cellelinier [10], hvilket antyder, at vedvarende ERK og c-Jun-phosphorylering er involveret i celle-typespecifikke veje for cellemigrering i TT-celler. Overvejer en positiv feedback mekanisme, hvormed vedvarende JNK aktivitet kan fremme ERK signalering gennem IRS-2 [14] blev rapporteret, kan disse mekanismer også opererer i TT celle migration. Til gengæld blev phosphoryleringen af ​​Akt induceret af EGF-stimulering i EC109 celler og TT-celler, men phosphoryleringsniveauerne af Akt var noget konstant i A431-celler efter stimulering EGF. Vi har tidligere rapporteret, at EGF-induceret migrering af A431-celler undertrykkes ved tilsætning af PI3K-inhibitorer [10]. Skønt EGF ikke signifikant inducerer Akt fosforylering, er steady state phosphoryleret og aktiveret Akt kræves til EGF-induceret migrering af A431 celler. En anden forskel i tidsforløbet data mellem de tre cancercellelinier er vist ved ekspressionsniveauet af EGFR. EGF-stimulering faldt ekspressionsniveauet af EGFR i EC109 celler og TT-celler, men ikke i A431-celler. Når EGF binder til EGFR, er EGFR kendt for at være hurtigt internaliseret fra celleoverfladen via flere veje, herunder clathrin-overtrukne gruber [9], [15]. Internaliserede receptorer enten recirkuleres til celleoverfladen eller transporteres til lysosomer for nedbrydning. Det er velkendt, at skæbnen for receptorerne styres af adskillige proteiner ved internalisering, såsom Cbl og LRRK1 [16], [17]. Således kan vores resultater viser, at reguleringen af ​​EGF-induceret receptor nedbrydning er forskellig blandt de tre kræftceller, og denne forskel dikterer vedvarende aktivering af downstream signalering mål.

Regulatory veje for celle migration i hvert kræft cellelinie blev bestemt ved at undersøge effekten af ​​cellen migrationshæmmere på signaltransduktionsmolekyler (figur 4). Den overlappende pathway topologi i alle tre testede cellelinier omfatter JNK → p-c-Jun, som forudsiges som en fælles regulator i en tidligere undersøgelse. Dette tyder på, at lovgivningsmæssige signalering for kræftcellen migration ved JNK gennem phosphorylering af c-Jun er faktisk en fælles mekanisme i alle typer af kræftceller. Fordi vi ikke kunne påvise signifikant opregulering af p-Akt i EGF-stimuleret A431 celler i denne undersøgelse, kunne EGF signalvej kortet i A431 celler omfatter ikke regulering af p-Akt og dermed indeholder færre knuder og kanter end i EC109 celler og TT celler i vores analysemetode. Derfor skal en fortolkning af sammenligningen mellem pathway maps blandt tre cancer cellelinjer gøres med forsigtighed.

For at diskutere og bekræfte resultaterne af klyngeanalyse i vores tidligere rapport [10], vi endelig sammenlignet vejen kortet ansvarlig for cellemigrering mellem EC109 celler og TT-celler og bestemmes den overlappede eller celletypespecifik topologi (figur 6). Akt phosphorylering bølger i EC109 celler er langsommere end den, TT-celler (figur 1 og tabel S1), hvilket antyder, at flere mellemliggende proteiner regulerer Akt phosphorylering i EC109 celler end TT celler. Faktisk niveauet af Akt phosphorylering var opreguleret af p38, GSK-3, og HMG-CoA i EC109 celler, mens disse veje ikke indgik i TT-celler (figur 6b, c). På den anden side, ERK phosphorylering bølger i TT celler er langsommere og mere kontinuerlig end i EC109 celler (figur 1 og tabel S1), hvilket antyder, at flere mellemliggende proteiner regulerer ERK-phosphorylering i TT celler end EC109 celler. Men vi kunne ikke finde nogen specifik regulering, som kan opretholde fosforylering niveau af ERK i TT celler. Vi mener, at et andet molekyle vi ikke vurderer i denne undersøgelse kan bidrage til vedvarende ERK fosforylering. Disse forskelle i EGF-inducerede signalvej kan afspejle forskelle i den måde, cellemigrering baseret på cellemorfologi. I vores tidligere undersøgelse fandt vi, at EC109 celler flyttes samtidig bevare celle-celle kontakter (kollektiv migration), men TT celler flyttede som enkelte celler (individuel migration) [10]. På baggrund af ovenstående resultater, er det sandsynligt, at kræftcellerne bevæge sig som en enkelt celle, når MAPK pathway kontinuerligt aktiveres, mens celler migrerer kollektivt og vedligeholde celle-celle adhæsion når PI3K /Akt pathway kontinuerligt aktiveres af p38 og GKS- 3. Disse forskellige roller MAPK og PI3K veje for migration tilstande understøttes også af følgende tidligere rapporter. MAPK-aktivering følgelig inducerer RhoA aktivering og epithelial-mesenchymal-overgang, mens PI3K-aktivering undertrykker RhoA aktivitet i tyktarmskræft [9]. Desuden er PI3K rekrutteres til adhæsionskomplekser [18], hvor deres aktivering via cadherin signalering virkninger cadherin funktion og styrker celle-celle adhæsion [19], [20]. Dette kunne indebære PI3K-induceret Rac1 aktivering, fordi E-cadherin-stimuleret actin cytoskeletal reorganisering kræver Rac aktivering og PI3P-aktiverede GEF Tiam1 [21].

Tilsammen vores kemiske genomisk baseret pathway analyse i tre cancercelle linjer demonstrere konsekvens og variation i EGF-inducerede regulatoriske signalvej til regulering kræftcellen vandring mellem celletyper ved hjælp af en kombination tilgang af kemisk biologi og systembiologi. Især GSK-3 og p38 regulerer p-Akt på kun øsofageale carcinoma EC109 celler, på den anden side, JNK regulerer p38 og Fos relateret pathway kun thyreoideakarcinom TT-celler. Disse fund indikerer, at nogle celletype-specifik signaleringsvej regulering cellemigrering ville være terapeutiske molekylære mål for celletypespecifikke cancermetastase: GSK-3- og p38- relaterede veje i esophageal carcinoma, og stress responsive-MAPK’er-relaterd veje i thyreoideakarcinom . Men for at forstå sammenhængen og række lovgivningsmæssige signalvej mere præcist, er der flere spørgsmål, vi skal beskæftige sig med i fremtiden. Selvom vi brugte en inhibitor mod en signalering molekyle i denne undersøgelse, bør flere inhibitorer mod et signalmolekyle bruges til at bekræfte specificiteten af ​​inhibitorer. Desuden bør tidspunkt, hvor vi vurdere virkningerne af inhibitorer på EGF-induceret phosphorylering eller ekspression af disse signalmolekyler skal verificeres. Det bør også udarbejdet hvordan man skelner regulatoriske vej for cellemigrering fra at for andre cellulære responser, såsom cellevækst. Ikke desto mindre, i denne undersøgelse, giver vi en ny tilgang for at forstå de særlige kendetegn ved kræft celle migration signalering, og åbn potentialet for at afsløre en ny molekylær vej som et mål for kræftbehandling.

Materialer og metoder

Cell Culture

A431-celler (opnået fra ATCC CRL-1555) blev opretholdt i DMEM suppleret med 5% kalveserum (CS), 0,1 gl

-1 kanamycin, 100 enheder ml

-1 penicillin G, 0,6 gl

-1 L-glutamin, og 2,5 gl

-1 NaHCO

3. EC109 (begavede fra Dr. Doki, Osaka University, Japan), TT-celler (begavet fra Kirin selskab, Japan) blev holdt i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium 1640 suppleret med 5% FBS, 0,1 gl

-1 kanamycin , 100 enheder ml

-1 penicillin G, 0,6 gl

-1 L-glutamin, og 2,5 gl

-1 NaHCO

3. Til rutinemæssig dyrkning blev cellerne inkuberet i en standard befugtet inkubator ved 37 ° C i 5% CO

2.

Reagenser

AG1478 (EGFR-inhibitor), rapamycin (mTOR inhibitor), og Y27632 (ROCK inhibitor) blev købt fra Calbiochem. MK571 (CysLT1 hæmmer) blev købt fra Cayman. AA861 (5-lipoxygenase inhibitor), Actinomycin D (Transcription-inhibitor), cycloheximid (Oversættelse inhibitor), LY294002 (PI3K-inhibitor), Mevastatin (HMG-CoA-reduktaseinhibitor), MG132 (proteasominhibitor), SB203580 (p38-inhibitor), SB415286 ( GSK-3-inhibitor), SP600125 (JNK-inhibitor), U0126 (MEK-inhibitor), og epidermal vækstfaktor (EGF) blev indkøbt fra Sigma. Herbimycin A (Hsp90 inhibitor) blev oprenset fra kulturer af

Streptomyces

sp. i vores eget laboratorium.

Western Blotting

Efter forbehandling med enten bil eller inhibitorer til 15 min, celler blev behandlet med EGF for den angivne tid. Celler blev lyseret i RIPA-puffer (25 mM Hepes pH 7,8, 1,5% Triton X-100, 1% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 0,5 M NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 0,1 mM natriumvanadat, 1 mM PMSF, og 0,1 mg ml

-1 leupeptin) ved 4 ° C med lydbehandling. Lysaterne blev centrifugeret, og supernatanter blev udvundet. Efter bestemmelse af koncentrationen af ​​proteinet i hvert lysat, og kogning i et tilsvarende volumen påsætningsbuffer (150 mM Tris pH 6,8, 30% glycerol, 3% SDS, 15 mg ml

-1 bromphenol farvestof, og 100 mM 2 mercaptoethanol) blev prøverne derefter elektroforese i en polyacrylamidgel. Proteiner blev overført til en PVDF-membran, og immunblottet. Antistoffer anvendt til immunoblotting, var: anti-EGF-receptor-antistof (# 2232), anti-Akt antistof (# 9272), anti-phospho-Akt (Thr308) antistof (# 9275), anti-phospho-Akt (Ser473) antistof (# 9271), anti-c-Jun-antistof (# 9165), anti-phospho-p38-antistof (# 9211), anti-MAPK (ERK 1/2) antistof (# 9102), anti-phospho-MAPK (ERK 1/2 ) antistof (# 9101) (Cell Signaling); anti-c-Fos-antistof (sc-7202), anti-p38-antistof (sc-7972), anti-p21-antistof (sc-397) (Santa Cruz Biotechnology); anti-phospho-tyrosin-antistof (05-321) (Upstate); anti-phospho-c-Jun-antistof (558.036) (BD Pharmingen); anti-β-actin-antistof (A5316) (Sigma).

Statistisk analyse

En-vejs ANOVA blev anvendt til bestemmelse signifikante forskelle i tidsrækker datasæt. En Pearsons korrelation blev anvendt til at bekræfte reproducerbarheden af ​​dataene. Disse statistiske analyser blev beregnet ved hjælp af R (www.r-project.org/).

Netværk fradrag baseret på kemisk biologi

Den underskrevne rettet netværk blev udledt fra en forskel i protein fosforylering eller ekspressionsniveauer mellem mock-behandlede og inhibitor-behandlede data, efter reglen vist i figur 3. Denne regel omfatter tre simple antagelser, der almindeligvis anvendes i kemisk biologi: a) at der findes en positiv regulering fra molekyle til molekyle X Y når niveauet af molekylet Y i nærværelse af både EGF og en inhibitor af X er mere end 50% lavere end i EGF-behandlede tilstand; b) Der findes en negativ regulering fra molekyle til molekyle X Y når niveauet af molekylet Y i nærværelse af både EGF og inhibitor af X er mere end 50% højere end i EGF-behandlede tilstand; c) Der findes en negativ regulering fra molekyle til molekyle X Y når niveauet af molekylet Y i nærværelse af inhibitor af X er højere end halvdelen af ​​niveauet i EGF-behandlede tilstand. Den databehandling, som endelig udgange pathway information består af kilde node, target node, og regulatoriske type (positiv eller negativ) blev udført ved hjælp af R. Denne fil importeres til Cytoscape software (www.cytoscape.org/), og signalvej kort blev dannet. Sammenligningen af ​​sti topologi blev også udført ved hjælp Cytoscape avancerede netværk fusionere plugin.

Støtte oplysninger

figur S1.

Repræsentative immunoblot billeder præsenteret i figur 1. (a) A431 celler, (b) EC109 celler, og (c) TT celler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0096776.s001

(PDF)

Figur S2.

Repræsentative immunoblot billeder præsenteret i Figur 2. (a) A431 celler, (b) EC109 celler, og (c) TT celler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0096776.s002

(PDF)

tabel S1. .

Evalueringen tidslinje af virkningerne af inhibitorer

doi: 10,1371 /journal.pone.0096776.s003

(DOCX)

tabel S2. Salg Sammensatte koncentrationer og mål for hæmning anvendt i denne undersøgelse

doi:. 10,1371 /journal.pone.0096776.s004

(DOCX)