PLoS ONE: Pulchrin A, en New Natural coumarinderivat af Enicosanthellum pulchrum, inducerer apoptose i æggestokkene Cancer Cells via Intrinsic Pathway

Abstrakt

Lægemiddelresistens er en udfordring i kemoterapi og har tiltrukket forskningsinteresse i hele verden og særlig opmærksomhed er blevet givet til naturlige forbindelser at overvinde denne vanskelighed. Pulchrin A, et nyt stof isoleret fra naturlige produkter har vist nye muligheder for udvikling som et lægemiddel. Identifikationen af ​​pulchrin A blev udført under anvendelse af flere spektroskopiske teknikker, såsom kernemagnetisk resonans, væskekromatografi massespektrometer, infrarød og ultraviolet spektrometri. Cytotoksiciteten virkninger på CAOV-3-celler viser, at pulchrin A er mere aktiv end cisplatin, som har en IC

50 på 22,3 uM. Væsentlige ændringer i cellemorfologi var til stede, såsom cellemembranblæredannelse og dannelse af apoptotiske legemer. Inddragelsen af ​​phosphatidylserin (PS) i apoptose blev bekræftet ved Annexin V-FITC efter en 24 h behandling. Apoptose blev aktiveret gennem indre vej ved aktivering af procaspases 3 og 9 samt kløvede caspase 3 og 9 og sluttede ved bøddelen bane, med forekomsten af ​​DNA laddering. Apoptose blev yderligere bekræftet via gen- og protein ekspressionsniveauer, hvori Bcl-2-protein blev nedreguleret og Bax protein blev opreguleret. Endvidere blev CAOV-3 cellecyklus forstyrret ved G0 /G1-fasen, hvilket fører til apoptose. Molekylær modellering af Bcl-2-proteiner viste en høj bindingsaffinitet, som inhiberede funktion af Bcl-2-proteiner og førte til celledød. Resultaterne af den aktuelle undersøgelse kan belyse udviklingen af ​​nye terapeutiske midler, især, menneskelige æggestokkene kræftbehandling

Henvisning:. Nordin N, Fadaeinasab M, Mohan S, Mohd Hashim N, Othman R, Karimian H, et al. (2016) Pulchrin A, en New Natural coumarinderivat af

Enicosanthellum pulchrum

, inducerer apoptose i æggestokkene Cancer Cells via Intrinsic Pathway. PLoS ONE 11 (5): e0154023. doi: 10,1371 /journal.pone.0154023

Redaktør: Yi-Hsien Hsieh, Institut for Biokemi og Bioteknologi, TAIWAN

Modtaget: December 26, 2015; Accepteret: April 7, 2016; Udgivet: Maj 2, 2016

Copyright: © 2016 Nordin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af University of Malaya under PPP tilskud (PG151-2012B) og Ministeriet for videregående Uddannelser Malaysia under High Impact Research Grants (UM -MOHE UM.C /625/1 /HIR /MOHE /SC /09)

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er en alvorlig sygdom, der påvirker den menneskelige befolkning verdensplan [1]. Omkring, er halvdelen af ​​alle mænd og mere end en tredjedel af alle kvinder diagnosticeret med kræft i løbet af deres levetid. I mellemtiden, en fjerdedel af voksne dør på grund af kræft [2]. Data indsamlet af Det Internationale Agentur for Forskning i Cancer (IARC) om registrering af kræft og dødelighed viser, at næsten 12,6 mio nye kræfttilfælde blev rapporteret i 2008 alene på verdensplan [2]. Ifølge National Cancer Registry of Malaysia [3], blev i alt 8.123 (44,6%) mænd og 10.096 (55,4%) kvinder beboere diagnosticeret med kræft i Peninsular Malaysia i 2007.

I mellemtiden, i alt 239.000 nye tilfælde på verdensplan blev konstateret for ovariecancer [4]. Ovariecancer er den mest dødelige gynækologiske cancer primært på grund af mangel på symptomer specificitet og biomarkører til rådighed for detektion i de tidlige stadier af sygdommen. I de fleste æggestokkene kræfttilfælde blev sene diagnose almindeligt opdaget blandt patienter, der var ude af stand til effektivt at reagere på behandlingen. Generelt er disse patienter har en 5-års overlevelse, men dette tal er blevet reduceret til 20-30% [5-7]. Behandling af patienter med ovariecancer er baseret på standard protokol, hvor kirurgi er den indledende behandling efterfulgt af kemoterapi. Tre forskellige lægemidler, som normalt anvendes til behandling af kræft i æggestokkene er doxorubicin, carboplatin og taxan. Men disse lægemidler er ofte mindre effektive, hvorved patienter kan udvise resistens over for det administrerede lægemiddel [8]. Disse ulemper har bedt forskere til at udforske potentielt effektive alternative forbindelser som behandling for kræft i æggestokkene.

Cumarin og dets derivater tilhører lacton familien omfatter benzopyron skelet rammer, som kan findes udbredt i naturen [9]. Coumarinderivater har vist sig at udvise betydelige terapeutiske og forskellige biologiske aktiviteter [10, 11], der er anvendelige i fotokemoterapi, antitumorterapi og anti-HIV-behandling [12, 13]. De kan anvendes som centralnervesystemet (CNS) stimulanser [14], antibakterielle [15, 16], svampemidler [17, 18], antiinflammatoriske [19], antikoagulantia [20], tuberkulostatiske [21] og farvestoffer [22]. Nogle af coumarinderivater er også rapporteret som fikseringsmidler og smagsstoffer. Imidlertid har USA Food and Drug Administration (FDA) regulerer brugen af ​​coumarin som fødevaretilsætningsstoffer [23-25]. Potente antibiotika afledt af cumarin, såsom novobiocin, coumaromycin og chartesium er kommercielt tilgængelige [26]. I den foreliggende undersøgelse blev en ny coumarinderivat isoleret for første gang fra naturligt produkt,

Enicosanthellum pulchrum

. En lang alkylgruppe var forbundet til heterocykliske coumarinringen at undersøge dens potentiale som lovende anticancermiddel mod det humane ovariecancer-cellelinje CAOV-3 ved lave koncentrationer i løbet af 24 timer.

Materialer og metoder Salg

eksperimentel

silicagel H blev indkøbt fra Sigma-Aldrich, hvorimod silicagel 60 (230˗400 mesh), dimetylsulfoxide (DMSO), methanol (MeOH), ethanol (EtOH),

n

hexan og ethylacetat (EtOAc) blev indkøbt fra Merck Co. (Tyskland). 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT-reagens) blev tilvejebragt af Invitrogen (Carlsbad, USA). RPMI-1640 medium (pH 7,4), penicillin /streptomycin og føtalt bovint serum (FBS) blev indkøbt fra Nacalai Tesque (Japan) og trypsin-EDTA 10X blev leveret af Biowest (USA). Den ultraviolette (UV) spektre og den infrarøde (IR) spektre blev registreret på et UV-spektrofotometer (UV-1601 Shimadzu, Japan) og FT-IR spektrometer Spectrum RXI (Perkin Elmer, USA), hhv. Den kernemagnetiske resonans (NMR) spektre blev registreret på et 600 MHz Bruker (Schweiz) spektrometer. Optisk rotation blev udført i Jusco (Tokyo, Japan). Massespektre blev registreret til elektron (ESI) massespektrometri på it-TOF fra Shimadzu, Japan. Højtydende væskekromatografi (HPLC) analyse blev også udført.

Udarbejdelse af plante udtræk

Rødder af

E

.

pulchrum

blev indsamlet i september 2011 på bjerget skov af Cameron Highlands (Pahang, Malaysia). Direktøren for Forestry Department of Pahang, Malaysia fik tilladelse til at komme ind og indsamle prøverne [27]. Anlægget blev identificeret af den afdøde Prof. Dr. Kamarudin Mat Salleh fra Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM). Prøven (SM769) blev placeret ved Botany Department Herbarium, Det Naturvidenskabelige Fakultet og Teknologi, UKM (Bangi, Malaysia). Rødderne blev lufttørret og formalet til 40-60 mesh partikelstørrelse. Ekstrakterne blev fremstillet ved udblødning i

n

hexan opløsningsmiddel. En rotationsfordamper (Buchi, Schweiz) blev anvendt til at fjerne opløsningsmidlerne fra prøverne.

Udvinding og isolering af pulchrin A

Til oprensning af pulchrin A, hexanekstrakten blev separeret ved søjlechromatografi (CC) anvendelse af silicagel typen 60 (230-400 mesh). Opløsningsmiddelsystemet blev anvendt til at adskille forbindelserne i gradient kolonnen fra mindre polære til mest polære (hexan-EtOAc-MeOH). I alt 157 fraktioner blev opsamlet under anvendelse af en 20 ml hætteglas. blev opnået i alt 12 fraktioner baseret på denne faktor af hver forbindelse ved tyndtlagskromatografi (TLC) -analyse. Fraktion 3 (A9-A12) blev yderligere oprenset ved anvendelse prep-TLC. En ny forbindelse blev med held adskilt ved hjælp af

n

hexan-EtOAc (8: 2) solvent system. Forbindelsen benævnt pulchrin A blev belyst ved NMR, mens renheden af ​​pulchrin A blev bestemt ved HPLC ved anvendelse af 10% til 100% acetonitril (volumen /volumen) gradienteluering i løbet af 15 minutter ved en strømningshastighed på 0,5 ml /minut.

Strukturel udredning Analyser

Kernemagnetisk resonansspektroskopi (NMR).

kort fortalt pulchrin A blev analyseret ved NMR til at undersøge tilstedeværelsen af ​​proton og carbon-atomer gennem 1D (

1 H og

13C) og 2D (COSY-45, HSQC og HMBC) eksperimenter. Forbindelsen blev fremstillet ved opløsning med deutereret chloroform (CDC

3) i NMR-rør. Før analyse blev NMR-rør placeret i NMR-spektrometer til videre behandling.

massespektroskopi (MS).

Massespektroskopi er primært at bestemme molekylvægten af ​​pulchrin A. Analysen blev udført under anvendelse af LCMS-IT-TOF instrument. Pulchrin A blev opløst i MeOH, inden injektion i instrumentet. Massen spektret blev optaget på de positive og negative tilstand.

Fourier Transform-infrarød spektroskopi (FT-IR).

Fourier Transform-Infrarød spektroskopi (FT-IR) blev udført for at opdage tilstedeværelsen af ​​funktionel gruppe i pulchrin A. forbindelsen blev opløst i CHC

3 og falder ned på natriumchlorid (NaCl) pellet. Før analyse blev pelleten placeret i FT-IR-instrument. Resultatet blev registreret ved absorption af 500-4000 cm

-1.

Ultraviolet spektroskopi (UV) og optisk rotation.

Pulchrin A blev opløst i MeOH, før de overføres til en cuvette. De bølgelængder, der anvendes til at påvise tilstedeværelsen af ​​atomer, varierede fra 190 nm til 800 nm. Absorptionen blev derefter registreret under anvendelse af et UV-spektrofotometer. Resultaterne blev udtrykt i form af et absorptionsspektrum. I mellemtiden blev der i alt 0,05 M af pulchrin A opløst i CHC

3 og overføres til en Jasco P-1020 polarimeter. Temperaturen af ​​måling af den optiske drejning var 24 ° C.

Cytotoksicitetsassay

To humane ovariecancerceller (CAOV-3 og SKOV-3) blev oprindeligt indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC , Manassas, USA). Immortaliserede humane ovarieepitelceller (T1074) blev opnået fra Applied biologisk materiale (ABM

® Crestwood Place Richmond, Canada). Disse cellelinier blev dyrket i vores institution laboratorium. Alle celler blev videredyrket og dyrket i 25 ml kolbe indeholdende RPMI-1640 medium (CAOV-3 og SKOV-3) og Prigrow 1 medium (T1074) [28], suppleret med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin. Sammenflydende celler blev derefter vasket med PBS inden de høstes med Trypsin-EDTA 10X opløsning. De høstede celler blev centrifugeret ved 1800 rpm i 5 minutter og fortyndet til 1 x 10

6 celler /ml celler. Assay blev udført i en 96-brønds plade indeholdende 1 × 10

4 celler /brønd. Forud for behandling, i alt 1 × 10

4 ug /ml pulchrin A blev fremstillet ved tilsætning af 1,0 mg forbindelse i 100 pi DMSO. De CAOV-3-celler blev behandlet med pulchrin A i en koncentration på 50 ug /ml op til 0,78 ug /ml ved 2 gange seriel fortynding. Cellerne blev derefter inkuberet ved 24, 48 og 72 timer. Før målingen, MTT-opløsning (20

μ

L) blev tilsat i hver brønd og inkuberet i 3 timer. Pladen blev registreret ved en absorbans på 570 nm ved anvendelse af en mikropladelæser. Resultatet blev indstillet som IC

50 værdi, hvorved cisplatin (IC

50: 30,6 uM). Blev anvendt som positiv kontrol i undersøgelsen

Acridin orange /propidiumiodid (AO /PI) dobbelt farvning assay

AO /PI dobbelt farvning assay blev gennemført i overensstemmelse med den, der anvendes til fluorescens mikroskopi standard procedure (Lieca med Q-Floro software). Assayet blev udført i en 25 ml dyrkningskolbe (Nunc), hvorved CAOV-3 og T1074 celler blev udsat med pulchrin A (22 uM) ved 24, 48 og 72 timer. Før farvning blev de høstede celler blev vasket med PBS. I alt 10

μ

L fra AO og PI (10

μ

g /ml) blev tilsat til cellepelleten. Cellerne blev observeret inden for 30 min under en UV-fluorescerende mikroskop (Olympus BX51) at evaluere de morfologiske ændringer før fluorescens fading.

Annexin-V-FITC assay

Effekten af ​​pulchrin A under den indledende fase af apoptose blev analyseret under anvendelse af fluoresceinisothiocyanat (FITC) Annexin V apoptose Detektion Kit i (BD Pharmingen

™). De CAOV-3-celler blev dyrket i en plade med 6 brønde og behandlet med pulchrin A (22 pM) i 24, 48 og 72 timer. Cellerne (5 x 10

4 celler /ml) blev derefter opsamlet ved centrifugering ved 1600 rpm i 5 min. I alt 100 pi af hver prøve blev overført til et rør indeholdende 5 pi FITC Annexin V og 10 pi PI. Suspensionen blev blandet forsigtigt og tilsættes 100 pi 1 × assaypuffer. Detektion blev udført under anvendelse af et flowcytometer (BD FACSCanto

™ II, San Jose, CA, USA)

Kolorimetriske caspaser analyse

cysteinyl asparaginsyre-protease (Caspaser) -3,. – 8 og -9 assays blev udført under anvendelse af et kommercielt kit (caspaser 3, 8 og 9 kolorimetrisk assay: R hver cyklus bestod af 2 min af revers transkriptase ved 50 ° C, 20 sek af polymerase-aktivering ved 95 ° C, 1 sek af denaturering ved 95 ° C og 20 sekunders annealing ved 60 ° C. Processen blev afsluttet efter 40 cykler af læsning. Data blev derefter beregnet ud fra den sammenlignende Ct (2-ΔΔCt) standard metoden beskrevet i den undersøgelse, som Wong og Medrano (2005) [29].

Western blot assay

CAOV-3 celler blev podet i et 75 ml dyrkningskolbe og behandlet med pulchrin a (22 uM) ved 24, 48 og 72 timer. De høstede celler blev centrifugeret ved 13.000 rpm i 10 s og 400 pi for PRO-PREP

™ opløsning blev tilsat for at resuspendere cellerne. Cellerne blev induceret til lysis ved inkubering ved -20 ° C i 20 min. Forud for adskillelse ved 10% SDS-PAGE, 100 ug protein blev alikvoteret og blandet med påføringsfarvestof. Gelen fik lov at løbe i 90 minutter, før den blev overført til en polyvinylidenedifluoride (PVDF) membran (Bio-Rad). PVDF-membranen blev blokeret i 3 timer med 5% BSA. Det primære antistof til

β

actin (1: 1000), Bax (1: 1000), Bcl-2 (1: 1000), survivin (1: 1000), caspases 3 og 9 (1: 1000 ) og spaltede caspaser 3 og 9 (1: 1000) blev konjugeret med et sekundært antistof (gede pAb til Rb IgG). Processen fortsættes i 1 time inkubation ved stuetemperatur. Det bundne antistof blev påvist under anvendelse af et kolorimetrisk detektion kit og eksponeret i flere minutter for at tillade forekomst af båndene. PVDF-membranen blev vist og fotograferet under anvendelse af et UV-lys transilluminator.

Protein profil matrix

CAOV-3-celler behandlet med Pulchrin A (22 uM) blev evalueret for apoptotiske proteinmarkører ved at bruge Proteome profiler Array (RayBio

® humant Apoptose Antibody Array Kit, Raybiotech, USA) i overensstemmelse med producentens protokol. Ekstraheret protein (200 pg /ml) fra CAOV-3-celler blev tilsat til hver brønd indeholdende membran og blev efterladt natten over ved 4 ° C til inkubation. Vaskeproceduren ved hjælp vaskebuffere I og II blev udført for hver inkubation. Før detektion, membranen blev tilsat et biotinyleret antistof cocktail og efterfølgende med HRP-streptavidin til inkubation natten over. I alt 500 pi påvisning puffer blev pipetteret på membranen. De klemt membraner blev overført og udsat for chemiluminescens imaging system og derefter fotograferet (Biospectrum AC Chemi HR 410, UVP, Cambridge, UK).

Cell cyklus assay

De behandlede celler med pulchrin A blev opsamlet og derefter vasket to gange med PBS ved 1800 rpm centrifugering i 5 min. Cellerne blev fikseret med en fiksering opløsning ved at tilsætte 700 pi 90% kold EtOH og holdes natten over ved 4 ° C for at genoprette celler integritet. EtOH blev derefter kasseret, og skyllet med 600 pi PBS ved centrifugering ved 1800 rpm i 5 min. I alt 25 pi RNaseA (10 mg /ml) og 50 pi propidiumiodid (PI) (1 mg /ml) blev blandet med de fikserede celler og inkuberet i 1 time ved 37 ° C. Analyse af DNA-indholdet for standsning af cellecyklus blev udført med flowcytometri (BFACSCanto

™ II).

Protein-bindende interaktion

Denne undersøgelse blev udført ved anvendelse af anti-apoptotiske protein Bcl- 2 sammenholdt med standarden Bcl-2-inhibitor ABT 737 [30]. Bcl-2 tredimensionale krystalstruktur blev opnået fra RCSB Protein Data Bank [31, 32] med 4IEH PDB id’er [30]. Den automatiserede docking software (Autodock 4.2) program blev anvendt til at beregne docking af små molekyler, baseret på den Lamarckiske genetiske algoritme [33]. Vandmolekyler blev fjernet til fremstilling af proteinmolekyler. Polar brintatomer blev sat ind i strukturen, mens ikke-polære hydrogenatomer blev fusioneret. Desuden blev Gasteiger gebyrer og solvatisering parametre tildelt som standard. Ved at bruge AutoGrid 4.2 software, blev gitteret parameterfil indstilles med værdier for x, y og z-akserne; gitteret afstanden var til 0,375 Å, standardværdien. Samspillet bindingsenergi blev også beregnet ved anvendelse af Autodock 4.2 programmet.

Statistisk analyse

IC

50 værdier blev bestemt ved hjælp af GraphPad Prism ver. 4,0 (Graphpad Software Inc., USA). Hver test blev udført i tre gentagelser og værdierne blev rapporteret som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Ved at bruge SPSS ver. 17,0 (IBM Corporation, USA), envejs ANOVA med Dunnetts test blev anvendt til at analysere dataene for statistisk signifikans. I mellemtiden blev kvantitative analyser af proteiner perfomed hjælp ImageJ software.

Resultater

Struktur Identifikation af Pulchrin A

En ny naturlig coumarinderivat, pulchrin A (figur 1) blev belyst ved hjælp af fuldstændige NMR-spektre (tabel 1), samt UV-, IR- og ESI-massespektrometri (S1-S7 figurerne).

HMBC korrelation er fremhævet med røde og blå pile angivet som

J

2 og

J

3, henholdsvis mens COSY korrelationer i sort pil farve

hvid olie.; Udbytte: 0,005%, [α] -16 (

c

0,05, CHC

3). TLC: (

n

hexan: EtOAc, 80:20 v /v): R

f = 0,56. UV (MeOH) λ

max (log €): 356 (3,80), 315 (4,03), 280 (4,32) nm. IR ν

max (CHC

3); 2921, 2853 (CH), 1759 (OC = O), 1463 cm

-1. HRESIMS m /z [M + Na] 465,3240 (10), 338,3380 (90), 339,3430 (60) (beregnet for C

30H

50o

2, 442,7066).

1H NMR (CDC

3, 600MHz) δ ppm: 0,89 (3H,

m

, H-21), 1,25 (2H,

m

, H-18) , 1,28 (14H,

m

, H-11, H-12, H-13, H-14, H-15, H-16, H-17), 1,29 (2H,

m

, H-6′), 1,30 (2H,

m

, H-19), 1,32 (2H,

m

, H-20), 1,34 (2H,

m

, H-7′), 1,43 (2H,

m

, H-8′), 1,51 (2H,

m

, H-2), 1,55 (2H ,

m

, H-10), 1,59 (2H,

m

, H-5′), 2,02 (2H,

m

, H-9), 2,21 (2H,

m

, H-3), 2,25 (2H,

m

, H-1), 2,91 (2H,

m

, H-6), 2,93 (1H,

m

, H-4a), 4,90 (1H,

m

, H-8a), 5,33 (1H,

m

, H-7) , 5,35 (1H,

m

, H-8), 5,40 (2H,

m

, H-4, H-5), 6,98 (1H,

m

, H-4′).

13C NMR (CDC

3, 150 MHz) δ ppm: 14,1 (C-21), 22,4 (C-20), 22,7 (C-18), 24,3 (C-3), 25,2 (C- 1), 26,6 (C-2), 27,2 (C-7′), 27,4 (C-9), 27,9 (C-5′), 28,0 (C-10), 29,2 (C-6′), 29,5 ( C-11, C-12, C-13, C-14), 29,6 (C-15, C-16, C-17), 29,7 (C-8′), 32,0 (C-19), 56,8 (C -4a), 57,3 (C-6), 76,9 (C-8a), 128,3 (C-8), 129,8 (C-7), 131,0 (C-4, C5), 134,4 (C-3′), 148,8 (C-4′), 173,9 (C-2′).

cytotoksiske effekt af Pulchrin A

Tre cellelinier blev testet, herunder to ovariecancerceller (CAOV-3 og Skov- 3) og en immortaliseret human normal ovarie epitelial cellelinje (T1074) for at bestemme de cytotoksiske virkninger af pulchrin A (tabel 2). Desuden blev cisplatin også testet som positiv kontrol i denne undersøgelse (figur 2). IC

50 Resultaterne viste, at pulchrin A inhiberede 50% af CAOV-3 vækst celler ved 22,31 uM, sammenlignet med 33,63 pM mod SKOV-3-celler efter 24 timers behandling. Den CAOV-3 og SKOV-3-celler blev yderligere undersøgt for cytotoksiske virkninger ved 48 og 72 timer, udviser fald i IC

50 værdier som vist i fig 2. I mellemtiden de cytotoksiske virkninger af pulchrin A udviste tilsvarende virkninger i forhold til cisplatin på 24 timer mod CAOV-3 og SKOV-3 celler, som påviste, at pulchrin A udøvede højere cytotoksicitet mod både æggestokkene kræftceller. I modsætning hertil blev der fundet en mindre cytotoksisk virkning mod T1074 celler selv ved koncentrationer på mere end 100 uM.

Eksperimentet blev udført tre gange. Data er rapporteret som middelværdi ± SD.

Cytomorphology Evaluering af apoptose af AO /PI Dobbelt Farvning

apoptotiske effekt af pulchrin A på CAOV-3 og T1074 celler observeret via morfologiske ændringer under en fluorescens mikroskop. Den cytomorphology Evalueringen blev gennemført i CAOV-3 celler på grund af pulchrin A viste lav IC

50 koncentration mod CAOV-3 celler sammenlignet med SKOV-3 celler i cytotoksicitet analysen. Efter behandling ved en koncentration på 22 uM i 24, 48 og 72 timer, de CAOV-3-celler udviste apoptotiske egenskaber sammenlignet med T1074 celler. Under ubehandlede betingelser, cellerne udviste en sund afrundet form med en intakt nuklear struktur. Den celler morfologi blev ændret efter 24 timers behandling i CAOV-3-celler med tilstedeværelsen af ​​cellemembranblæredannelse og DNA-fragmentering. Omfattende celleskader kan tydeligt iagttages efter 48 timer og fremefter med tilstedeværelsen af ​​apoptotiske legemer og et rødligt-orange farve, hvilket indikerer, at cellerne undergik sent apoptose (fig 3a). I modsætning hertil T1074 celler udviste ingen signifikant forskel på cellemorfologien i sammenligning med ubehandlede T1074 celler mod apoptose proces, hvilket antyder, at pulchrin A var uskadelig for de normale ovarieceller (figur 3b).

[A] ubehandlede og behandlede -CAOV-3-celler med pulchrin A ved 24, 48 og 72 timer af behandlingen. De CAOV-3 celler udviste membran celle blebbing så tidligt som 24 timer af behandlingen. De følgende 48 timer af behandlingen viste mere membran celle blebbing og tilstedeværelsen af ​​apoptotiske legemer og Kromatin- kondensation. Tilstedeværelsen af ​​orange farvning celler ved 72 timers behandling, der repræsenterer kendetegnende for sent apoptose. [B] ubehandlede og behandlede-T1074 celler med pulchrin A ved 24, 48 og 72 timers behandling. De T1074 celler viste ingen signifikante forskelle i celler morfologi efter behandling med pulchrin A op til 72 timers behandling. VI, levedygtige celler; BL, blæredannelse af cellemembranen; CC, kromatin kondensering; LA, sen apoptose; AB, apoptotiske legemer. (Forstørrelse 40 × og 100 ×).

Analyse af Membrane Ændring

Ændringer i cellemembranen blev observeret af Annexin V-FITC assay udført ved hjælp af en 25 ml kolbe cointaining CAOV-3 celler behandlet med pulchrin A ved 24, 48 og 72 timer. Som vist i figur 4, afslørede de resultater, CAOV-3-celler behandlet med pulchrin A ved 24, 48 og 72 timer undergik tidlige fase apoptose som angivet ved 5,3, 9,4 og 14,3% stigninger i mængde i en tidsafhængig måde, hhv. De celler, der undergik sen fase apoptose og nekrose også steget inden for de første 24 til 72 timer efter behandling, i modsætning til de levedygtige celler, som viste et fald 92,5% til 40,5% i cellepopulation efter behandling.

[A] kontrol (ubehandlet), [B] 24 timer, [C] 48 h, [D] 72 timer. Mørk rød, blå, grøn og lys rød farve angivet levedygtig, tidlig apoptose, sen apoptose og sekundær nekrose hhv. Bevægelse af cellepopulationen blev startet i Q3 (levedygtige celler) til Q4 (tidlig apoptose) til 2. kvartal (sent apoptose), og endelig til Q1 (sekundær nekrose). [E] Histogram af cellepopulationer af levedygtige, tidlig apoptose, sen-apoptose og sekundær-nekrose CAOV-3 celler. Resultater blev repræsenteret som middelværdi ± SD af tre gentagelser. *

s

. 0,05 indikerer signifikant forskel fra kontrol

Analyse af Caspaser

Caspaser 3, 8 og 9 blev testet for at bestemme apoptoseveje. Resultaterne i figur 5 viser, at Caspaser 9 og 3 blev aktiveret ved pulchrin En eksponering gennem de iboende og udførelse veje, henholdsvis. I modsætning hertil caspase 8 viste uregelmæssige værdier, som afbildet i søjlediagrammet, hvilket antyder, at ingen aktivering af caspase 8 blev detekteret via stimulering af pulchrin A. Aktivering af caspaser 3, 8 og 9 blev også bekræftet på mRNA-niveauerne, hvor kun caspase 3 og 9 udviste overekspression i forhold til caspase 8 i en tidsafhængig måde. Ligeledes blev ekspressionsniveauerne af caspase 3 og caspase 9-proteiner signifikant opreguleret (

s Restaurant 0,05) i forhold til den for de ubehandlede CAOV-3-celler. Desuden proteinet ekspression af spaltet caspase 3 og spaltes caspase 9 steg under de tre forskellige behandlingsperioder, hvilket indikerer, at induktion af apoptose forekom via de iboende og udførelse pathways.

[A og B] Kolorimetrisk og rea- time PCR-analyse af caspaser 3, 8 og 9 henholdsvis. [C] Western blot-analyse karakteriseret ved billeder og histogram for pro-caspaser og spaltes caspaser. Resultater blev repræsenteret som middelværdi ± SD af tre uafhængige forsøg. Den væsentlige forskel udtrykkes *

s

. 0,05

Analyse om mitokondriel ændringer

Denne undersøgelse blev udført for at undersøge inddragelsen af ​​mitokondrier i apoptose på pulchrin En behandling. De tre parametre for total nuklear intensitet, cellepermeabilitet og cytochrom

c

frigivelse angav, at fluorescensintensiteten blev forøget, som vist i figur 6. Fluorescensintensiteterne af disse tre parametre steg ved koncentrationer så lave som 22 uM og signifikant forskelle (

s

0,05) blev bestemt ved en koncentration på 33 uM. I modsætning hertil fluorescensintensiteten af ​​mitochondriemembranpotential (MMP) for pulchrin A-behandlede CAOV-3-celler faldt i en koncentrationsafhængig måde. blev observeret signifikant forskel mellem de behandlede og ubehandlede CAOV-3 celler ved koncentrationer højere end 33 uM, når

s

. 0,05

Cellerne blev farvet med Hoechst, celle permeabilitet, mitochondriemembranpotential (MMP) og cytokrom

c

farvestoffer. Billederne på hver række blev taget til fange fra det samme område. De CAOV-3 celler udviste en reduktion i celle nummer og MMP, mens celler behandlet med pulvhrin A ved 24 timer (20 × forstørrelse) viste stigninger i celle permeabilitet og cytochrom

c

frigivelse. Histogrammet repræsenterer de gennemsnitlige intensiteter observeret samtidig i CAOV-3-celler i en koncentrationsafhængig måde for total nuklear intensitet, cellepermeabilitet, MMP og cytochrom

c

frigivelse. Alle data blev bestemt som gennemsnit ± SD, hvor signifikant forskel blev udtrykt som *

s

0,05.

DNA fragmentation assay

Dette assay blev udført for at bekræfte forekomsten af ​​sen apoptose i celler behandlet med pulchrin A. Tilstedeværelsen af ​​en DNA-stige på CAOV-3-celler blev observeret efter 24 timers behandling (figur 7); det samme blev observeret for den næste 48 og 72 timer. Dannelsen af ​​DNA stigen beviste forekomsten af ​​DNA-fragmentering i CAOV-3 celler, som induceret apoptose

Banerne A-C:. Celler behandlet med pulchrin A for 72, 48 og 24 timer, hhv. Lane D: ubehandlede celler.