PLoS ONE: miR-17 * Undertrykker tumorfremkaldende i prostatakræft ved at hæmme Mitochondrial antioxidant enzymer

abstrakt

Aberrant micro-RNA (miRNA) ekspression er blevet impliceret i patogenesen af ​​cancer. Nylige undersøgelser har vist, at MIR-17-92 klynge overudtrykkes i mange typer af cancer. Den onkogene funktion af modent miRNA kodes af MIR-17-92 klynge er blevet identificeret fra 5′-armen af ​​seks forstadier. Men funktionen af ​​miRNA fremstillet af 3′-armen af ​​disse forstadier fortsat ukendt. Den foreliggende undersøgelse viser, at MIR-17 * er i stand til at undertrykke kritiske primære mitochondriale antioxidant enzymer, såsom mangan superoxiddismutase (MnSOD), glutathionperoxidase-2 (GPX2) og thioredoxin reduktase-2 (TrxR2). Transfektion af MIR-17 * i prostatacancer PC-3-celler reducerer niveauer af de tre antioxidant proteiner og aktiviteten af ​​luciferase reporter under kontrol af MIR-17 * bindende sekvenser lokaliseret i 3′-utranslaterede regioner af de tre målgener . Disulfiram (DSF), en dithiolcarbomate lægemiddel vist sig at have en anticancervirkning, inducerer niveauet af modent MIR-17 * og celledød i PCA-celler, som kan svækkes ved transfektion af antisense MIR-17 *. Stigende miR-17 * niveau i PC-3 celler ved en Tet-on baseret betinget udtryk systemet markant undertrykker sin tumorigencity. Disse resultater tyder på, at miR-17 * kan undertrykke tumorgenicitet af prostatakræft gennem hæmning af mitokondrie antioxidant enzymer

Henvisning:. Xu Y, Fang F, Zhang J, Josson S, St. Clair WH, St. Clair DK (2010) miR-17 * Undertrykker tumorfremkaldende i prostatakræft ved at hæmme Mitochondrial antioxidant enzymer. PLoS ONE 5 (12): e14356. doi: 10,1371 /journal.pone.0014356

Redaktør: Andrei L. Gartel, University of Illinois i Chicago, USA

Modtaget: Juli 24, 2010; Accepteret: 20 oktober 2010; Udgivet: 22 December, 2010

Copyright: © 2010 Xu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health tilskud CA115801 til William H. St. Clair og give CA 049.797 til Daret K. St. Clair. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Micro-RNA (miRNA) er -22 nukleotid RNA molekyler, der generelt undertrykker oversættelsen af ​​target messenger RNA’er, der er involveret i forskellige aspekter af physiogenesis og patogenese [1] – [2]. MIR-17-92 klynge koder seks miRNA, herunder miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1, og miR-92, som forstærkes i flere typer af kræft væv end i tilsvarende normale væv [3] – [5]. Protoonkogen c-MYC opregulerer transkription af MIR-17-92 klynge og resulterer i nedregulering af E2F1 af MIR-17 [6], af PTEN af MIR-19 [7], og RB1 ved miR- 20a [8], hvilket antyder, at mIR-17-92 fungerer som et onkogent faktor. Til dato er de fleste af miRNA identificeret som havende evnen til at ændre fænotype og udvikling af kræft genereret fra 5′-armen af ​​miRNA forstadier. Imidlertid produktion og funktion af 3′-armen miRNA (miRNA *) forbliver undvigende.

Deregulering af redox-status er involveret i en række forskellige patogenese herunder cancer. Reaktive oxygenarter (ROS), der genereres fra ilt metabolisme afgiftes af flere antioxidant pathways [9]. Mitochondriale antioxidant enzymer, herunder mangan superoxiddismutase (MnSOD), glutathion-afhængig peroxidase (GPX) og thioredoxin- afhængige peroxidase (TrxR2), omfatter et primært forsvarssystem i mitokondrier og er afgørende for afgiftning mod ROS [10] – [12]. En konsekvens af den høje metabolisme af hurtigt voksende cancerceller er en hurtig generering af cellulær ROS. Kræftceller kræver derfor en høj antioxidant forsvarssystem til at klare de høje niveauer af ROS produktion [13], [14]. Således selektiv hæmning af antioxidant systemer er en mulighed for kræft intervention.

Prostatakræft (PCA) er en almindelig sygdom i nordamerikanske mænd. Fordi PCa udvikler en kastrationsresistent fænotype, er niveauerne af antioxidant proteiner øges og korrelere at erhverve kompetencer, såsom selvforsynende vækst, nedsat apoptose, vedvarende angiogenese, øget invasion og metastase samt kræftcelle resistens mod behandlingen [15 ] – [17]. I denne undersøgelse, bruger vi fire komplementære metoder til at identificere mediatorer for tumor undertrykke effekt af miR-17 *. Resultaterne viser, at suppression af mitochondriale antioxidant enzymer er en mekanisme til tumorsuppressorfunktion af MIR-17 *. Dette er den første rapport, der afslører forbindelsen mellem oxidativ stress og tumorsuppressoren rolle miRNA fremstillet af 3′-armen på MIR-17-92 klynge. Salg

Resultater

MIR-17 * undertrykker tre mitokondrier antioxidant proteiner

En række undersøgelser har rapporteret, at miR-17 er stærkt udtrykt i maligne tumorer, herunder PCa, men niveauet af sin partner, miR-17 *, er normalt lav i kræft [18 ]. Dette beviser forudsiger, at niveauerne af MIR-17 og MIR-17 * differentielt reguleret, og at forholdet mellem de to miRNA kan være vigtige for regulering af forskellige sæt af målgener under tumorigenese. Udtrykkene for begge miRNA i forskellige prostataceller, herunder normal epitel, stromal, virale transformerede, androgen-responsiv og androgen-uafhængige PCA-celler, blev kvantificeret ved real-time RT-PCR. Niveauet af MIR-17, og forholdet mellem MIR-17 til MIR-17 * i PCA-celler var højere end niveauer i ikke-cancerceller (fig. 1a). Ved at søge miRBase, fandt vi, at MnSOD, Gpx2 og TrxR2, tre vigtige mitokondrielle antioxidant proteiner, der er afgørende for afgiftning af O

2

.- og H

2O

2, er potentielle mål for miR -17 *. For at bekræfte at MIR-17 * er i stand til at undertrykke antioxidant proteiner, modne MIR-17 * blev transficeret i PC-3-celler, som har et lavt niveau af endogen MIR-17 *. Ekspressionen af ​​de tre antioxidant proteiner blev reduceret med den transficerede MIR-17 * på en dosis-afhængig måde. Henviser transfektion af kontrol- miRNA og antisense MIR-17 * havde ingen virkning på de mål (fig. 1B), oxidative stress stimuli, såsom cytokiner er i stand til at inducere ekspressionen af ​​

SOD2

gen gennem aktivering af NF -κB signalvejen [19]. Transfektion af MIR-17 * signifikant undertrykt TNFa-induceret

SOD2

ekspression i en dosisafhængig måde (fig. 1C). For at bekræfte, at reduktionen af ​​antioxidant proteiner ved MIR-17 * medieres gennem translationel undertrykkelse, blev 3′- utranslaterede regioner, herunder den formodede MIR-17 * målretning lokaliteter af generne, der koder for de tre antioxidant enzymer, klonet nedstrøms for reportergen. Et køretøj og en MIR-377 målretning lokaliseret i 3′-utranslaterede region af

SOD1

gen blev inkluderet som vehikelkontrol og non-selv negativ kontrol. Som vist i fig. 1D, det klonede MIR-17 * targetingsekvenser er nødvendige for undertrykkelsen af ​​reporter responser ved transficerede MIR-17 *.

A, niveauerne af MIR-17 og MIR-17 * udtrykt i PCa og kontrolcelle linjer blev målt ved RT-PCR. Forholdet mellem MIR-17 til MIR-17 * i hver cellelinie er præsenteret. B og C, transfektion af MIR-17 * i PC-3-celler til at validere sin funktion i at undertrykke ekspressionen af ​​antioxidant proteiner og faldende TNF-medieret MnSOD induktion. D, undertrykkende virkning af MIR-17 * på de antioxiderende proteiner anslås ved kvantitativ luciferase reporter assay. RNU24 og β-actin blev anvendt som interne kontroller for at normalisere miRNA niveauer (A), proteinniveauer (B og C). Billeder blev normaliseret med de interne kontroller og derefter normaliseret ved Prec (A), ved kontrol miRNA (B), og på ingen TNF behandling (C). β-gal-aktivitet blev anvendt til at normalisere luciferasereporteren aktiviteter (D). Tre prøver (n = 3) blev anvendt i eksperimenterne og fold ændringer i Western blots er vist. * (P 0,05) og ** (p 0,01) indikerer betydninger sammenlignet med kontrollerne: Prec (A), kontrol miRNA (B) og (D), og ubehandlede prøver (C)

.

DSF inducerer mIR-17 * ekspression

DSF er en dithiolcarbomate stof, der har vist sig at undertrykke cancerøse fænotyper ved at inducere apoptotiske vej [20]. Vi fandt, at DSF inhiberer de tre antioxidant proteiner i PCA-celler. Efter PC-3 og DU-145-celler blev behandlet med DSF i 24 timer, reduktionen af ​​niveauerne af antioxidanten proteiner svarede signifikant med koncentrationerne af DSF (fig. 2A). Imidlertid blev mRNA-niveauer af antioxidant gener ikke ændret i DSF-behandlede celler (fig. 2B). Interessant, RT-PCR og Northern blots viser, at DSF inducerer MIR-17 *, men har ingen effekt på ekspressionsniveauer af MIR-17 (fig. 2C). Induktion af miR-17 * af DSF bekræftes endvidere af reporter reaktioner, der er reguleret af miR-17 * targeting sekvenser (fig. 2D). Endvidere at verificere, at den negative virkning af DSF på ekspressionen af ​​antioxidant proteiner er medieret af induktion af MIR-17 *, blev PC-3-celler transficeret med antisense HSA-MIR-17 * efterfulgt af DSF behandling. Resultaterne viser, at antisense HSA-MIR-17 * er i stand til at reducere DSF virkning (fig. 2E). Disse resultater antyder, at reduktionen af ​​antioxidant proteiner af DSF forekommer, i det mindste delvis gennem MIR-17 * medieret translationel undertrykkelse.

A, PCA-celler blev behandlet med DSF ved angivne koncentrationer. Niveauerne af de tre antioxidant proteiner blev målt ved Western blotting. B, mRNA-niveauer i de tre antioxidant gener blev kvantificeret ved RT-PCR. C, niveauerne af MIR-17 og MIR-17 * i DSF-behandlede celler blev kvantificeret ved RT-PCR. MIR-17 * niveauer blev bekræftet ved Northern blots. D, virkningen af ​​DSF-induceret MIR-17 * på reporter-responser blev bestemt. E, efter transficeret anti-MIR-17 *, PC-3-celler blev behandlet med DSF. Virkningen af ​​anti-MIR-17 * på at genoprette antioxidant proteiner blev kvantificeret ved Western blots. β-actin blev anvendt til at normalisere niveauet af proteiner (A), (E), og niveauet for mRNA (B). De fold ændringer er angivet. RNU24 blev anvendt til at normalisere niveauet af MIR-17 og MIR-17 * (C). β-gal-aktivitet blev anvendt til at normalisere luciferasereporteren aktiviteter (D). Tre prøver (n = 3) blev anvendt i eksperimenterne (med undtagelse af Northern blot). * (P 0,05) og ** (p 0,01) indikerer betydninger sammenlignet med ingen DSF behandling (A), (C), (D), og sammenlignet med ingen DSF og ingen miRNA transficerede prøver (E)

miR-17 * inducerer celledød i PCA celler

for at bestemme DSF toksicitet til PCA celler blev PC-3 og DU-145 celler behandlet med DSF og dyrket indtil dannede kolonier. Fordi celledensiteten anvendes til kolonidannelse analyse var 100 gange mindre end densiteten i fig. 2 blev koncentrationsområde på DSF reduceret 100 gange i kolonidannelse eksperimenter. Resultaterne af overlevelse fraktion indikerer, at PCA celler er ekstremt følsomme over for DSF. Mere end 95% af cellerne blev dræbt ved behandling med 1 uM DSF (fig. 3A). For at kontrollere, om miR-17 * bidrager til DSF-medieret celledød, blev PC-3-celler transficeret med miR-17 *, og anti-miR-17 * før DSF behandling. Kolonioverlevelse analyse viser, at MIR-17 * forøger toksiciteten af ​​DSF, hvorimod anti-MIR-17 * er i stand til at redde celler fra DSF virkning (fig. 3B). For yderligere at bekræfte, at reduktionen af ​​antioxidant proteiner er en væsentlig årsag til toksiciteten af ​​MIR-17 *, PC-3-celler blev co-transficeret med MIR-17 * og cDNA’er ektopisk udtrykker de tre antioxidant proteiner, der ikke er modtagelige for miR- 17 * regulering. Cytotoksicitet analyse ved trypan blå-udelukkelse assay viser, at ekspression af de tre antioxidant gener redder celleoverlevelse fra toksiciteten af ​​MIR-17 * (fig. 3C). De tilsvarende niveauer af antioxidant proteiner i de transficerede PC-3-celler blev verificeret ved Western blots (Fig. 3D).

A, blev PSA-celler behandlet med DSF i de angivne koncentrationer for kolonioverlevelse analyse. De dannede kolonier blev talt og afbildet i en logaritmisk skala. B blev PC-3-celler transficeret med MIR-17 * og kontrol miRNA forud for DSF behandling. Virkningerne af miR-17 * og antisense miR-17 * på koloni overlevelse blev bestemt. C og D, MIR-17 * blev co-transficeret med konstruktioner til ekspression af de tre antioxidant proteiner. De overudtrykte antioxidant proteiner blev bekræftet ved Western blots med β-actin normalisering og fold ændringer er angivet (D). Beskyttende virkninger af de transficerede antioxidantenzymer på cellerne mod MIR-17 * toksicitet blev bestemt ved en trypanblåt udelukkelse assay (C). Tre prøver (n = 3) blev anvendt i eksperimenterne. * (P 0,05) og ** (p 0,01) indikerer betydninger i forhold til at styre miRNA prøver (B) og sammenlignet med køretøjer kontrolprøver (C), (D)

miR-. 17 * undertrykker tumorigeniciteten af ​​PCa

for at bestemme virkningen af ​​mIR-17 * på tumorvækst blev sekvensen af ​​modent mIR-17 * klonet ind i en Tet-on baseret lentiviral ekspressionsvektor. Lentivirus udtrykker MIR-17 * blev transduceret ind i PC-3-celler, og en stabil cellelinie med Tet-on baseret RFP-ekspression blev identificeret. Virkningen af ​​MIR-17 * på de tre antioxidant proteiner under Tet-on inducerbare betingelser blev bekræftet ved Western blots (fig. 4A). En mus xenograft tumor model blev anvendt til at vurdere virkningen af ​​MIR-17 * på tumorvækst. Da klonen blev subkutant injiceret i nøgne hanmus, ekspression af MIR-17 *

in vivo

blev induceret ved indgivelse Dox indeholdende vand. En kontrol køretøj blev inkluderet til at styre den toksiske effekt af Dox. Som vist i fig. 4B, den gennemsnitlige tid for tumorer til at nå 500 mm

3 i kontrolgruppen bilen og miR-17 * uden Dox kontrolgrupper er 12 til 13 dage (køretøj kontrol uden Dox, 12,2 ± 2,1; køretøj kontrol med Dox, 12,3 ± 2,8, og mIR-17 * uden Dox, 12,6 ± 2,8). Navnlig til antallet af dage til MIR-17 * med Dox gruppe når 500 mm

3 tumorstørrelse er 24 ± 4,9, hvilket er dobbelt så lang som kontrolgrupperne. Kontinuerligt at måle tumorvækst blev mus i kontrolgrupperne holdt i 18 dage efter injektion, når tumorstørrelsen nåede den maksimalt tilladte størrelse på 2000 mm

3. De tumorvæksthastigheder vist i fig. 4C viser, at tumorvækst i MIR-17 * med Dox-gruppen var signifikant forsinket sammenlignet med tumorvækst i kontrolgrupperne. For at kontrollere, om ekspressionen af ​​miR-17 * resulterer i reducerede antioxidant proteiner i miR-17 * udtrykte tumorvæv, niveauerne af miR-17 *, og aktiviteterne i de antioxidant enzymer i tumorvæv blev kvantificeret. Svarende til de forøgede niveauer af MIR-17 * i Dox-behandlede gruppe blev aktiviteterne i de tre antioxidantenzymer signifikant reduceret sammenlignet med den ubehandlede gruppe (fig. 4D). Taget sammen viser disse resultater, at ekspressionen af ​​MIR-17 * i PC-3 cell reducerer tumorigenicitet, i det mindste delvist, ved at hæmme mitochondrial antioxidant funktion. Dette resultat antyder, at i modsætning til den onkogene effekt af MIR-17, MIR-17 * spiller en tumor undertrykkende rolle i PCA-celler.

A, har-MIR-17 * blev klonet i en Tet-on lentiviral vektor og stabilt transekteret i PC-3-celler. Klonen blev testet ved RFP screening under Dox- induktive betingelser og derefter bekræftet ved måling af ekspression af de tre målgener anvendelse af Western blots med β-actin normalisering. B og C, det dannede klon blev injiceret i mandlige nøgne mus for at bestemme dens tumorigenicitet. Kontrol køretøjet var inkluderet. Det antal dage, der er nødvendige for tumorstørrelse at nå 500 mm

3 er vist i (B) og beregnede tumor vækstrater i (C). D, total RNA og proteiner blev isoleret fra tumorvæv og niveauet af MIR-17 * og tilsvarende aktiviteter af de tre antioxidant proteiner blev kvantificeret. Tre prøver (n = 3) blev anvendt ved test af den genererede MIR-17 * inducerbar klon (A). Ni køretøj kontroldyr (n = 9) med eller uden DOX behandling og atten MIR-17 * udtrykt dyr (n = 18) med eller uden DOX behandling blev anvendt til at teste virkningen af ​​MIR-17 * på tumorvækst (B), (C), (D). * (P 0,05) og ** (p 0,01) indikerer betydninger i forhold til uden DOX kontrol (A) og (C)

Diskussion

miRNA generelt fungerer som. en posttranskriptionel repressor, som menes at være en vigtig mekanisme for genregulering. miRNA biogenese omfatter kanonisk primære miRNA transskription, drosha /dicer-medierede spaltninger, og streng fortrinsret udvælgelsen via Argonaute (siden) proteiner [21]. Når én streng er valgt til undertrykkelse af mål, er dens anden kæde formodes at blive nedbrudt [22]. Imidlertid har nyere undersøgelser påvist både miR-17 og miR-17 * i mange typer af humane væv [23]. I alle testede cellelinier, vores resultater viser, at MIR-17 * er til stede på et lavere niveau end MIR-17. Men niveauet af begge miRNA er højere i PCA-celler end i kontrolcellerne (data ikke vist). Da graden af ​​MIR-17 er højere end MIR-17 * er forholdet mellem MIR-17 til MIR-17 * i PCA-celler forøges, hvilket antyder, at MIR-17 er et fortrinsvis valgt streng, selvom både MIR-17 og miR -17 * forstadier transkriberes. Nyere undersøgelser har vist, at AGO1 medierer miRNA produktion i Drosophila, mens AGO2 er associeret med miRNA * produktion [24]. Men brug den præcise mekanisme, hvormed AGO regulerer miRNA biogenese, der skal fastlægges for at afdække fortrinsret ophobning af miRNA-strenge under forskellige betingelser.

Vores data viser, at miR-17 * undertrykker tumorgenicitet af PCA celler, hvilket tyder på, at funktionen af mIR-17 * er modsat den onkogene funktion af mIR-17. Ekspression af MIR-17-92 klynge reguleres stramt som reaktion på intercellulære og ekstracellulære miljøer. Transkription af denne klynge opreguleres af c-Myc under oxidative betingelser [25] og nedreguleres af p53 under hypoksi betingelser [26]. Interessant, DSF, en dithiolcarbomate, inducerer kun niveauet af MIR-17 * og ikke MIR-17. Denne selektive induktion er i overensstemmelse med tumor undertrykkende effekt af miR-17 *, og er i overensstemmelse med en forudgående konstatering DSF inducerer apoptose i cancerceller [20]. Tilsammen disse resultater tyder på, at DSF kan være effektivt som et middel mod cancer, dels ved induktion af miR-17 *.

miRNA-baserede gen undertrykkelse anses for at være en afgørende regulator styrer celle skæbne. Det er imidlertid et kompliceret reguleringssystem, fordi ét gen kan reguleres af flere miRNA og én miRNA har mange forskellige mål. Generelt virkningen af ​​miRNA på genregulering er afhængig af specifikke vævstyper, udvikling tilstande eller stimuli. Således identifikation af miRNA mål er afgørende for at definere de reelle funktioner i miRNA under fysiologiske eller patologiske tilstande. Vores undersøgelse viser, at MIR-17 * er en negativ regulator for tre vigtige antioxidant enzymer placeret i mitokondrier. Disse antioxidant enzymer er vigtige komponenter i den primære antioxidant system, og de arbejder i koncert for sikkert at fjerne ROS genereret i mitokondrier. Inhibering af disse proteiner bør føre derfor til en akkumulering af ROS, hvilket resulterer i cytotoksicitet. Vores resultater tyder på en ny behandlingsmetode at øge celledød ved miR-17 * målretning. Desuden er en nylig undersøgelse viste, at MIR-17 er i stand til at lukke munden HIF-1α ekspression, en transkriptionsfaktor til vedligeholdelse af redox homeostase og celleoverlevelse under hypoxiske betingelser [27]. Samlet set viser disse resultater forudsiger, at forholdet mellem MIR-17 til MIR-17 * kan have en vigtig rolle i reguleringen af ​​cellulær redox-status.

Selvom Warburg virkning, en høj grad af aerob glycolyse i tumorer, er blevet observeret i forskellige typer af kræft, kræft har funktionel mitokondrier og mitokondrier respiration er nødvendig for kræft celledeling [28]. Endvidere cancerceller har høje niveauer af ROS og også udtrykke høje niveauer af antioxidant proteiner til at afgifte de forhøjede satser af ROS-generering [29]. For eksempel er MnSOD udtrykt på et højt niveau i aggressive PCA-celler, hvilket er vigtigt for beskyttelse af PCA celler mod strålingsinduceret ROS [30]. Således udløser pro-apoptotiske signalveje ved at målrette mitokondrier antioxidant enzymer kan også betragtes som en anti-cancer terapeutisk strategi. Vores resultater, som viser, at miR-17 * hæmning af mitokondrie antioxidant proteiner undertrykker tumorgenicitet af PCA celler in vivo, give eksperimentelle beviser for proof-of-concept, at miRNA * kan fungere som en tumor suppressor ved hæmning af mitokondrie forsvar kapacitet.

Materialer og metoder

Cell kultur og celle toksicitet analyse

Prec, menneskelige prostata epitel primære celler (Cambrex Corp.), og PRSC, menneskelige prostata stromale celler (Clonetics), blev dyrket i PrEBM medium (Lonza). PZ-HPV-7, HPV-18 transformerede humane prostata epitelceller (American Type Culture Collection, ATCC) blev dyrket i keratinocyt-SFM-medium (Invitrogen). Humane epitelial carcinoma celler LNCaP, DU-145 og adenocarcinom PC-3-celler (ATCC) blev dyrket i RPMI-medium (Invitrogen) indeholdende 10% FCS (Hyclone). Kolonidannelse assay blev anvendt til at kvantificere toksiciteten af ​​MIR-17 * til PCA celler udpladet i 6-brønds plader ved lave densiteter. For at inducere MIR-17 * ekspression blev PCA-celler behandlet med DSF i en koncentration på 0 til 1 um i 24 timer. Kolonierne blev vasket med 1 x PBS og farvet med et krystalviolet farvestof. Den overlevende fraktion blev beregnet som forholdet mellem antallet af dannede kolonier til antallet af celler effektivt udpladet. Trypan blå-udelukkelse blev anvendt til at bestemme de beskyttende virkninger af øget antioxidantenzymer toksikologiske MIR-17 *. Cellerne blev co-transficeret med MIR-17 * og ekspressionskonstruktioner af de tre antioxidant gener. Efter dyrkning i 48 timer blev de transficerede celler farvet med en 0,4% trypanblåt og talt under anvendelse af en levedygtighed Vi-Cell celle analysator (Beckman Coulter).

Micro RNA-ekspression reporter assay

for at teste om miR-17 * regulerer ekspressionen af ​​target gener, blev 3′-utranslaterede regioner af de målgener indeholder formodede miR-17 * bindingssteder klonet mellem

Sac

i og

Hind

III-stederne i pMIR-reporter vektoren (Ambion). De genererede miRNA ekspressions reporterkonstruktioner blev co-transficeret med β-gal intern kontrol vektor (Ambion) i PC-3-celler ved anvendelse af lipofectamin (Invitrogen). Efter dyrkning i 36 timer blev cellerne høstet; luciferaseaktiviteten blev målt ved anvendelse af et luciferase-assay kit (Promega); og β-gal-aktivitet blev målt ved anvendelse chlorphenol-rød-a-D-glactopyranoside mononatrium substrat (Roche Molecular Biochemicals). Relative luciferase reaktioner blev estimeret ved β-gal-normaliseret luciferaseaktivitet.

Angivelse af miR-17 *

For at øge miR-17 * niveau i PCA celler, MIR-17 * molekyler og kontroller (Ambion) blev transficeret i cellerne under anvendelse oligofectamine (Invitrogen). For at inducere MIR-17 * ekspression i PCA-celler, blev cellerne behandlet med disulfiram (Sigma) i en koncentration på 0 til 100 uM i 24 timer. Til stabilt udtrykker MIR-17 * i PCA-celler, blev en moden MIR-17 * sekvens udspændt af drosha og Dicer spaltningssteder klonet ind i en Tet-on inducerbar lentiviral vektor, TRIPZ (Open Biosystems) under anvendelse af Xhol og EcoRI sites. Sekvens af insert indeholdende MIR-17 * (vist med understregning) er CTCGAGTGCTGTTGACAGTGAGCGAACTGCAGTGAAGGCACTTGTAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTACAAGTGCCTTCACTGCAGTCTGCCTACTGCCTCGGAGAATTC. Det klonede MIR-17 * blev pakket under anvendelse af et translentiviral emballeringssystem (Open Biosystems). MIR-17 * lentivirus blev koncentreret og titreret før transduktion ind i cellerne under 2 ug /ml puromycin selektive betingelser. MIR-17 * klon blev yderligere udvalgt af Tet-on inducerbar ekspression af et rødt fluorescensprotein (RFP) tag ved hjælp medier indeholdende 1 ug /ml doxycyclin (Dox). Den stabile klon blev verificeret ved screening af ekspressionen af ​​målene ved hjælp Western blotting.

Angivelse af antioxidant enzymer

For at redde celle overlevelse fra toksiciteten af ​​miR-17 *, cDNA konstruktioner til ekspression af de tre antioxidant proteiner blev transficeret ind PC-3 celler før DSF behandling. De ektopisk udtrykte antioxidant proteiner påvirkes ikke af har-miR-17 *, fordi cDNA-konstruktioner ikke har de 3′-untranslational regioner, hvor de bindende steder er identificeret for har-miR-17 * binding.

dyr

Fire uger gammel mand NCRNU (nu /nu atymiske nøgne) mus blev fremskaffet fra Taconic (Hudson, NY). 10

6 celler blandet med Matrigel (BD Biosciences) blev injiceret i den højre flanke af musene. De injicerede mus blev adskilt i to grupper: to dage før injektion, én gruppe mus begyndte at drikke vand, der indeholder 2 mg /l doxycyclin og kontrolgruppen fortsatte med at drikke almindeligt vand. Tumorvolumener blev beregnet ved hjælp af en standard formel (A × B

2 × 0,52, A og B repræsenterer diagonal tumor længder)

Western blots

Proteiner blev ekstraheret fra dyrkede celler. og tumorvæv som beskrevet tidligere (11) og 100 ug af ekstraherede proteiner blev underkastet elektroforese på en 8% (vægt /volumen) SDS-PAGE-gel, overført til en nitrocellulosemembran, og efterfølgende inkuberet med primære antistoffer mod MnSOD (Upstate Biotech.) , Gpx2 (Abcam), TrxR2 og β-actin (Santa Cruz Biotech). Western blots blev visualiseret under anvendelse af et forøget kemiluminescens påvisningssystem (ECL, Amersham Pharmacia Biotech.).

Real-time PCR (RT-PCR)

At berige miRNA i RNA-fremstilling, totalt RNA isoleret fra de dyrkede celler og tumorvæv under anvendelse af en Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion). For kvantificering af miR-17 og miR-17 *, blev RNA analyseret ved hjælp af en TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit med interne kontroller RNU6B, RNU24 og RNU48 (Applied Biosystems). For at kvantificere mRNA niveauer på MIR-17 * målgener blev RNA’et analyseret ved anvendelse TaqMan revers transkription Reagenser (Applied Biosystems) og RT-PCR med den universelle ProbeLibrary Set (Roche Applied Science). RT-PCR blev udført i et TaqMan Universal PCR Master Mix anvendelse af en LightCycler 480 Real-Time PCR System (Roche Applied Science).

Northern blots Salg

Niveauet af MIR-17 * blev kvantificeret ved hjælp af en miRtect-IT miRNA Mærkning og Detection kit (USB Corp.) i overensstemmelse med producentens protokol.

Enzymaktivitet assay

MnSOD aktiviteter blev målt ved nitroblue tetrazolium (NBT) -bathocuproin sulfonat (BCS) reduktion hæmning metode. Natriumcyanid (2 mM) blev anvendt til at inhibere Cu /ZnSOD aktivitet [31]. GPX-aktivitet blev målt ved anvendelse af en reaktionsblanding bestående af 0,2 mM H

2O

2, 1,0 mM GSH, 0,14 U glutathion reduktase (GR), 1,5 mM NADPH, 1,0 mM natriumazid, og 0,1 M phosphatbuffer (pH 7,4) og 1 mg /ml supernatant protein [32]. TrxR aktivitet blev målt ved anvendelse Thioredoxin reduktaseaktivitet Assay Kit (Redoxica) i overensstemmelse med producentens protokol.

Statistiske dataanalyser

Flere uafhængige forsøg blev udført for hvert sæt data. Billeder i Northern blots og Western blots blev kvantificeret ved hjælp Carestream Molecular Imaging software (Carestream Health Inc.). Statistisk signifikans blev analyseret ved hjælp af en envejs ANOVA og Tukeys multiple sammenligningstest, efterfulgt af dataanalyse med Graphpad Prism.