PLoS ONE: TGF-β Blokade Reducerer Dødelighed og metaboliske ændringer i valideret murin model af kræft i bugspytkirtlen Kakeksi

abstrakt

Cancer kakeksi er en invaliderende tilstand karakteriseret ved en kombination af anoreksi, muskelsvind, vægttab, og underernæring. Denne betingelse påvirker et overvældende flertal af patienter med kræft i bugspytkirtlen og er en primær årsag til kræft-relaterede dødsfald. Der eksisterer imidlertid få, om nogen, effektive terapier til både behandling og forebyggelse af dette syndrom. For at udvikle nye terapeutiske strategier for pancreascancer kakeksi, er nødvendige egnede dyremodeller. I denne undersøgelse har vi udviklet og valideret en syngen, metastatisk, murine model af kræft i bugspytkirtlen kakeksi. Ved hjælp af vores model, undersøgte vi evnen af ​​transformerende vækstfaktor beta (TGF-β) blokade at afbøde de metaboliske ændringer forbundet med kakeksi. Vi fandt, at TGF-β inhibering under anvendelse af anti-TGF-β-antistof 1D11.16.8 signifikant forbedret samlet dødelighed, vægttab, fedtmasse, mager kropsmasse, knogletæthed, og skeletmuskulatur proteolyse hos mus, der huser fremskreden pancreascancer. Andre immunterapeutiske strategier vi ansat var ikke effektive. Kollektivt, vi valideret en forenklet, men nyttig model af pancreascancer kakeksi at undersøge immunologiske behandlingsstrategier. Desuden viste vi, at TGF-β-hæmning kan reducere de metaboliske ændringer i forbindelse med kræft kakeksi og forbedre den samlede overlevelse

Henvisning:. Greco SH, Tomkötter L, Vahle AK, Rokosh R, Avanzi A, Mahmood SK, et al. (2015) TGF-β Blokade Reducerer Dødelighed og metaboliske ændringer i valideret murin model af kræft i bugspytkirtlen Kakeksi. PLoS ONE 10 (7): e0132786. doi: 10,1371 /journal.pone.0132786

Redaktør: Ajay Pratap Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, UNITED STATES

Modtaget: November 21, 2014 Accepteret: 18 juni 2015; Udgivet: Juli 14, 2015

Copyright: © 2015 Greco et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet i dele af tilskud fra America Lever og galdeveje pancreas Association (SHG), den tyske Research Foundation (LT), Statens Institut for Sundhed Awards CA155649 (GM), og CA168611 (GM), og tysk Cancer Aid (AKV)

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDA) er en aggressiv gastrointestinal cancer, med en fem-års overlevelse på mindre end 5 [1]%. Størstedelen af ​​patienter med PDA stede med fremskreden metastatisk sygdom og har en median overlevelse på kun 3-6 måneder [2, 3]. Dødelighed og dårlig livskvalitet hos disse patienter er relateret til de betydelige metaboliske og ernæringsmæssige forstyrrelser, der er forbundet med kræft kakeksi syndrom. Dette syndrom er til stede i op til 80% af PDA patienterne og tegner sig for op til 22% af alle kræftrelaterede dødsfald [4-6].

Et fremtrædende træk ved kakeksi er udviklingen af ​​utilsigtet vægttab på mindst 5% af kropsmasse [7]. Den samtidige tab af både magre kropsmasse og fedtmasse adskiller kakeksi af sult, hvori lean muskelmasse indledningsvis bevaret. Kræft kakeksi omfatter et væld af metaboliske forstyrrelser, herunder øget energi stofskifte-herunder ændringer i protein, fedt og glukosemetabolismen-og immunosuppression med øget frigivelse af pro-inflammatoriske cytokiner og akut fase proteiner [6]. Desuden neurokognitive effekter af kakeksi omfatter træthed, svækket hukommelse og erkendelse og nedsat fysisk aktivitet sekundært til øgede udgifter hvilende energi [8, 9]. Kollektivt, disse derangements reducerer livskvaliteten i kakektiske patienter og kan endda bidrage til en nedsat terapeutisk respons på kemoterapi [10].

Desværre er der få evidensbaserede strategier effektive behandlingsmuligheder for kræft kakeksi. Fordi denne sygdom proces omfatter en række forskellige værts ubalancer, bør effektive behandlinger ideelt målrette mod flere metaboliske veje. Kakeksi er blevet behandlet med anvendelse af progestiner, såsom megestrolacetat og medroxyprogesteronacetat at øge appetit og vægtforøgelse sammen med kortikosteroider for at forbedre stemningen og reducere inflammation [11, 12]. Imidlertid har de kliniske fordele ved disse behandlinger været marginal [11, 13]. Andre potentielle terapeutiske midler der er blevet undersøgt omfatter cyclooxygenase (COX-2) inhibitorer og forsøgslægemidler herunder ghrelin og ghrelin mimetika, kombineret tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) og interleukin 6 (IL-6) inhibitorer, samt β- adrenoceptoragonister og myostatin hæmmere [6]. Imidlertid har effektive kliniske resultater i kræft kakeksi patienter været undvigende.

Validerede dyremodeller af kræft i bugspytkirtlen kakeksi er nødvendige for at udvikle effektive immunterapi-baserede behandlingsstrategier. Cachexia-inducerende cellelinier, såsom Lewis lungecarcinom (LLC) og kolorektale tumorer blevet anvendt bredt i dyremodeller af cancer kakeksi [4, 14]. Disse tumorlinier implanteres subkutant i forsøgsdyr og får lov at vokse, indtil symptomer på kakeksi opnås. Sådanne heterotopiske modeller har også været anvendt i at studere kakeksi i PDA [15, 16]. Men en primære begrænsning af disse modeller er deres manglende evne til at metastasere [17]. Xenograftmodeller af human PDA, hvori humane PDA cellelinjer implanteres i athymiske eller immunsupprimerede mus er også blevet anvendt [17]. Selv xenograftmodeller effektivt efterligner tumor /vært epigenetik og kan metastaserer, de markant ændrer immunologiske miljø og dermed hindre evnen til at studere de immunologiske ændringer i forbindelse med kakeksi samt og eventuelle immunterapeutiske strategier [17, 18].

Potentielle immunologiske mål for cachexia behandling i PDA, omfatter Toll-lignende receptorer (TLRs) og transformerende vækstfaktor beta (TGF-β). Toll-lignende receptorer er en familie af mønstergenkendelse receptorer på medfødte immunceller, som direkte forbinder miljømæssige stimuli til medfødte inflammatoriske reaktioner [19]. TLRs kan aktiveres ved at ligere ikke-patogene “fare molekyler”, kendt som dæmper, herunder biprodukter fra inflammatorisk skade og cellulære nekrose [20, 21]. TLRs har været impliceret at spille en betydelig rolle i PDA, som vores laboratorium for nylig har vist, at TLR7 ligering accelererer pancreas carcinogenese og at TLR7 blokade beskyttet mod tumorudvikling [22]. Derudover har TLR9 stimulering blevet korreleret med den invasive og metastatiske potentiale af human PDA, derved implicerer denne receptor som potentielt mål ved behandling af denne sygdom [23]. Men så vidt vi ved hverken TLR7 eller TLR9 er blevet undersøgt til behandling af pancreascancer kakeksi.

transformerende vækstfaktor beta (TGF-β) pathway spiller en vigtig rolle i celledifferentiering og inflammation [24]. TGF-β-receptor-aktivering fører til phosphorylering af Smad proteiner, herunder Smad2, Smad3, og Smad4, som igen regulerer transkriptionen af ​​cellecyklusinhibitorer, herunder p21 [25]. I PDA, er TGF-β paradoksalt nok blevet vist at virke som både en tumorsuppressor og tumor promotor [26]. TGF-β kan hæmme proliferation, undertrykke transformation, og mindske PDA progression [27]. Men samtidig TGF-β-blokade kan reducere invasivitet af PDA [28]. Ikke desto mindre har mutationer i nedstrøms mediatorer af TGF-β-signalering, herunder Smad4 vist sig at fremme PDA progression [29]. Yderligere, selv om TGF-β er blevet impliceret at fremme cancer kakeksi [30, 31], så vidt vi ved, TGF-β-blokade er ikke blevet undersøgt som en terapeutisk strategi til behandling af pancreascancer kakeksi. Formålet med dette studie var at udvikle en syngen metastatisk model af kræft i bugspytkirtlen kakeksi og undersøge immunterapeutiske behandlingsstrategier, herunder TLR 7/9 blokade og TGF-β blokade.

Materialer og metoder

dyr, cellelinjer, og in vivo forsøg

Male C57BL /6 (H-2k

b) og Toll-lignende receptor 9 knockout (TLR9 ​​

– /-) mus blev fremskaffet fra Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Pdx1

Cre; Kras

LSL-G12D, TP53

R172H (KPC) mus var en gave fra Mark Phillips (New York University) [32]. Dyr blev opdrættet i huset og aldersmatchede 6-8 uger gamle mus blev anvendt til alle forsøg. Den Pan02 murine PDA cellelinje (gave fra Daniel Meruelo, New York University), som er syngene til C57BL /6, blev dyrket i komplet RPMI dyrkningsmedium suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin. FC1242 PDA tumorceller afledt fra KPC-mus var en gave fra David Tuveson (Cold Spring Harbor Laboratory). Mus blev injiceret i.p. med enten 10 millioner Pan02 eller 5 millioner FC1242 celler til at inducere cancer kakeksi syndrom. Udvalgte kohorter blev yderligere administreret 2,6 mg /kg af Toll-lignende receptor 7 og 9 (TLR7 /9) -hæmmer IRS 954 (Dynavax, Berkeley, CA), tre gange ugentligt, eller 200 ug transformerende vækstfaktor beta (TGF-β) inhibitor (klon 1D11.16.8, hæmmer TGF β

1, β

2, og β

3) (Bioxcell, West Lebanon, NH) to gange ugentligt, begynder umiddelbart efter podning med Pan02 og fortsætter i den forsøgets varighed. Dyr blev overvåget to gange dagligt. Musene blev aflivet med CO2 narkose efterfulgt af cervikal dislokation ved afslutningen af ​​undersøgelsen frist på 60 dage, eller tidligere, hvis de optrådte døende eller udstillet mere end 20% vægttab. For at inducere subkutan tumorvækst blev mus injiceret i den højre flanke med 10 millioner Pan02 celler. Tumorvækst blev målt ved anvendelse af en skydelære to gange ugentligt. Niveauer af cytokiner i serum blev bestemt under anvendelse af et cytometrisk bead array (BD Biosciences). The New York University School of Medicine IACUC godkendt alle procedurer

Måling af vægt og kropssammensætning

Vægt og kropssammensætning herunder:. Fedtmasse, lean masse,% kropsfedt, knoglemineralindhold, og knoglemineraltæthed blev målt ugentligt bruger DXA-skanning (DEXA) med Lunar PIXImus (PIXImus, Fitchburg, WI) enhed til små dyr. Alle mus blev bedøvet før DEXA dataindsamling anvendelse af 0,1 mg /g ketamin og 0,01 mg /g xylazin ved i.p. indsprøjtning. Dataene blev analyseret ved hjælp af Lunar PIXImus softwareversion 1.45. Arm omkreds blev beregnet som 3,14 gange den øvre arm diameter, som målt ved anvendelse af en skydelære med nøjagtighed ± 0,1 mm. Subscapular skinfold tykkelse blev også målt under anvendelse af en skydelære.

Western blotting og immunhistokemi

Til Western blotting blev totalt protein isoleret fra mus quadriceps eller fedtvæv ved homogenisering i RIPA-buffer med komplet proteaseinhibitorcocktail og fosfatase-cocktail (Roche, Pleasanton, CA) [33]. Protein kvantificering blev bestemt ved Bradford-proteinassay, og prøver blev ligeledes fyldt på 10% polyacrylamidgeler (NuPAGE, Grand Island, NY), elektroforeret ved 200 V, elektrooverført til PVDF-membraner og probet med antistoffer mod Atrogin-1 (1: 500 ; ECM Biosciences, Versailles, KY), Myostatin (1: 200; Abcam, Cambridge, MA), MuRF1, ZAG (1: 500; begge Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX), p21 (1: 200; Santa Cruz), β-actin, Smad2, p-Smad2 /3 (1: 1000; alle Cell Signaling, Danvers, MA), TGF-β (1: 1000; Abcam), og Ezrin (1: 1000; BD Transduction Laboratories, San Jose, CA). Kvantificering blev udført ved at måle integreret tæthed og normalisere til lastning kontrol. Til immunohistokemisk analyse blev paraffinindlejrede vævssnit farvet ved anvendelse af polyklonalt anti-TGF-β (1: 100; Abcam, Cambridge, MA), anti-p21 (1: 100, Santa Cruz), eller anti-p-Smad 2/3 (1:50, Santa Cruz) og de tilsvarende isotypekontroller [33].

qPCR og cellulær proliferation assay

til PCR-analyse, totalt RNA blev isoleret ved anvendelse af RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD) og cDNA blev fremstillet under anvendelse af høj kapacitet Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Grand Island, NY). RT-PCR blev udført på en Stratagene Mx3005P QPCR System (Agilent Technologies) under anvendelse af præ-designet primere for muse MuRF1 og Atrogin-1 (begge Qiagen, Germantown, MD) [34]. In vitro tumorcelleproliferation blev vurderet ved anvendelse af XTT II assay ifølge producentens protokol (Cell Proliferation Kit II, Roche, Pleasanton, CA) og udtrykt som% proliferation sammenlignet med kontrol (100%). Salg

neurokognitiv Assays

for rotarodtesten, dyrene blev placeret på en stang (diameter 3,6 cm) apparat til at vurdere forskelle i motorik og balance ved at måle forben og bagben motorik og balance (roterende stav 7650 accelererende model, Ugo Basile, Varese , Italien), som vi tidligere har beskrevet [35]. Hvert dyr blev testet for tre sessioner, med hver session adskilt af 15 min, og der blev taget skridt til rotarod hastighed, når dyrene faldt fra toppen af ​​den roterende cylinder.

Testen spontan objekt genkendelse (ORT) var udføres i et firkantet åben mark boks, hævet 50 cm fra gulvet, som vi tidligere har beskrevet [35]. To nye genstande var placeret på diagonale hjørner på åben mark, og dyret fik lov til at udforske for 15 min. For en given retssag, objekterne i et par var 10 cm høj og er fremstillet af samme materiale, således at de ikke umiddelbart kan skelnes ved olfaktoriske signaler. Den tid udforske hvert objekt blev optaget af et sporingssystem (San Diego Instruments, San Diego, CA), og i slutningen af ​​uddannelsen fase musen blev fjernet fra kassen for varigheden af ​​forsinkelsen fastholdelse (3 timer). Under retentions-afprøvningerne blev dyrene sættes tilbage i samme boks, hvori en af ​​de tidligere kendte genstande, der anvendes under træning blev erstattet af en hidtil ukendt objekt, og fik lov til at udforske frit i 6 min. Et andet objekt par blev anvendt til hvert forsøg for en given dyr, og rækkefølgen af ​​eksponering til at gøre indsigelse par samt betegnet prøve og nye objekter for hvert par blev opvejet i og på tværs grupper. Den tid udforske nye og velkendte objekter blev registreret for 6 min. Objektet anerkendelse test indeks blev beregnet som forholdet mellem tid brugt udforske romanen objekt til den tid udforske både romanen og velkendte objekt.

Statistik

Data præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse . Overlevelse blev målt ifølge Kaplan-Meier-metoden. Statistisk signifikans blev bestemt ved den studerendes

t

test og log-rank test med GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, CA). P-værdier. 0,05 blev betragtet som signifikante

Resultater

Udvikling af en syngen model af avancerede bugspytkirtelkræft

Mus administreret Pan02 PDA celler ved ip injektion udviklet åbenlys peritoneal carcinomatose (fig 1A) med implantater på peritoneale overflader, herunder tyndtarmen mesenterium samt mikroskopiske levermetastaser (fig 1B) inden for tre uger efter behandlingen. Disse resultater korrelerer med avanceret PDA hos mennesker, som er associeret med lever- og /eller peritoneale metastaser i næsten alle tilfælde [36]. Ca. 75% af Pan02-behandlede dyr døde inden for 45 dage efter behandling (Fig 1C). Yderligere, i overensstemmelse med PDA cachexia syndrom, Pan02-behandlede mus udviste progressiv vægttab begynder ca. 2 uger efter tumorprovokation (fig 1D).

(A) Mus indgives Pan02 optrådt groft og (B) mikroskopisk bevis for peritoneal carcinomatose samt mikroskopiske liver implantater. Repræsentative billeder og summariske oplysninger vises. (C) Kaplan-Meier-analyse af overlevelse blev udført i PBS og Pan02 behandlede dyr (n = 20 /gruppe, p 0,05). (D) De gennemsnitlige legemsvægte af muse kohorter behandlet med PBS eller Pan02 blev beregnet på forskellige tidspunkter, som var den totale vægtændring i løbet af undersøgelsen (n = 20; * p 0,05, *** p 0,001) .

Dokumentation for ændret kropssammensætning

Klinisk bugspytkirtelkræft kakeksi er ikke blot forbundet med vægttab, men også med tab af fedt, muskler, og knogler indholdet [6, 37] . Derfor fandt vi, at Pan02-behandlede mus mistet næsten 1g i fedtmassen ved 24 dage (Fig 2A), og havde signifikant reduceret procent kropsfedt sammenlignet med kontrolmus (Fig 2B). Tumorbærende mus udviste også lavere muskelmassen (Fig 2C), og reducerede stigninger i både knoglemineralindhold (Fig 2D) og knoglemineraldensitet sammenlignet med kontrolmus (Fig 2e). For yderligere at kvantificere krop sammensætning ændringer, vi målte overarm omkreds (Fig 2F) og subscapular skinfold tykkelse (Fig 2G), og fandt både at være markant formindsket i Pan02-behandlede mus. Tilsammen disse resultater korrelerer med de metaboliske ændringer i forbindelse med den kliniske bugspytkirtelkræft kakeksi syndrom.

(A) Gennemsnitlig fedtmasse B) og gennemsnitlig procent kropsfedt af mus kohorter behandlet med PBS eller Pan02 blev beregnet på forskellige tidspunkter punkter samt samlede ændring i løbet af undersøgelsen. (C) Ændringer i lean masse, blev (D) knoglemineralindhold, (E) knoglemineraltæthed, (F) arm omkreds, og (G) skinfold tykkelse også beregnet (n = 20; * p 0,05, ** p 0,001)

Dokumentation for muskelatrofi og inflammatorisk forandring

Da proteolyse og muskelatrofi er kendetegnende for menneskelig bugspytkirtelkræft kakeksi [38], vi målte markører for muskelatrofi i både Pan02-behandlede mus og kontrol mus. Både atrogin-1 og Murf-1 er E3 ubiquitin ligaser udtrykt i skeletmuskulatur som målrette proteiner til proteolyse [39, 40] .Vi fundet øget intramuskulære niveauer af atrogin-1 (fig 3A) og Murf-1 (fig 3B) i tumor-bærende mus ved qPCR. Western blotting bekræftede disse resultater og derudover viste forhøjede muskulære ekspression af myostatin i behandlede dyr (fig 3C), der tyder på intramuskulær proteolyse [41]. Tilsvarende zink alpha-glycoprotein (ZAG), en markør for lipolyse, blev også markant forhøjet i fedtvæv af Pan02-behandlede mus (figur 3D). I overensstemmelse med et proteolytisk tilstand, quadriceps vægt var lavere i tumorbærende mus (Fig 3e). Patienter med fremskreden pancreascancer-kakeksi almindeligvis udviser forhøjede proinflammatoriske cytokiner, der er forbundet med dårlig overlevelse [42, 43]. I overensstemmelse hermed blev niveauer af MCP-1 og IL-6 forhøjede i serum fra tumorbærende værter (fig 3f).

(A) mRNA-niveauer af Atrogin-1 og (B) MuRF1 i quadriceps musklerne i mus behandlet med PBS eller Pan02 blev beregnet ved qPCR. (C) På lignende måde niveauerne af Atrogin-1, Myostatin, MuRF1, og β-actin i quadriceps-musklen blev beregnet ved Western blotting. (D) ZAG ekspression blev testet i visceralt fedtvæv fra kohorter af mus behandlet med enten PBS eller Pan02. (E) Vægt af quadriceps musklerne fra muse kohorter behandlet med PBS eller Pan02 blev beregnet. (F) Serumniveauer af MCP-1 og IL-6 blev sammenlignet i PBS og Pan02-behandlede mus (n = 5; * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001)

.

kombineret TLR7 /9 hæmning ikke afbøde kræft i bugspytkirtlen kakeksi

Vi har tidligere rapporteret, at Toll-lignende receptor (TLR) ligation accelererer bugspytkirtelkræft progression mens blokade af udvalgte TLR signalveje kan være beskyttende [ ,,,0],22, 44]. Derfor vi postulerede, at TLR inhibering kan være beskyttende mod kræft i bugspytkirtlen kakeksi. For at teste dette, blev mus behandlet med IRS 954, en kombination TLR7 /9 oligonucliotide inhibitor [45]. Som forventet, udvalgte serumcytokiner var lavere i IRS 954 behandlede mus (figur 4A). Men dyr behandlet med Pan02 + IRS 954 havde en lignende samlet overlevelse sammenlignet med mus behandlet med Pan02 alene (Fig 4B). Desuden var der ingen signifikante forskelle i akkumulerede tab vægt (Fig 4C), ændringer i muskelmassen (Fig 4D), fedtmasse (Fig 4E), arm omkreds og skinfold tykkelse (figur 4F), eller knoglemineraltæthed (Fig 4G ) mellem de behandlede og kontrolgrupperne. Men IRS 954-behandlede tumorbærende mus havde højere knoglemineralindhold end ubehandlede tumorbærende mus (Fig 4H). Genetisk sletning af TLR9 var ligeledes ineffektiv at lindre bugspytkirtelkræft kakeksi i Pan02-challanged dyr (S1 Fig). Tilsammen har vore forsøg anvender selektiv eller kombineret TLR inhibering ikke materielt forbedre eksperimentel pancreascancer kakeksi

(A) Mus blev behandlet med Pan02 eller Pan02 + IRS 954 og testet for serumcytokiner (n = 20;. * p 0,05) og (B) overlevelse ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden (n = 20; p = NS). (C) Tilsvarende mus blev behandlet med PBS, IRS 954, Pan02 eller Pan02 + IRS 954 og testet for samlede vægt forandring, og ændringer i (D) lean masse, (E) fedtmasse, (F) arm omkreds og skinfold tykkelse, (G) knoglemineraltæthed, (H) og knoglemineralindhold (n = 20 /gruppe; * p 0,05).

Behandling med TGF-β-inhibitor beskytter mod kræft i bugspytkirtlen kakeksi

TGF-β-superfamilien har en vigtig rolle i tumor immunrespons [46]. TGF β har også været impliceret i kakeksi ved at stimulere muskelnedbrydning og proteolyse [47]. Imidlertid har målretning TGF-β i pancreascancer kakeksi ikke blevet testet. Vi har derfor først bestemmes, hvis TGF-β blokade var relevant i vores bugspytkirtelkræft kakeksi model. TGF-β og den nedstrøms transskriptioner faktor p21 og p-Smad 2/3 blev højt udtrykt ved Pan02 tumorer samt i endogene modeller af for murine pancreascancer (S2 Fig). Vi bekræftede, at mus, der huser Pan02 tumorer behandlet med en neutraliserende TGF-β-mAb (1D11.16.8) udviste lavere serumniveauer af TGF-β (Fig 5A) samt lavere niveauer af TGF-β og nedstrøms signalering markør p-SMAD2 /3 i skeletmuskel (fig 5B). Endvidere har behandling af Pan02 tumorceller med 1D11.16.8 ikke ændre deres cellulære proliferation in vitro (Fig 5C) eller subkutan tumorvækst in vivo (Fig 5D). Endelig fandt vi, at behandling af mus med 1D11.16.8 alene i ikke-tumor-bærende værter ændrede ikke vægtændring, muskelmassen, fedtmasse, arm omkreds, eller knoglemineraltæthed (S3 Fig).

(A) Serumniveauer af TGF-β blev målt i mus behandlet med Pan02, Pan02 + 1D11.16.8 eller PBS + ID11.16.8 (n = 10 /gruppe; * p 0,05). (B) Intramuskulære niveauer af Smad2, p-Smad2 /3, TGF-β, og Ezrin (belastningskontrol) blev beregnet ved Western blotting. Density analyse blev udført på grundlag af tre eksemplarer (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001). (C) Pan02 celleproliferation blev målt efter behandling med stigende doser af 1D11.16.8. (D) 10

7 Pan02 celler blev implanteret subkutant i den højre flanke af mus behandlet med enten PBS eller 1D11.16.8. Tumorer blev målt to gange ugentligt af caliper og eksplanterede tumorer blev sammenlignet for tumorstørrelse (n = 5 /gruppe).

Dernæst undersøgte vi, om farmakologisk blokade af TGF-β kunne afbøde pancreascancer kakeksi. Mus behandlet med Pan02 + 1D11.16.8 udviste forbedret overlevelse (Fig 6A) og betydeligt mindre vægttab (Fig 6B) sammenlignet med kontrolmus. Tumorbærende mus behandlet med 1D11.16.8 havde også højere fedtmasse (Fig 6C), skinfold tykkelse (fig 6D), og knoglemineraltæthed (Fig 6E) sammenlignet med kontroller. Endvidere fandt vi signifikant formindsket tegn på proteolyse i mus behandlet med 1D11.16.8, som afspejles i en mærkbar forskel i kroppen kontur sammenlignet med kontrolmus (Fig 6F). Der var derfor markant svækket reduktion i muskelmassen hos mus behandlet med 1D11.16.8 (Fig 6G). Desuden har vi bekræftede også, at 1D11.16.8 effektivt dæmper bugspytkirtelkræft kakeksi hjælp KPC-afledte FC1242 celler. Konkret fandt vi, at FC1242 mus behandlet med 1D11.16.8 også havde forbedret samlet overlevelse, nedsat fedtmasse tab, højere knoglemineraltæthed og nedsat tab af kropsfedt procent i forhold til at styre mus (S4 Fig).

(A) Mus blev behandlet med Pan02 eller Pan02 + 11D1.16.8 og testet for overlevelse ved anvendelse af Kaplan-Meier-analyse. (B) kohorter af mus blev også testet for vægtændring, og ændringer i (C) fedtmasse, (D) skinfold tykkelse, eller (E) knoglemineraltæthed (n = 10 /gruppe; * p 0,05, ** p * p 0,05).

Kakeksi kan være forbundet med motor og kognitiv dysfunktion [48]. På vurdering af motorisk svækkelse vi bemærkede forbedret funktion i tumor-bærende mus behandlet med TGF-β-inhibitor som målt ved højere roterende stav hastighed sammenlignet med mus administreret Pan02 alene. Omvendt har den lille forbedring i objektet anerkendelse test i Pan02 bærende mus, der blev behandlet med 1D11.16.8 ikke statistisk signifikans (S5 Fig). Kollektivt antyder disse data, at målretning TGF-β er en attraktiv strategi til målretning bugspytkirtelkræft kakeksi.

Discussion

Vi valideret en syngen murin model af metastatisk PDA kakeksi gennem peritoneal injektion af Pan02 celle linje. Mus udviklede tegn på peritoneale metastaser og lever implantater, som svarer til klinisk PDA [1]. Derudover succesraten for denne model er tæt på 100% med næsten alle Pan02-behandlede mus udvikle kræft kakeksi syndrom, hvilket fremgår af betydelige vægttab, nedsat fedt og muskelmassen, proteolyse og lipolyse.

I den aktuelle undersøgelse, viser vi, at hverken genetisk sletning af TLR9 eller blokade af TLR7 /9 ved hjælp af IRS 954 væsentligt ændret de metaboliske ændringer i forbindelse med kræft i bugspytkirtlen kakeksi. Så vidt vi ved er dette den første undersøgelse til specifikt at undersøge effekten af ​​TLR blokade til behandling af kakeksi i PDA, selvom vi og andre tidligere har vist, at TLR’er spiller en vigtig rolle i patogenesen af ​​pancreascancer [49]. For eksempel, Schwartz et al. viste, at TLR3 konstitutivt blev udtrykt i humane pancreas cancer cellelinjer, og TLR blokade med phenylmethimazole hæmmede bugspytkirtelkræft tumorvækst in vivo [26]. Derudover har LPS aktivering af TLR4 /MyD88 signalering vist sig at spille en vigtig rolle i bugspytkirtelkræft tumorvækst og migration, og blokaden af ​​denne vej falder tumor invasiv evne [29]. Endvidere har vores laboratorium tidligere vist, at aktivering af TLR4 og TLR7 accelererer pankreatisk carcinogenese [22, 50]. Andre har vist, at TLR9 korrelerer med den invasive og metastatiske potentiale af humane pancreatiske cancercellelinier [23].

På baggrund af ovenstående data og den kendsgerning, at TLR’er er centrale mediatorer af pro-inflammatoriske cytokin produktion, herunder TNF -α og IL-6, som spiller en vigtig rolle i patogenesen af ​​cancer kakeksi [43, 51], vi den hypotese, at TLR blokade kan være terapeutisk i bugspytkirtelkræft kakeksi. De cytokiner udgivet efter TLR aktivering kan teoretisk bidrage til kræft kakeksi syndrom ved at inducere proteolyse, lipolyse og andre metaboliske ændringer gennem NF-κβ transskription [52]. Ved fremskreden pancreascancer, er pro-inflammatoriske cytokiner produceret fra cancercellerne selv, såvel som i leveren som en del af den akutte fase respons. Interessant er forhøjede cytokinniveauer menes at være dårlige prognostiske faktorer i kakeksi, som undersøgelser har vist, at IL-6 polymorfier og forhøjede niveauer af IL-6 er forbundet med øget kakeksi og nedsat overlevelse i patienter med pancreascancer [53]. Vores model af kræft i bugspytkirtlen kakeksi var forbundet med markante stigninger i serumniveauer af IL-6. Imidlertid IL-6 forblev forhøjede efter TLR7 /9 blokade. Endnu vigtigere er, hverken TLR7 /9 blokade eller genetisk sletning af TLR9 forbedret samlede dødelighed eller de metaboliske ændringer i bugspytkirtlen kakeksi i vores valideret musemodel. Disse negative resultater kan antyde, at længere nedstrøms målretning af Toll-lignende receptor veje, såsom NF-κβ signalering, er forpligtet til at ændre virkningen af ​​kakeksi.

De fleste kritisk, fandt vi, at mus behandlet med TGF-β inhibitor havde forbedret samlet overlevelse og blev beskyttet mod cancer kakeksi som målt ved vægttab, muskelmassen, fedtmasse, skinfold tykkelse og knoglemineraltætheden. Vi viste også, at behandling med 1D11.16.8 nedsat proteolyse og induceret begrænsede forbedring neurokognitiv forringelse i vores Pan02 musemodel, som det fremgår af nedsat muskelmassen og forbedrede scorer i rotarod hastigheden. Faktisk neurokognitive svækkelser er velbeskrevet i kakektiske patienter [48, 54, 55]. Desuden viste vi, at virkningerne af TGF-β blokade på kakeksi er ikke specifikke for Pan02 tumor værter, da vi valideret vores resultater i en KPC-afledt PDA dyremodel.

TGF-β superfamilien, herunder TGF -β

1, TGF-β

2, og TGF-β

3, er involveret i forskellige cellulære processer, herunder cellevækst og differentiering, angiogenese, immunosuppression, apoptose og cellulære homeostase [25]. Derudover TGF-β spiller en vigtig rolle i tumor suppression gennem hæmning af cellevækst ved at inducere cellecyklus-inhibitor, p21 [56]. De Smad proteiner, er de vigtigste familie af transkriptionsfaktorer, som udbreder TGF-β-signalering. Den Smad familien består af R-Smads, Smad 2 og Smad 3, som efter fosforylering, associeret med Co-Smad, Smad 4, og indtast kernen til at aktivere transkription [26]. Interessant, viste vi, at både p21 og Smad 2/3 var yderst opreguleret i både vores Pan02 og KPC transgene musemodeller af kræft i bugspytkirtlen. Vi fandt imidlertid, at virkningen af ​​TGF-β-inhibering på kakeksi ikke var relateret til inhibering af tumorvækst, som det fremgår af ingen forskel i vitro Pan02 cellulær proliferation eller subkutan tumorvækst.

Vores undersøgelse tilføjer til et væld af forskning, som undersøger rollen af ​​TGF-β i PDA. På grund af dens virkning på mange cellulære processer, har ændringer i TGF-β-signalering været impliceret at spille en vigtig rolle i patogenesen og udviklingen af ​​mange cancere [26, 57, 58]. Det er almindeligt accepteret, imidlertid, at TGF-β har roller som både en tumor suppressor og tumor promotor i PDA afhængigt af tumoren scenen og cellulære miljø [24, 59]. For eksempel næsten 100% af pankreatiske tumorer har en mutation i mindst et af TGF-β pathwaygener, og over 50% har gendeletion i Smad4 (DPC4) [26]. Men samtidig, høje serum niveauer af TGF-β

1 er blevet associeret med en øget risiko for PDA udvikling, og PDA patienter med lav nuklear farvning af TGF-βR2 og høj TGF-β

1-niveauer kan have lavere samlet overlevelse [58, 60]. Endvidere Smad4 synes at spille en central rolle i udviklingen af ​​PDA tumorogenesis via påvirkning af tumormikromiljøet.