PLoS ONE: Målretning Bone Remodeling af Isoflavone og 3,3′-diindolylmethane i Baggrunden for prostatakræft knoglemetastaser

Abstrakt

Prostatakræft (PCA) knoglemetastaser har længe været menes at være osteoblastiske grund af knogle remodeling fører til dannelsen af ​​ny knogle. Imidlertid har nyere undersøgelser vist øget osteolytisk aktivitet i begyndelsen faser af PCA knoglemetastaser, tyder på, at målrette både osteolytiske og osteoblastiske mæglere vil sandsynligvis hæmme knogle remodellering og PCa knoglemetastaser. I denne undersøgelse fandt vi, at PCA celler kunne stimulere differentiering af osteoklaster og osteoblaster gennem opregulering af RANKL, RUNX2 og osteopontin, fremme knogle remodellering. Interessant fandt vi, at formulerede isoflavon og 3,3′-diindolylmethane (BR-DIM) var i stand til at inhibere differentiering af osteoklaster og osteoblaster gennem inhibering af cellesignaltransduktion i RANKL, osteoblastiske og PCa cellesignalering. Endvidere fandt vi, at isoflavon og BR-DIM nedreguleret ekspression af MIR-92a, som vides at være forbundet med RANKL signalering, EMT og cancer progression. Ved sti og netværk analyse, vi også observeret de regulatoriske effekter af isoflavon og BR-DIM på flere signalveje såsom AR /PSA, NKX3-1 /Akt /p27, MITF osv Derfor isoflavon og BR-DIM med deres multi -targeted virkninger kunne være nyttige til forebyggelse af PCa progression, især ved at dæmpe knoglemetastaser mekanismer

Henvisning:. Li Y, Kong D, Ahmad A, Bao B, Sarkar FH (2012) Målretning Bone Remodeling ved Isoflavone og 3,3′-diindolylmethane i Baggrunden for prostatakræft knoglemetastaser. PLoS ONE 7 (3): e33011. doi: 10,1371 /journal.pone.0033011

Redaktør: Muzaffer Cicek, Mayo Clinic College of Medicine, USA

Modtaget: December 21, 2011; Accepteret: 2 februar, 2012; Udgivet: 7 marts 2012

Copyright: © 2012 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra National Cancer Institute, National Institutes of Health (5R01CA083695, 5R01CA108535, 5R01CA132794, og 5R01CA131151 tildelt FHS). Forfatterne takker Puschelberg og Guido grundlaget for deres generøse finansielle bidrag. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatter Fazlul Sarkar og medforfatter Aamir Ahmad er PLoS ONE redaktionelle bestyrelsesmedlemmer. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er en almindelig kræft og den anden hyppigste årsag til kræft relaterede dødsfald blandt mænd i USA med en anslået 241,740 nye tilfælde og 28,170 dødsfald forventes i 2012 [1]. Den høje dødelighed af PCa skyldes især udviklingen af ​​metastaser. PCa almindeligvis udstiller sine progressive træk gennem kaskader af androgen afhængighed at kastrere modstand med eventuel metastase. Selvom PCA kan betragtes lokaliseret til prostata, er der stadig en 15% til 20% forekomst af efterfølgende metastase [2]. Det er blevet rapporteret, at 35% af patienterne med PCa udvikle hematogeneous metastaser og at knoglemetastaser PCA er den hyppigste (-90%) blandt de hematogeneous metastaser [3]. PCA knoglemetastaser har længe været menes at være osteoblastiske grund af dannelse af ny knogle. Derfor målretning osteoblastiske molekyler, såsom endotelin-1, har BMP og Wnt-signalering blevet betragtet som strategier til inhibering PCa knoglemetastaser [2]. Men fundet nyere undersøgelser øget osteolytisk aktivitet i begyndelsen faser af PCa knoglemetastaser [4], [5]. Adskillige vækstfaktorer viste sig at blive frigivet fra knoglen matrix under nedbrydning, når PCA celler spredt til benet. Desuden kunne kræftceller spredes til knoglen og udnytte den lokale cytokin maskiner til at stimulere osteoklastogenese, hvilket resulterer i knogleresorption og kræft cellevækst [6]. Disse resultater antyder, at knogleomdannelse herunder osteolytiske og osteoblastiske processer forekommer under PCa knoglemetastaser og til gengæld fremmer væksten af ​​PCA-celler i den nyligt dannede knogle. Derfor ville molekylær målretning af både osteolytiske og osteoblastiske mediatorer sandsynligvis hæmmer knogle remodellering, som kunne blive en nyere terapeutisk strategi for hæmning af PCa knoglemetastaser.

For at hæmme osteolytiske proces, flere strategier er blevet udviklet herunder brug af bisfosfonater og målrette de biologiske regulatorer af osteoklastogenese, såsom osteoprotegerin (OPG), receptor aktivator af nuklear faktor-KB (RANK) og receptor aktivator af nuklear faktor-KB ligand (RANKL). Det vigtigste cytokin maskiner, som er involveret i knogle remodellering og PCa knoglemetastaser, er OPG /RANK /RANKL signalering [7], [8]. RANKL udtrykkes ved osteoblaster, og det er nødvendigt og tilstrækkeligt for osteoklastogenese [9]. RANKL binder til sin receptor RANK som er til stede på overfladen af ​​osteoklastpræcursorer, inducere osteoklastdannelse og aktivering [9], [10]. Undersøgelser har vist, at RAW264.7-celler, en af ​​osteoklast precursor makrofager, kunne differentiere til osteoklaster ved dyrkning i nærværelse af RANKL [10]. De vigtigste træk ved osteoklaster indbefatter evnen til at absorbere knogle, til at udtrykke tartrat-resistent syrephosphatase (TRAP), og at udtrykke proteaser herunder matrix-metalloproteinaser (MMP’er), der begunstiger cancer invasion og metastase [10], [11]. Vigtigste er, at ekspressionen af ​​RANKL også blevet fundet i nogle cancerceller samt i aktiverede T-celler [6], [11], [12]. Derfor har RANKL signalering været menes at være et terapeutisk mål til inhibering af knogleremodellering og knoglemetastaser [13].

Desuden har flere molekyler, herunder endothelin-1, BMP og Wnt er troet som vigtige regulatorer til osteoblast differentiering og knogledannelse [2], [14] – [16]. De histologiske undersøgelser har vist, at osteoblastiske læsioner af PCa knoglemetastaser er karakteriseret ved aflejring af nye knogler, som produceres af osteoblaster, uorganiserede og interlaced mellem foci af cancerceller. I osteoblaster, endothelin-1, BMP og molekylerne i Wnt-signalering er stærkt udtrykt. Desuden forhøjede serumniveauer af knogle-specifik alkalisk phosphatase, en markør for osteoblast differentiering og proliferation, er ofte observeret hos cancerpatient med knoglemetastaser [17], hvilket antyder betydningen af ​​disse molekyler i PCa knoglemetastaser. Derfor målrette disse osteoblastiske molekyler kunne hæmme knogle remodellering og PCa knoglemetastaser.

For nylig har naturlige agenter fået megen opmærksomhed på området kræftforskning. Isoflavone genistein hovedsageligt findes i soja har vist sin evne til at hæmme væksten af ​​kræft celle

in vitro

in vivo

uden toksicitet. Vi har tidligere fundet, at isoflavon genistein kunne inhibere NF-KB og Akt aktivering i cancerceller [18]. Desuden har vi beskrevet, at kosten genistein kunne inhibere PCa i eksperimentel knoglemetastaser i et SCID-human model [19], og at genistein kan forstærke apoptoseinducerende virkninger af kemoterapeutiske midler gennem nedregulering af NF-KB [20]. 3,3′-diindolylmethane (DIM) er en anden naturlig middel og især i de medlemmer af familien Cruciferae såsom broccoli. Vi og andre har fundet, at DIM og dets formulerede produkt (BR-DIM fremstillet af bioresponset, LLC. Med forbedret biotilgængelighed) kunne nedregulere ekspressionen af ​​AR, Akt og NF-KB, der fører til inhibition af PCa vækst og induktion af apoptose

in vitro

in vivo

[21], [22]. DIM blev også fundet at potensere den terapeutiske virkning af kemoterapeutiske midler [23]. I denne undersøgelse undersøgte vi, om isoflavon blanding G2535 indeholdende 70,5% genistein, og BR-DIM kunne hæmme differentieringen af ​​osteoklaster og osteoblaster medieret gennem regulering af cellulære signalveje, der er involveret i knogle remodellering og PCa knoglemetastaser.

Resultater

Differentiering af osteoklaster og osteoblaster i co-kultur-system med PCA celler

for at undersøge rollen af ​​knogle-relaterede cellulær signalering i knogle remodellering under PCa knoglemetastaser, vi først udviklet en co -kultur til at muliggøre PCA-celler og osteoklaster eller osteoblaster dyrket under det samme dyrkningsmedium tilstand. Vi fandt at PC-3 prostatacancerceller kunne vokse pænt med præ-osteoclast (RAW264.7) celler (figur 1A) og at begge C4-2B celler og præ-osteoblaster (hFOB1.19 celler) kunne vokse sammen (figur 1 B) . Derefter behandlede vi co-kultur af PC-3 og RAW264.7-celler med RANKL eller TGF-β til fremkaldelse osteoklastdifferentiering. Inkuberede vi co-kultur af C4-2B og hFOB1.19 celler ved 39 ° C for at inducere osteoblast differentiering. TRAP-farvning blev udført til påvisning osteoklastdifferentiering mens alkalisk phosphatase-farvning blev udført til påvisning af osteoblast differentiering. Vi observerede dannelse af flerkernede celler og det mørkebrune granuler i de differentierede osteoklaster omgivet af PC-3-celler (figur 2A), hvilket antyder, at differentieringen af ​​osteoclast kunne fremkaldes ved RANKL eller TGF-β i PCa vækstmiljø. Vi har også observeret mørkeblå granulat i hTOB1.19 celler omgivet af C4-2B celler (figur 2B), hvilket antyder, at osteoblast kunne differentieres ved dyrkning sammen med PCA-celler.

A. PC-3-celler (angivet med sort trekant) blev co-dyrket med RAW264.7-celler (angivet med sort pil) i lav celletæthed (a, b) og høj celledensitet (c, d). B. C4-2B celler (angivet med hvid trekant) blev co-dyrket med hFOB1.19 celler (angivet med hvid pil) i lav celledensitet (e, f) og høj celledensitet (g, h). × 100.

A. RAW264.7-celler blev co-dyrket med PC-3-celler (angivet med sort pil) og behandlet med 100 ng /ml RANKL (a, b) eller 10 ng /ml TGF-β (c, d) i 8 dage. TRAP-farvning viste mørkebrune granulat (angivet med hvid pil) i opdelte osteoklaster omgivet af PC-3-celler. B. hFOB1.19 celler blev dyrket alene (e, f), eller co-dyrket (g, h) med C4-2B celler (angivet med sort trekant) i 39 ° C i 5 dage. Alkalisk fosfatase farvning viste mørkeblå granulat (angivet med hvid trekant) i differentierede osteoblaster. × 200.

TGF-β inducerede osteoklastdifferentiering gennem RANKL

Da vi observerede differentiering af osteoclast af TGF-β, testede vi virkningen af ​​TGF-β på ekspressionen af ​​RANKL . Vi fandt, at ekspressionsniveauet af RANKL var signifikant forhøjet ved TGF-β behandling i C4-2B og PC-3-celler (figur 3A), hvilket tyder på, at induktionen af ​​osteoklastdifferentiering af TGF-β blev medieret gennem opregulering af RANKL og at PSA-celler kunne producere RANKL at inducere osteoklastdifferentiering. Vi observerede også, at ekspressionsniveauet af CXCR-4, en af ​​de kritiske gener for metastase, var signifikant forhøjet ved TGF-β behandling. Disse resultater tyder på, at den øgede niveau af TGF-β ved tumor eller stromale celler kunne fremme knogle remodellering og PCa metatstasis gennem RANKL og CXCR-4-signalering

A:. C4-2B og PC-3 celler blev behandlet med 100 ng /ml OPG eller 10 ng /ml TGF-β i 24 timer. Ekspressionen af ​​RANKL og CXCR-4-protein blev målt ved Western Blot-analyse. B og C: RAW246.7 (B) og hFOB1.19 (C) celler i nedre kamre blev co-dyrket med C4-2B (C4), PC-3 (PC), ARCaP

M (M) og ARCaP

E (E) prostata kræftceller i øvre kamre i 48 timer. Western Blot-analyse blev udført for at måle ekspressionen af ​​osteoclast eller osteoblast markører i RAW264.7 eller hFOB1.19 celler.

Co-kultur med prostatacancerceller øget differentieringen af ​​osteoklaster og osteoblaster

for at undersøge om PCA celler kunne fremme differentiering af osteoklaster og osteoblaster, vi dyrket RAW264.7 eller hFOB celler i det nedre kammer af kultur-system og dyrkede forskellige PCA celler, herunder C4-2B, PC-3, ARCaP

M og ARCaP

E celler i det øverste kammer, så de udskilte proteiner fra cancerceller kunne komme ind nedre kammer fra øverste kammer gennem en membran med en um pore. Western Blot-analyse blev udført for at måle osteoclast og osteoblast differentieringsmarkører. Vi fandt, at co-kultur af RAW264.7-celler med PCA-celler forøgede ekspression af TRAcP, en af ​​de største osteoklastdifferentiering markører i RAW264.7-celler (figur 3B). Udtrykket af fibronektin blev også øget ved samtidig dyrket med C4-2B og PC-3-celler (figur 3B). Vi observerede også øget ekspression af RUNX2, en af ​​osteoblast markører, i hFOB1.19 celler (figur 3C). Ekspressionen af ​​osteopontin, et af de vigtige gener for knogleremodellering, blev også induceret ved samtidig dyrket med PCA-celler (figur 3C). Disse resultater antyder, at PCA-celler kunne producere nogle molekyler, der bidrager til induktion af differentiering af osteoklaster og osteoblaster, forårsager knogle remodellering.

Isoflavone og BR-DIM inhiberede differentiering af osteoklaster og osteoblaster

at undersøge virkningerne af isoflavon og BR-DIM på differntiation af osteoklaster og osteoblaster, behandlede vi RAW264.7 eller hFOB1.19 celler med 10 til 25 uM G2535 eller BR-DIM under de processer af osteoclast og osteoblast differentiering. Vi har udført TRAP eller Alkaline phosphatase farvning at opdage differentieringen af ​​osteoklaster eller osteoblaster. Vi observerede, at TGF-β induceret dannelse af flerkernede osteoclaster og at isoflavone og BR-DIM behandlinger signifikant reducerede mørkebrune granulat i RAW264.7-celler (figur 4A) og de mørkeblå granulat i hFOB1.19 celler ved dyrkning alene (figur 4B ) eller co-dyrkes med C4-2B (figur 4C). Disse resultater tyder klart isoflavon og BR-DIM kunne inhibere differentieringen af ​​osteoklaster og osteoblaster, som kan dæmpe knogleremodellering under PCa metastase og ville være meget ønskeligt til inhibering af PCa knoglemetastaser

A:. RAW246. 7 celler blev behandlet med 10 ng /ml TGF-β alene eller kombineret med 10 pM G2535 i 8 dage. TRAP-farvning blev udført. Mørkebrune granulat angivet differentieringen af ​​osteoklaster. × 100. B og C: hFOB1.19 celler blev dyrket alene (B) eller co-dyrket med C4-2B celler (C) ved 39 ° C. Cellerne blev også behandlet med 20 pM G2535 eller 10 uM BR-DIM i 5 dage. Alkalisk fosfatase farvning viste mørkeblå granulat i differentierede osteoblaster. × 200.

Isoflavone og BR-DIM reguleret RANKL og prostatakræft signalering, hvilket kunne hæmme osteoklastogenese og prostatakræft vækst

Da vi fandt, at isoflavon og BR-DIM hæmmede differentiering af osteoklaster, vi yderligere undersøgt den molekylære mekanisme for isoflavon og BR-DIM handling på osteoclastgenesis. Vi gennemførte microarray analyse af genekspression profil C4-2B celler behandlet med G2535 eller BR-DIM. Ved at bruge Ingenuity Pathway Analysis, fandt vi, at isoflavon og BR-DIM inhiberede cellulær signaltransduktion i RANKL signalvejen (figur 5A og tabel 1) og PCa signalering (figur 5B og tabel 1). BR-DIM og isoflavon hæmmede markant udtryk for MITF, en af ​​de vigtige transcrption faktorer involveret i reguleringen af ​​osteoklastaktiviteten genekspression (figur 5A og tabel 1). BR-DIM og isoflavon inhiberede også signalet transduktioner i PCa signalering med opregulering af p27 og nedregulering af PSA og cyclin D (figur 5B og tabel 1). Desuden isoflavon og BR-DIM reguleret molekylerne i signaltransduktionsegenskaberne netværk med nedregulering af Akt, NKX3-1, STK-4, CDK13 og MITF (figur 5C, 5D og tabel 1), hvilket fører til inhibering af osteoklastogenese og PCa vækst. Endvidere har vi udført real-time RT-PCR og Western blot-analyse for at bekræfte resultaterne fra microarray og Ingenity Pathway Analysis. Vi observerede, BR-DIM og isoflavon nedreguleres ekspressionen af ​​MITF, Akt, NKX3-1, cyclin D og PSA, og opreguleret ekspression af p27, p38 og CREB på mRNA (figur 6 A og 6B) og protein (figur 6C og 6D) niveauer. Disse resultater er consistant med microarray data, hvilket antyder, at BR-DIM og isoflavon kunne inhibere osteoklastogenese og PCa vækst.

BR-DIM reguleret molekylerne i RANKL signaling (A), prostatacancer signalering (B), og signal transduktion netværk (C, D) analyseret af microarray og Ingenuity Pathway analyse i C4-2B celler. Rød indikerer up-regulerede molekyler, mens grønne specificerer nedreguleret molekyler. Tallene blev automatisk oprettet af Ingenuity Pathway Analysis software.

BR-DIM og isoflavon reguleret ekspression af MITF, p38, Akt, NKX3-1, p27, cyklin D, CREB og PSA på mRNA og proteinniveauer testet af real-time PCR (A, B) og Western Blot-analyse (C, D). C4-2B (A, C) og PC-3 (B, D) -celler blev behandlet med 25 pM G2535 eller 25 uM BR-DIM i 24 timer (for RNA-ekstraktion) eller 48 timer (for proteinekstraktion). . (BD: BR-DIM)

RANKL opreguleret ekspression af miR-92a mens isoflavon og BR-DIM abragated den opregulering af miR-92a stimuleret af RANKL

Ved edb forudsigelse af target miRNA, fandt vi, at RANKL kunne regulere flere miRNA som miR-92a og miR-155, hvilket fører til øget osteoklastogenese. For at bekræfte, om miR-92a er en legitim målsætning af RANKL eller ej, vi behandlede C4-2B celler med 100 ng /ml RANKL i 24 timer. Vi observerede, RANKL behandling induceret MIR-92a ekspression i PCA-celler (figur 7A). Vigtigere, fandt vi, at behandling af celler med isoflaone eller BR-DIM faldt ekspressionen af ​​MIR-92a og svækkede induktionen af ​​MIR-92a-ekspression stimuleres af RANKL i PCa celler (figur 7A), hvilket antyder en mekanistisk forbindelse mellem RANKL, miR- 92a og den biologiske aktivitet af isoflavoner eller BR-DIM

A:. C4-2B celler blev behandlet med 100 ng /ml RANKL, 25 uM G2535, 25 uM BR-DIM, eller en kombination af RANKL og G2535 eller BR-DIM i 24 timer. Totalt RNA blev ekstraheret og ekspressionen af ​​MIR-92a blev detekteret i behandlede C4-2B celler. B: C4-2B celler blev dyrket i nedre kammer af co-dyrkningssystem. RAW246.7 og hFOB1.19 celler blev dyrket i øverste kammer. Cellerne blev behandlet med 25 pM G2535 eller 25 uM BR-DIM i 48 timer. Ekspressionen af ​​E-cadherin og vimentin blev målt ved Western Blot-analyse. C: hFOB1.19 celler blev behandlet med 25 pM G2535 eller 25 uM BR-DIM i 48 timer. Udtrykket af periostin blev detekteret ved Western Blot-analyse.

Isoflavone og BR-DIM reguleret Epithelial-til-Mesenchymale Transition (EMT) markører, E-cadherin og vimentin

Da vi observerede, at isoflavon og BR-DIM kunne hæmme ekspression af miR-92a, som kunne fremme metastaser og regulere EMT ved at målrette nedregulering i ekspressionen af ​​E-cadherin [24], vi yderligere undersøgt virkningerne af isoflavon og BR-DIM på ekspression af E-cadherin og vimentin, de to vigtigste og godt accepteret EMT markører, der er direkte forbundet med EMT fænotype. Dyrkede vi C4-2B celler i det nedre kammer af et co-dyrkningssystem hvor dyrkede vi RAW264.7 og hFOB1.19 celler i det øvre kammer til at efterligne tumormikromiljøet af PCA-celler og osteoklast /osteoblast interaktion. Efterfølgende behandlede vi cellerne med 25 pM G2535 eller 25 uM BR-DIM i 48 timer. Vi fandt, at isoflavon eller BR-DIM behandling øgede ekspressionen af ​​E-cadherin og faldt ekspressionen af ​​vimentin (figur 7B), hvilket antyder, at isoflavon og BR-DIM kunne forhindre induktionen af ​​EMT ved at regulere ekspressionen af ​​MIR-92a, E -cadherin og vimentin.

Isoflavone og BR-DIM hæmmede ekspressionen af ​​osteoblastiske gen

Da vi observeret, at isoflavon og BR-DIM kunne hæmme differentiering af osteoblaster, vi yderligere undersøgt det molekylære mål for isoflavon og BR-DIM handling på osteoblast differentiering. Vi behandlede hFOB1.19 celler med 25 pM G2535 eller 25 uM BR-DIM i 48 timer. Vi fandt, at isoflavon eller BR-DIM behandling inhiberede ekspressionen af ​​periostin (figur 7C), en af ​​de vigtige gener for osteoblastdifferentiering. Disse resultater antyder, at inhibering af periostin kunne være en af ​​de molekylære mekanismer, som isoflavon og BR-DIM inhiberede differentiering af osteoblaster.

Diskussion

Det er velkendt, at PCA-celler ofte metastaserer til knoglen. I knoglen, kunne metastaseret PCA celler udnytte de næringsstoffer fra blod i knoglemarven, interagere med præ-osteoklaster og præ-osteoblaster, og stimulere knogle remodellering [25], [26]. Samspillet mellem PCA celler og præ-osteoklaster /pre-osteoblaster er et afgørende skridt for knogle remodellering under PCa knoglemetastaser [26]. Derfor udvikling af en co-kultur-system med PCA celler og præ-osteoklaster /pre-osteoblaster er vigtig for at undersøge molekylære interaktioner af signalveje i PCa knogle metastaser og knogle remodellering. Vores data viser, at androgen-ufølsom PCA celler, herunder PC-3 og C4-2B celler kunne vokse pænt med præ-osteoklaster eller pre-osteoblaster i den samme kultur fad med defineret medium, som efterligner

in vivo

miljø med direkte interaktion af PCA-celler og lokale knogleceller. I vores co-kultur-system, PCA celler, pre-osteoklaster, og præ-osteoblaster kunne også vokse i de enkelte kamre, der var adskilt af en membran tillader proteiner (opløselige faktorer) fordeling mellem de to kamre, mens adskille forskellige typer af celler i de enkelte kamre . På denne måde kan virkningen af ​​secernerede proteiner (opløselige faktorer) fra PCA celler på knogleceller eller virkninger af udskilte proteiner fra knogleceller på PCA-celler undersøges. Brug af co-kultur, testede vi de molekylære ændringer i osteoklaster eller osteoblaster stimuleres af PCA-celler. Nylige undersøgelser af andre forskere har vist, at co-kultur af osteoclast og osteoblast kunne være nyttige for behandlingen knoglemetabolisme og osteoklastogenese [27], [28]. Disse resultater antyder, at co-kultursystem er meget nyttigt at undersøge de molekylære ændringer, når PCA celler homing til knoglen, som muliggør vurdering af ændringer i signalet transduktioner mellem PCA-celler og de lokale knogleceller under PCa knoglemetastase og knogle remodeling som dokumenteret af vores resultater.

differentieringen af ​​osteoklaster eller osteoblaster er et vigtigt skridt i løbet af kræft metastaser til knoglerne og knogle remodellering. Ved at bruge vores co-kultur-systemet, fandt vi, at pre-osteoklaster kunne differentiere i at modne osteoklaster ved samtidig dyrkes sammen med PCA celler. Desuden kunne pre-osteoblaster også differentiere til modne osteoblast ved samtidig dyrket med PCA-celler. Endvidere fandt vi, at co-kultur af osteoklaster og osteoblaster med PCA-celler kunne øge differentieringen af ​​osteoklaster og osteoblaster. Disse resultater antyder, at molekylerne fremstillet ved PCA-celler kunne inducere differentieringen af ​​osteoklaster og osteoblaster. Vigtigere, fandt vi, at isoflavon og BR-DIM kunne inhibere differentieringen af ​​osteoklaster og osteoblaster ved samtidig dyrket med PCA-celler, hvilket antyder, at isoflavon og BR-DIM ville være nyttig til inhibering af PCa knoglemetastaser og knogle remodellering (figur 8) . Det er kendt, at PCA celler i knoglemetastase stimulere knogle remodellering mens knogleomdannelse letter PCa knoglemetastaser og invasion i knoglen [29] – [31], der er kendt som en ond cirkel af knogleremodellering og knoglemetastaser. Vores resultater viste, at isoflavon og BR-DIM inhiberede knogle celledifferentiering, hvilket antyder, at isoflavon og BR-DIM kunne hæmme PCa knoglemetastase gennem forstyrre knogleombygning.

Det er blevet rapporteret, at differentieringen af ​​osteoklaster sker først under knogle remodellering når PCA celler metastaserer til knoglerne [4], [5]. Derfor inhibering af osteoklastdifferentiering er vigtig for at afbryde PCa knoglemetastaser og homing. Det er velkendt, at RANK /RANKL /OPG signalering er nøgleregulator for osteoklastdifferentiering [32]. Vores resultater viste, at RANKL behandling i væsentlig grad kan fremkalde differentiering af osteoklaster, hvilket er i overensstemmelse med offentliggjorte rapport [33]. Vigtigere, fandt vi, at TGF-β kunne opregulere ekspressionen af ​​RANKL, der fører til differentiering af osteoklaster. Disse resultater er også i overensstemmelse med rapporten fra andre investigator [31], hvilket antyder, at aktivering af TGF-β, som er almindeligt ses ved fremskreden PCa, kan stimulere differentieringen af ​​osteoklaster, hvilket fører til knogleresorption og knogleombygning. Endvidere er det velkendt, at TGF-β også kunne inducere EMT [34], hvilket letter PCa progression herunder invasion og knoglemetastaser. Vigtigere, viste vores data, at isoflavon kunne dæmpe TGF-β induceret osteoklastdifferentiering, og at isoflavon og BR-DIM kan regulere ekspressionen af ​​EMT markører (figur 8), hvilket antyder, at disse naturlige midler kunne være nyttige til forebyggelse af PCa progression og knoglemetastaser.

Nye beviser tyder på, at microRNA (miRNA) regulere mange fysiologiske og patologiske processer [35]. Vores resultater viste, at ud over at regulering osteoklaster, RANKL kunne også opregulere ekspressionen af ​​MIR-92a. MIR-92a har vist sig at nedregulere ekspressionen af ​​anti-tumor-gener, hvilket resulterer i cancercelleproliferation [36]. Nylig rapport viste, at E-cadherin er et direkte mål for MIR-92a, og at ekspressionen af ​​MIR-92a fremmes lymfeknudemetastase af human esophageal pladecellecarcinom via nedregulering af E-cadherin [24]. Derfor kunne RANKL også fremme PCa progression via opregulering af miR-92a og dermed ved nedregulering af E-cadherin. Interessant isoflavon og BR-DIM kunne svække opregulering af MIR-92a stimuleret af RANKL behandling, hvilket tyder på vigtigheden af ​​disse naturlige midler (isoflavon og BR-DIM) ved inhibering af PCa progression og knoglemetastaser (figur 8 ).

Foruden de inhibitoriske virkninger på osteoklaster, isoflavon og BR-DIM også inhibted differentieringen af ​​osteoblast med nedregulering af periostin, en af ​​de vigtige gener for osteoblastdifferentiering. Derfor ved at målrette både osteoklast og osteoblast differentiering, isoflavon og BR-DIM kunne effektivt afbryde knogle remodellering, giver ugunstige micoenvironment til homing af PCA celler til knoglen. Selv om både isoflavon og BR-DIM udviste hæmmende effekt på knogle celle differentiering, de involverede molekyler og ændrede niveauer af isoflavon eller BR-DIM behandling var ikke det samme, tyder på, at komplekse regulerende mekanismer er involveret. Ved sti og netværk analyse, fandt vi, at isoflavon og BR-DIM kunne påvirke flere signalveje såsom AR /PSA, NKX3-1 /Akt /p27, LEF1 /cyclin D1, MITF /NR3C1 etc. I BR-DIM behandlede C4 2b celler, fandt vi mere potent nedregulering af PSA, som har vist sig at modulere gener involveret i knogleomdannelse og osteoblast differentiering [37]. Disse resultater tyder på multi-targeting virkninger af isoflavon og BR-DIM, som vil gøre isoflavone og BR-DIM kraftige midler til at hæmme PCa vækst i knogle mikromiljø.

Som konklusion, isoflavon og BR-DIM kunne målrette både osteoclast og osteoblast differentiering, og også kunne målrette flere molekyler i PCA celler; derfor kan disse midler inhibere knogle- remodellering og PCa vækst, hvilket antyder, at isoflavon og BR-DIM kunne være meget nyttige til forebyggelse af PCa progression, især knoglemetastaser. Den biologiske aktivitet af isoflavon og BR-DIM medieres gennem nedreguleringen af ​​multiple signalveje, herunder RANKL, AR /PSA, og Akt signalering, hvilket gør dem meget lovende midler til forebyggelse og /eller behandling af PCa og dens knoglemetastaser i kombination med konventionel kemoterapi.

Materialer og metoder

Cellelinjer, reagenser og antistoffer

PC-3 (ATCC, Manassas, VA), C4-2B, ARCaP

E og ARCaP

M (Novicure, Birmingham, AL) prostatacancerceller og præ-osteoklast RAW264.7 (ATCC) celler blev opretholdt i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 10% føtalt bovint serum , 50 U /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin i en CO 5%

2 atmosfære ved 37 ° C. Pre-osteoblast hFOB1.19 (ATCC) celler blev holdt i DMEM /F12 uden phenolrødt (Invitrogen) suppleret med 10% føtalt bovint serum, 50 U /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin i en CO 5%

2 atmosfære ved 34 ° C. Isoflavone blanding G2535 (70,5% genistein, 26,3% daidzein og 0,31% glycetein fremstillet af økologiske Technologies og fås fra NIH) blev opløst i DMSO at lave en stamopløsning indeholdende 50 mM genistein. Koncentrationerne af isoflavon vi beskrevet i denne artikel henviser alle til koncentrationen af ​​genistein i isoflavon blanding. BR-DIM (biorespons, LLC, Boulder, CO,. Formuleret-DIM med højere biotilgængelighed

in vivo

[38]) blev generøst tilvejebragt af Dr. Michael Zeligs og blev opløst i DMSO til at lave en 50 mM lager løsning. Anti-CXCR-4 (Santa Cruz, Santa Cruz, CA), anti-fibronectin (Santa Cruz), anti-RUNX2 (Santa Cruz), anti-osteopontin (Santa Cruz), anti-periostin (Santa Cruz), anti-E -cadherin (Santa Cruz), anti-vimentin (Dako), anti-RANKL (R & D, Danvers, MA), anti-TRAcP (Sigma, St. Louis, MO), anti-MITF (Santa Cruz), anti p27 (Santa Cruz), anti-PSA (Santa Cruz), anti-cyclin D (Santa Cruz), anti-p38 (Santa Cruz), anti-β-actin (Sigma) og anti-GAPDH (Sigma) primære antistoffer blev anvendt for Western Blot-analyse.

Co-kultur af PCA celler med osteoklaster og osteoblaster

for at emulere PCa celle dyrkes i et osteoklastisk miljø, PC-3 celler og RAW264.7 celler blev co-dyrket på 1:01 forhold i RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum, 50 U /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin i en 5% CO2 atmosfære ved 37 ° C. Cellerne blev behandlet med 100 ng /ml RANKL eller 10 ng /ml TGF-β i 8 dage for at stimulere RAW264.7 celledifferentiering. Ligeledes at efterligne PCa celle dyrkes i osteoblastisk miljø, C4-2B og hFOB1.19 celler blev co-dyrket ved 01:02 forhold i RPMI 1640 /F12 (01:01) tilsat 10% føtalt bovint serum, 50 U /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin i en 5% CO2 atmosfære ved 39 ° C i 5 dage for at stimulere osteoblastdifferentiering af hFOB1.19 celler.