PLoS ONE: A Novel To tilstand hæmmer af ABCG2-medieret Multidrug Transport og Resistance in Cancer Chemotherapy

Abstrakt

Baggrund

multiresistens (MDR) er et stort problem i en vellykket behandling af cancere. Human ABCG2, et medlem af ATP-bindende kassette transportør superfamilien, spiller en central rolle i MDR og en vigtig rolle i beskyttelsen cancer stamceller. Knockout af ABCG2 havde ingen tilsyneladende skadelig virkning på mus. , ABCG2 er således et ideelt mål for udvikling af kemo-sensibiliserende midler til bedre behandling af lægemiddelresistente kræftformer og hjælpe udrydde cancer stamceller.

Metoder /foreløbige resultater

Brug rationel screening af repræsentanter fra en kemisk forbindelse bibliotek, fandt vi en hidtil ukendt inhibitor af ABCG2, PZ-39 (N-(4-chlorophenyl)-2-[(6-{[4,6-di(4-morpholinyl)-1,3,5-triazin-2-yl]amino}-1,3-benzothiazol-2-yl)sulfanyl]acetamide), der har to former for handlinger ved at hæmme ABCG2 aktivitet og ved at fremskynde sin lysosomer-afhængige nedbrydning. PZ-39 har ingen effekt på ABCB1 og ABCC1-medieret drug efflux, modstand, og deres udtryk, hvilket indikerer, at det kan være specifik for ABCG2. Analyser af dens analoge forbindelser viste, at pharmacophor af PZ-39 er benzothiazol knyttet til en triazinring rygrad.

Konklusion /Betydning

I modsætning til alle tidligere kendte ABCG2 transportør hæmmere, PZ-39 har en roman to-mode handling ved at hæmme ABCG2 aktivitet, en akut effekt, og ved at accelerere lysosomer-afhængige nedbrydning, en kronisk effekt. PZ-39 er potentielt et værdifuldt sonde for struktur og funktion studier af ABCG2 og en lead-stof for at udvikle lægemidler rettet mod ABCG2-medieret MDR i multikombinerbare cancer kemoterapi

Henvisning:. Peng H, Dong Z, Qi J, Yang Y, Liu Y, Li Z, et al. (2009) A Novel To tilstand hæmmer af ABCG2-medieret Multidrug Transport og Resistance in Cancer kemoterapi. PLoS ONE 4 (5): e5676. doi: 10,1371 /journal.pone.0005676

Redaktør: Paul Cobine, Auburn University, USA

Modtaget: Marts 30, 2009; Accepteret: May 1 2009. I Udgivet: May 24, 2009

Copyright: © 2009 Peng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af National Institutes of Health giver R01 CA120221 og R01 CA113384. ZD og YY blev støttet delvist af NRSA T32 DK07519 og T32 HL07910 fra National Institutes of Health, hhv. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

multilægemiddelresistens (MDR) er et stort problem i vellykket behandling af cancere. Over-ekspressionen af ​​nogle medlemmer af ABC (ATP-bindende kassette) transporter superfamilien er blevet foreslået at forårsage MDR. P-glycoprotein (MDR1 /ABCB1), multiresistens protein 1 (MRP1 /ABCC1), og brystkræft modstand protein (BCRP /ABCG2) er tre store ABC transportører, der er vigtige aktører i den kliniske udvikling af MDR [1]. Et af disse medlemmer, ABCG2 hvilket menes at eksistere og arbejde som homo-oligomerer af 8-12 underenheder [2], [3], [4], har også været impliceret at spille roller i at beskytte cancer stamceller, hvilket resulterer i lægemiddel modstand og svigt af cancer kemoterapi [5]. Anticancerlægemiddel substrater af ABCG2 indbefatter, men er ikke begrænset til de almindeligt anvendte anticancerlægemidler såsom Adriamycin, mitoxantron, og topotecan. Faktisk har de seneste kliniske undersøgelser vist, at overekspression af ABCG2 i både voksen og børneleukæmi korrelerer meget godt med dårlig prognose (for en gennemgang se [6]). Knockout af ABCG2 havde ingen tilsyneladende skadelig virkning på udviklingen, biokemi, og livet af musene [7]. Alle disse tidligere bemærkninger gør ABCG2 et ideelt mål for udvikling af kemo-sensibiliserende midler til bedre behandling af lægemiddelresistente kræftformer og foreslå, at hæmme ABCG2 næppe vil forårsage en bivirkning, hvis inhibitoren er specifik for ABCG2.

I forhold til de velkendte resistens-fremkaldende ABC transportører som ABCB1 og ABCC1 blev ABCG2 opdaget relativt nylig, og dermed har nogle specifikke hæmmere af ABCG2 blevet rapporteret. En af de kendte specifikke ABCG2 inhibitorer er potente mycotoxin Fumitremorgin C (FTC) secerneres fra

Aspergillus fumigatus

[8], [9]. Imidlertid neurotoksiciteten af ​​FTC begrænser dens terapeutiske potentiale. Analoger af FTC, såsom Ko132 og Ko143, er blevet udviklet med lav toksicitet [10], men endnu ikke kendt, hvis effektive i kliniske forsøg. Desuden er der rapporteret andre inhibitorer af ABCG2 [11], [12]. Disse midler, såsom GF 120918, synes, at mangle specificitet på grund af deres virkning på ABCB1 og /eller ABCC1 [13], [14]. Det er klart, er der behov for mere specifikke ABCG2 hæmmere for den fremtidige udvikling af potentielle kemo-sensibiliserende til bedre behandling resistente kræftformer.

I dette papir, vi rapporterer opdagelsen af ​​en ny specifik ABCG2 hæmmer, PZ-39 (N- ( 4-chlorphenyl) -2 – [(6 – {[4,6-di (4-morpholinyl) -1,3,5-triazin-2-yl] amino} -1,3-benzothiazol-2-yl) sulfanyl ] acetamid), som er langt mere effektiv til at vende ABCG2-medieret resistens og mindre cytotoksiske for dyrkede celler sammenlignet med FTC. PZ-39 synes at have to virkemåder ved at forårsage ABCG2 nedbrydning (kronisk) foruden at inhibere dets aktivitet (akut). Den tilsvarende effekt af tre PZ-39 relaterede forbindelser afslørede strukturelle grundlag for udformningen af ​​mere potente specifikke ABCG2 hæmmere i fremtiden.

Resultater

Effekt af sammensatte PZ-39 om mitoxantron ophobning

Ved hjælp af en rationel screening af repræsentanter for forskellige klasser af et lille molekyle sammensatte bibliotek fra Specs (www.specs.net) for potentielle hæmmere af ABCG2-medieret drug efflux, vi identificeret en forbindelse, N-(4-chlorophenyl)-2-[(6-{[4,6-di(4-morpholinyl)-1,3,5-triazin-2-yl]amino}-1,3-benzothiazol-2-yl)sulfanyl]acetamide) med benzothiazol bundet til triazinringen rygrad, (opkaldt PZ-39 derefter, se fig. 1), der drastisk vendt mitoxantron akkumulering i MCF7 /AdVp3000 celler, som overudtrykker ABCG2. Som vist i fig. 2A, PZ-39 forstærkede mitoxantron akkumulering i MCF7 /AdVp3000 men ikke de parentale følsomme MCF7-celler, som ikke frembringer ABCG2, hvilket antyder, at ABCG2-medieret lægemiddel efflux er blevet hæmmet. Fordi MCF7 /AdVp3000 celler også over-udtrykke andre ABC transportører såsom ABCC3 foruden ABCG2 [15], PZ-39 kan hæmme andre end ABCG2 ABC transportører, hvilket fører til øget mitoxantron akkumulation. Til direkte teste, om PZ-39 inhiberer ABCG2, udførte vi lignende undersøgelser under anvendelse ABCG2-transficerede stabilt HEK293 (HEK293 /ABCG2) -celler [3]. Som vist i fig. 2B, præinkubation af celler med PZ-39 forstærkede intracellulær mitoxantron akkumulering i HEK293 /ABCG2 men ikke i vektoren-transficerede kontrol (HEK293 /Vec) celler. Således PZ-39 sandsynligvis inhiberer ABCG2-medieret mitoxantron efflux. Fig. 2A og 2B viser også, at PZ-39 ved 3,3 uM opnået tilsvarende virkning som det kendte specifikke ABCG2 inhibitor FTC ved 10 uM, hvilket antyder, at PZ-39 kan være ~ 3 gange mere potent end FTC.

PZ -39, N-(4-chlorophenyl)-2-[(6-{[4,6-di(4-morpholinyl)-1,3,5-triazin-2-yl]amino}-1,3-benzothiazol-2-yl)sulfanyl]acetamide, og dets analoger C6, C8 og E2 indeholder alle en benzothiazol knyttet til en triazinringen rygrad. De tre intakte ringe er mærket som A, B og C.

A og B, mitoxantron ophobning i MCF7 eller dets resistente Delområde MCF7 /AdVp3000 (A) og HEK293-celler transficeret med vektor eller ABCG2 (B) efter en 30 minutters inkubation i fravær eller nærvær af PZ-39 (3,3 uM) eller FTC (10 uM). Dataene er middelværdier ± SD fra tre uafhængige eksperimenter (* P 0,05; ** P 0,01 sammenlignet med DMSO-vehikel). C og D, dosisreaktion af PZ-39 og FTC i genoprettelsen mitoxantron akkumulering i ABCG2-transficerede HEK293-celler. Den tykke linje viser niveauet af mitoxantron ophobning i vektor-transficerede HEK293 celler, der tjener som en kontrol.

For yderligere at undersøge styrken af ​​PZ-39 for ABCG2, dosis respons effekt af PZ-39 på mitoxantron akkumulering i HEK293 /ABCG2 celler blev bestemt under anvendelse af flowcytometri. Som vist i fig. 2C, det intracellulære mitoxantron-niveauet blev forøget med PZ-39 på en dosis-afhængig måde. Ved 3,3 pM, PZ-39 fuldstændig restaureret intracellulær mitoxantron niveau i HEK293 /ABCG2 celler. FTC, på den anden side, opnås tilsvarende niveau for virkning ved 10 uM (fig. 2D), støtter det argument, at PZ-39 er mere potent end FTC (se ovenfor).

Sensibilisering af lægemiddelresistens ved PZ-39

for at undersøge den potentielle anvendelse af PZ-39 som en kemo-sensibilisator af ABCG2-medieret resistens narkotika, effekten af ​​PZ-39 om narkotika respons HEK293 /ABCG2 celler blev bestemt i fravær eller tilstedeværelse af 0,1 uM mitoxantron der alene producerede ~ 10% celle drab. Som vist i fig. 3A og 3B, er PZ-39 ikke cytotoksisk for HEK293 /ABCG2 celler og dets IC

50 er ikke målbar i koncentrationsområde bruges mens IC

50 af FTC er ~24 uM. IC

50 af PZ-39 og FTC forpligtet til at bevidstgøre mitoxantron modstand er -15 nM og ~387 nM. Styrken indeks for PZ-39 skønnes at være 1600 henviser den for FTC er kun ~62 (tabel 1)

A og B, potens indeks for PZ-39 sammenlignet med FTC vende mitoxantron modstand. . HEK293 /ABCG2 celler blev behandlet uden eller med 0,1 pM (IC

10) mitoxantron i fravær eller nærvær af forskellige koncentrationer af PZ-39 (A) eller FTC (B) efterfulgt af SRB-assayet. Dataene er en repræsentant for fire uafhængige forsøg. C og D, sensibilisering indeks for PZ-39 (C) sammenlignet med FTC (D) i HEK293 /ABCG2 celler. HEK293 /ABCG2 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af mitoxantron i fravær eller nærvær af forskellige koncentrationer af PZ-39 efterfulgt af SRB-assayet. Dataene er en repræsentant for fire uafhængige forsøg. E, multidrug overfølsomhed indeks PZ-39 i narkotikarelaterede valgt MCF7 /AdVp3000 celler. MCF7 /AdVp3000 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af adriamycin (ADR), camptothecin (CPT) eller mitoxantron (MX) i nærværelse af DMSO (vehikel), 200 nM PZ-39, eller FTC efterfulgt af SRB-assayet. Sensibilisering indeks blev beregnet under anvendelse IC

50 af mitoxantron i fravær eller nærvær af PZ-39 eller FTC. De viste data er gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg.

For yderligere at undersøge den inhibitoriske aktivitet af PZ-39 om ABCG2, virkningerne af PZ-39 på mitoxantron cytotoksicitet i HEK293 /ABCG2 celler blev vurderet i nærvær af tre forskellige koncentrationer af PZ-39 (50, 200, og 500 nM) eller vehikelkontrol (0,1% DMSO). Som vist i fig. 3C, NM PZ-39 ved 50 væsentligt reduceret IC

50 af mitoxantron med en sensibilisering indeks på 0,4 (tabel 2). Ved 500 nM, sensibilisering indeks for PZ-39 er 0,04 hvorimod den for FTC ved den samme koncentration er 0,26 (fig. 3D og tabel 2). Disse resultater viser, at PZ-39 er en meget potent roman ABCG2 hæmmer.

For at undersøge om PZ-39 kan vende ABCG2-medieret multiresistens i et lægemiddel resistent cancer cellelinje, vi brugte narkotikarelaterede valgt MCF7 /AdVp3000 celler og testet yderligere to anticancerlægemiddel substrater af ABCG2, Adriamycin og camptothecin. Som vist i fig. 3E, PZ-39 ved 200 nm drastisk reduceret modstand MCF7 /AdVp3000 til Adriamycin og Camptothecin ligner mitoxantron, hvorimod kontrol FTC viste meget mindre sensibilisering effekt for alle tre lægemidler sammenlignet med PZ-39 ved den samme koncentration.

To virkemåder

for at forstå den mekanisme af PZ-39 handling hæmme ABCG2-medieret lægemiddel transport, vi først undersøgt kinetikken for PZ-39 hæmning hjælp isoleret inside-out membranvesikler [16] . Vi bestemt ændringen i mitoxantron optagelse i tilstedeværelse af forskellige koncentrationer af PZ-39. Som vist i Lineweaver-Burk plot (fig. 4A), Km og Vmax på mitoxantron transport i fravær af PZ-39 blev estimeret til at være 2,3 pM og 455 pmol /mg protein. Det fremgår, at både Km og Vmax på mitoxantron transport er blevet reduceret i nærværelse af PZ-39 med en anslået Ki på ~0.52 uM, hvilket antyder, at PZ-39 opfører sig som en blandet type inhibitor af mitoxantron transport [17]. Fordi det var også oprindeligt spekuleret på, at nogle hæmmere ville konkurrere med ATP-bindingsstedet på ABCG2 transportør, udførte vi et andet eksperiment under anvendelse af ATP som varierende substrat. Som vist i fig. 4B, både kilometer og Vmax af mitoxantron transport blev også ændret af PZ-39. Således viste vores undersøgelse, at processen med mitoxantron transport og ATP-binding kan hæmmes af PZ-39 med en blandet type mekanisme. Sandsynligt, PZ-39 binder til et andet sted på ABCG2 fra både mitoxantron og ATP, ikke kompetitiv inhibitor af den ene af dem.

Inde-out plasma membran vesikler fra HEK293 /ABCG2 celler blev inkuberet med 0,6, 1,2 og 1,8 uM [

3H] mitoxantron (A) eller med 0,1, 0,2, 0,5, 1 og 5 mM ATP sammen med 0,6 uM [

3H] mitoxantron (B) i fravær eller tilstedeværelse af forskellige koncentrationer af PZ-39 ved 37 ° C i 5 minutter efterfulgt af bestemmelse af mitoxantron optagelse. De viste data er gennemsnit ± standardafvigelse. af tre uafhængige forsøg.

Vi næste testet hvis PZ-39 muligvis inhiberer ABCG2 oligomerisering siden ABCG2 er blevet foreslået at fungere som en homodimer eller højere former for oligomerer og oligomerisering kan anvendes som mål for terapeutisk lægemiddel udvikling [2], [3]. Til dette formål co-immunoudfældning af to differentielt mærkede ABCG2 blev udført som tidligere beskrevet [2] efter en 6-timers behandling med PZ-39 ved 3,3 uM. Imidlertid var ingen effekt af PZ-39 om ABCG2 co-immunopræcipitation fundet (supplerende fig. S1), hvilket tyder på, at PZ-39 ikke påvirker ABCG2 oligomerisering.

For yderligere at undersøge mekanismen for PZ-39 effekt på ABCG2, udførte vi en Western blot-analyse af ABCG2 ekspression efter PZ-39 behandling. Som vist i fig. 5A, steady state niveau af ABCG2 protein drastisk faldet på 1 dag efter PZ-39 behandling. Men, det havde kun marginalt fald på 2 timer efter PZ-39 behandling. Som beskrevet ovenfor, PZ-39 var i stand til at inhibere ABCG2-medieret mitoxantron udstrømning af lægemiddelresistente celler med 1 h inkubation. Disse resultater tyder på, at PZ-39 kan have to virkningsmekanismer ved at hæmme aktiviteten (akut effekt) og udtryk (kronisk effekt) af ABCG2 og i overensstemmelse med vores observation, at PZ-39 er omkring 3 gange bedre end FTC i narkotika ophobning assay ( akut effekt), men ca. 7 gange mere potente i stof sensibilisering assay (kronisk effekt).

A, effekt af PZ-39 om ABCG2 steady state niveau. HEK293 /ABCG2 celler blev behandlet med DMSO vehikel eller 3,3 uM PZ-39 i forskellige tidsrum og høstet til Western blot-analyse af ABCG2 ekspression. B, effekt af PZ-39 på ABCG2 stabilitet. HEK293 /ABCG2 celler blev først behandlet med cycloheximid (5 ug /ml) efterfulgt af tilsætning af 3,3 uM PZ-39 eller DMSO i forskellige tidsrum og høstet til Western blot-analyse. C, halveringstid på ABCG2. ABCG2 niveauer på western blot som vist i B blev bestemt under anvendelse Scion Image og afbildet mod tiden for behandling. De viste data er gennemsnit ± standardafvigelse af fire forsøg. D, effekt af PZ-39 om 5D3 farvning af ABCG2. HEK293 /ABCG2 celler blev behandlet uden (tynd linie) eller med (tyk linje) DMSO-vehikel, 10 uM PZ-39 eller FTC efterfulgt af farvning med monoklonalt antistof 5D3 og flowcytometri-analyse. E, effekt af FTC på ABCG2 udtryk. HEK293 /ABCG2 celler blev behandlet med 10 pM FTC i forskellige tidsrum og høstet til Western blot-analyse af ABCG2 ekspression. F, effekt af bafilomycin A

1 og MG-132 på PZ-39-induceret ABCG2 nedbrydning. HEK293 /ABCG2 celler blev behandlet med 3 uM PZ-39 i fravær eller nærvær af 10 nM bafilomycin A

1 eller 2 pM MG-132 i forskellige tidsrum og høstet til Western blot-analyse af ABCG2 ekspression. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol i alle western blot-analyser.

For at bestemme om den kroniske effekt af PZ-39 om ABCG2 udtryk er på mRNA-niveauet, udførte vi real-time RT-PCR-analyse af MCF7 /AdVp3000 og HEK293 /ABCG2 celler behandlet med PZ-39 i forskellige tidsrum op til 3 dage. Ingen signifikant ændring blev fundet i ABCG2 mRNA-niveau efter PZ-39 behandling i enten cellelinie (se supplerende fig. S2). Således PZ-39 næppe påvirker ABCG2 ekspression på dets mRNA-niveau. Vi næste hypotese at mekanismen for PZ-39-medieret inhibering ville være en posttranskriptionel proces og undersøgt den mulighed, at PZ-39 kan accelerere nedbrydningen af ​​ABCG2. For at teste denne mulighed, HEK293 /ABCG2 celler blev forbehandlet med cycloheximid, som virker ved at inhibere forlængelse under proteinsyntese, efterfulgt af behandling med PZ-39 i forskellige tidsrum for at bestemme ABCG2 nedbrydningshastighed. Som vist i fig. 5B, tabet af ABCG2 i celler behandlet med en kombination af PZ-39 og cycloheximid var meget hurtigere end for kontrolgruppen behandling uden PZ-39. Halveringstiden af ​​ABCG2 i nærvær af PZ-39 anslås til -5 hrs det er stabilt med en estimeret halveringstid på ~54 timer i kontrolgruppen (fig. 5C). Således PZ-39 sandsynligvis accelererer nedbrydningen af ​​ABCG2 protein.

Effekt af PZ-39 om ABCG2 kropsbygning og stabilitet

Den accelererede nedbrydning af ABCG2 af PZ-39 kan skyldes, at PZ -39 inducerer konformationel forandring og målrette ABCG2 for nedbrydning. For at bestemme om PZ-39 potentielt forårsager konformationsændringer af ABCG2 anvendte vi det monoklonale antistof 5D3, der tidligere er blevet rapporteret at binde til ABCG2 på celleoverfladen lettere i nærvær af ABCG2 inhibitorer formodentlig på grund af inhibitor-induceret konformationelle ændringer [12] , [18]. Som vist i fig. 5D, PZ-39 forårsagede en stigning i 5D3-farvning, hvilket antyder en mulig konformationel ændring af ABCG2 upon PZ-39-binding. FTC øgede også 5D3 farvning som forventet. Men var det ikke påvirke niveauet for ABCG2 (fig. 5E), hvilket tyder på, at den konformationsændring fremkaldt af FTC og PZ-39 kan være forskellige. Det er blevet rapporteret for nylig, at der findes to forskellige mekanismer for nedbrydning af vildtype og mutant ABCG2 proteiner [19]. Mens vildtype og korrekt foldet protein nedbrydes i lysosomer, er mutanten og fejlfoldet protein involveret i ubiquitinmedieret proteinnedbrydning i proteasomer. For yderligere at bestemme mekanismen af ​​PZ-39-induceret ABCG2 nedbrydning, anvendte vi bafilomycin A

1, en inhibitor af proteinnedbrydning i lysosomer, og MG-132, en proteosom inhibitor. Som vist i fig. 5F, co-behandling af celler med bafilomycin A

1 og PZ-39 inhiberede PZ-39-induceret ABCG2 nedbrydning hvorimod samtidig behandling med MG-132 og PZ-39 ikke gjorde det, hvilket indikerer, at PZ-39-induceret ABCG2 nedbrydning sandsynligvis lysosom-afhængig. Tilsammen konkluderer vi, at PZ-39 forårsager konformationsændring af ABCG2 og mål det for normal nedbrydning i lysosomer.

Effekt af PZ-39 om ABCB1- eller ABCC1-medieret drug transport

Til bestemme specificiteten af ​​PZ-39, testede vi virkningen af ​​PZ-39 på de to andre vigtige ABC transportører er velkendte inden MDR, ABCB1 og ABCC1. Virkningen af ​​PZ-39 om ABCB1 og ABCC1-medieret fald i intracellulær Adriamycin akkumulering blev testet under anvendelse MCF7-celler transficeret med ABCB1 (BC19) [20], og HEK293-celler transficeret med ABCC1 (HEK293 /ABCC1) [16], [21 ]. Vi fandt ingen effekt af PZ-39 på aktiviteten af ​​ABCB1 og ABCC1 i aftagende Adriamycin akkumulering (se supplerende fig. S3A). Vi fandt heller ikke nogen effekt af PZ-39 om steady state proteinniveau af ABCB1 og ABCC1 efter 3 dages behandling (Fig. S3B). Således sandsynligt PZ-39 er specifik for ABCG2 blandt disse tre kendte MDR-forårsager ABC transportører, der menes at spille en vigtig rolle i klinisk resistens stof.

Effekt af PZ-39 analoger på ABCG2

for bedre at forstå farmakoforen af ​​PZ-39, vi pågrebet 3 analoger af PZ-39 til akkumulering og modstand analyser ved hjælp HEK293 /ABCG2 celler sammenlignet med PZ-39. Disse analoger (C6, C8, og E2) har alle de samme intakte ringene A, B og C som PZ-39, men med forskellige side grupper (fig. 1). Alle tre analoger havde lignende aktivitet som PZ-39 i styrkelsen mitoxantron akkumulation (fig. 6A) og sensibiliserende mitoxantron modstand i HEK293 /ABCG2 (Fig. 6B). For at bestemme den kroniske effekt af disse analoger på ABCG2 ekspression, udførte vi en Western blot-analyse efter behandling med C6, C8, og E2 i forskellige tidsrum op til 3 dage. Som vist i fig. 6C, alle tre analoger forårsagede reduceret ekspression af ABCG2. Desuden er alle disse analoger forårsagede også konformationsændringer i ABCG2 ligner PZ-39 (fig. 6D). Således sandsynligt benzothiazolen knyttet til en triazinring rygrad kan være kernestrukturen for binding til og inhibering ABCG2 funktion og stabilitet.

A, virkninger af PZ-39 og dets analoge forbindelser (3 uM) på mitoxantron akkumulering i HEK293 /ABCG2 celler. De viste data er gennemsnit ± standardafvigelse. for tredobbelte eksperimenter. B, overfølsomhed indeks for PZ-39 og beslægtede forbindelser i HEK293 /ABCG2 celler. HEK293 /ABCG2 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af mitoxantron i fravær eller nærvær af 50 nM PZ-39, C6, C8, og E2 efterfulgt af SRB-assayet. Sensibilisering indeks blev beregnet under anvendelse IC

50 af mitoxantron i fravær eller nærvær af sammensatte inhibitorer. Dataene er gennemsnit ± standardafvigelse. af fire uafhængige forsøg. C, effekt af udvalgte PZ-39 og beslægtede forbindelser på ABCG2 steady state niveau. HEK293 /ABCG2 celler blev behandlet med DMSO vehikel eller 3 pM PZ-39, C6, C8, eller E2 i forskellige tidsrum og høstet til Western blot-analyse af ABCG2 ekspression. D, effekt af PZ-39 og beslægtede forbindelser på 5D3-farvning af ABCG2. HEK293 /ABCG2 celler blev behandlet uden (tynd linie) eller med (tyk linie) DMSO køretøjer, 10 pM PZ-39 eller dens tilknyttede forbindelser C6, C8 og E2 efterfulgt af farvning med monoklonalt antistof 5D3 og flowcytometri analyse.

diskussion

i denne undersøgelse undersøgte vi en hidtil ukendt potent specifik inhibitor af human ABCG2, PZ-39, som et potentielt terapeutisk middel til at sensibilisere lægemiddelresistens ved cancer kemoterapi. PZ-39 indeholder benzothiazol knyttet til en triazinringen rygrad. Dets virkningsmekanisme synes at være i to tilstande; blandet type hæmning i stof transport funktion og accelereret lysosomer-afhængige nedbrydning af ABCG2. PZ-39 er ikke cytotoksisk sig med en IC

50 . 24 uM og samtidig være meget potent i sensibiliserende MDR af kræftceller overudtrykker ABCG2

Mange tidligere rapporteret ABCG2 hæmmere har en bredspektret af ABC transporter-mål. ABCG2 inhibitor GF 120918, for eksempel i virkeligheden inhiberer ABCB1 funktion mere potent end ABCG2. Indtil nu har meget få forbindelser blevet identificeret som specifikke inhibitorer af ABCG2. Et sådant eksempel er den ikke-toksiske FTC-derivat, Ko143. Det er mere potent end andre FTC analoger, og har ingen toksicitet hos mus ved 10-50 mg /kg oral dosis [10]. For nylig, to af flavon forbindelser, 6-prenylchrysin og tectochrysin, er blevet vist at være specifik for ABCG2 og ingen interaktion blev påvist med enten ABCB1 eller ABCC1 [22]. Brug high throughput screening, Henrich et al. fundet flere forbindelser, der har lignende eller mindre hæmmende aktivitet sammenlignet med FTC [11], [12]. Men ingen af ​​disse rapporterede specifikke ABCG2 inhibitorer er blevet testet klinisk.

Sammenlignet med nogle af fortiden kendte specifikke ABCG2 inhibitorer, såsom FTC, den hidtil ukendte forbindelse PZ-39 har tre markante fordele. Første, PZ-39 er meget mere potent end FTC inhibering ABCG2 funktion. I lægemiddelakkumulering assay PZ-39 klart opnået samme grad af inhibering ved 3,3 uM i forhold til FTC ved 10 uM. I celle overlevelse assay, PZ-39 ved 500 nm var i stand til at bevidstgøre ABCG2-medieret mitoxantron modstand med et indeks på 0,04 mens FTC i samme koncentration har en overfølsomhed indeks på 0,26, -7-fold forskel. For det andet, PZ-39 har meget lav indre cytotoksicitet in vitro ( 24 uM), men dets styrke indeks er meget bedre end FTC (1600 versus 62). Således kan vinduet af terapeutiske indeks for PZ-39 være store. En ideel kemo-sensitiverende er, at det ikke bør være toksisk selv. Det er klart, PZ-39 opfylder dette krav i in vitro undersøgelser. Imidlertid behov fremtidige undersøgelser for at evaluere toksiciteten af ​​PZ-39 i dyremodeller. Tredje, vises PZ-39 at have to virkningsmekanismer. Ud over sin evne til at inhibere ABCG2 aktivitet, PZ-39 også accelererer sin lysosom-afhængige nedbrydning. Denne anden virkningsmekanisme er et særpræg og klart forøger styrken af ​​PZ-39 om ABCG2 muligvis ved recirkuleret anvendelse af PZ-39. Denne natur er ikke blevet rapporteret for eventuelle tidligere kendte ABC transportør hæmmere.

De to virkemåder gør PZ-39 en meget interessant, roman, og lovende ABCG2 inhibitor for yderligere udnyttelse. I den første modus af akut virkning på ABCG2 funktion, PZ-39 synes at udøve en blandet type inhibering i lægemiddeloptagelse assay. PZ-39 kan interagere med ABCG2 direkte, men synes ikke at konkurrere direkte med mitoxantron eller ATP binding. Fremtidige studier er nødvendige for at identificere de PZ-39 bindingssteder i ABCG2. I den anden tilstand, PZ-39 synes at accelerere ABCG2 nedbrydning i lysosomer, en kronisk virkning. Det er muligt, at binding af PZ-39 forårsager konformationel ændring i ABCG2 som er rettet mod det til nedbrydning i lysosomer. Det er imidlertid bemærkelsesværdigt, at binding af FTC forårsager også ABCG2 konformationsændring men det gør ikke accelerere ABCG2 nedbrydning. Dette fund tyder på, at den konformationelle ændring induceret af PZ-39 og FTC kan være forskellige. Tidligere har det vist sig, at cystein-mutant ABCG2 nedbrydning er via proteosom mens den normale nedbrydning af vildtype ABCG2 er via lysosomer [19] med en halveringstid på ~37 hrs [23]. Det har også vist sig, at agonist-induceret nedbrydning af β

2-adrenerge receptor er via lysosomer eventuelt ved forøget endocytosis [24]. Det er fristende at foreslå, at bindingen af ​​PZ-39 til ABCG2 er i stand til at accelerere endocytose og handel med celleoverfladen ABCG2 i lysosomer for nedbrydning. Omfattende bestræbelser på yderligere at evaluere denne hypotese pågår i øjeblikket i vores laboratorium.

De analoger af PZ-39, C6, C8 og E2 med den samme kerne struktur alle synes at arbejde ved hjælp af den samme mekanisme som PZ-39. Det er klart, vil yderligere undersøgelser være påkrævet for at afprøve flere analoger af PZ-39 med flere ændringer på kernen benzothiazol knyttet til en triazinring rygrad og at belyse struktur-aktivitetsforhold af PZ-39 i ABCG2 inhibering. Ikke desto mindre er observationerne fra denne undersøgelse viser klart, at PZ-39 kan tjene som en lead-stof til yderligere design og optimering af mere specifikke ABCG2 hæmmere til bedre behandling af lægemiddelresistente humane kræftformer i multikombinerbare terapi.

Materialer og metoder

Materialer

Det monoklonale antistof BXP-21 mod ABCG2, anti-Myc og anti-HA-antistoffer var fra ID Labs, Cell Signaling og Roche henholdsvis. Monoklonalt antigody mod Pgp, C219, var en slags gave fra Dr. Victor Ling (The British Columbia Cancer Center, Vancouver, Canada). Monoklonalt antistof mod MRP, MRPr1, blev indkøbt fra Kamiya Biomedical Company. Biotin-konjugeret 5D3-antistof og phycoerythrin-streptavidin-konjugater var fra eBiosciences. Alle elektroforese reagenser, proteinkoncentration assay kit, præfabrikerede polyacrylamidgradientgeler og polyvinylidendifluorid-membraner blev fremskaffet fra Bio-Rad. FTC, adriamycin, mitoxantron, camptothecin, DTT, sulforhodamin B (SRB), og Triton X-100 var fra Sigma. Protein-G PLUS-agarose og SYBR Green PCR Master Mix var fra Santa Cruz Biotechnology og Applied Biosystems, hhv. LipofectAMINE Plus og G418 var fra Invitrogen. Cellekulturmedium IMEM, DMEM, og [

3H] mitoxantron var fra BioSource International, Media Tech., Og Moravek Biokemisk hhv. PZ-39 og tre beslægtede forbindelser blev indkøbt fra specs. Alle andre kemikalier var af molekylærbiologisk kvalitet fra Sigma eller Fisher Scientific.

cellekultur lysat, og membranpræparater

human brystcancer MCF7 (ATCC) og dets derivater linjer BC19 (a gave fra Julie Horton ved National Institute of Environmental Health Sciences) og MCF7 /AdVp3000 (en gave fra Susan Bates ved National Cancer Institute), HEK293 /ABCC1, HEK293 /vektor, HEK293 /ABCG2 blev dyrket som tidligere beskrevet [2], [16 ], [20], [25]. Lysat præparat blev udført som tidligere [25] beskrevne. Cellemembraner blev fremstillet på nøjagtig samme måde som tidligere beskrevet [16] og den endelige membraner blev resuspenderet i STB’er (250 mM sucrose, 150 mM NaCl, 10 mM Tris /HCl, pH 7,5).

Western blot , immunpræcipitation, og flowcytometri

Western blot, immunoudfældning, og flowcytometri analyse på akkumulering blev udført nøjagtigt som vi tidligere beskrevet [2], [3]. For at bestemme mekanismen af ​​ABCG2 nedbrydning blev HEK293 /ABCG2 cellerne først behandlet med 10 nM bafilomycin A

1 eller 2 uM MG132 i 24 timer efterfulgt af yderligere behandling med 3 uM PZ-39 i forskellige tidsrum. Cellelysater blev derefter opsamlet for western blot analyse af ABCG2. For at bestemme halveringstiden af ​​ABCG2 blev HEK293 /ABCG2 celler behandlet med 5 ug /ml cycloheximid, 3 pM PZ-39, eller begge i forskellige tidsrum efterfulgt af opsamling af cellelysater Til Western blot-analyse af ABCG2 ekspression. For at bestemme ændringen i antistof 5D3-farvning efter behandling med inhibitorer, blev HEK293 /ABCG2 celler inkuberet med 10 pM PZ-39, C6, C8, E2, eller FTC ved 37 ° C i 30 minutter før biotinkonjugeret 5D3-antistof (1: 100 fortynding) blev tilsat og inkuberet i 2 timer. Derefter blev cellerne vasket 3 gange og inkuberet med phycoerythrin-streptavidin i 30 minutter efterfulgt af vask i 3 gange og analyseret ved flowcytometri.

Real time RT-PCR og Cytotoksicitetsassay

RNA ekstraktion og real-time RT-PCR blev udført som vi beskrev tidligere [25]. Sekvenserne af ABCG2 primere er 5′-GGCTTTCTACCTGCACGAAAACCAGTTGAG-3 ‘(fremad) og 5′-ATGGCGTTGAGACCAG-3′ (revers). Sekvenserne af GAPDH primere er 5’-AAGGACTCATGACCACAGTCCAT-3 ‘(fremad) og 5′-CCATCACGCCACAGTTTCC-3’ (revers). Den relative ABCG2 RNA-niveauet (2

ACt) behandlet med inhibitorer blev udtrykt som procent af kontrol (i nærværelse af 0,1% DMSO) hvor ACt (tærskel cyklus) = (CT

ABCG2-CT

GAPDH ).

Cytotoksicitet blev bestemt under anvendelse SRB kolorimetrisk assay som tidligere beskrevet [25]. Virkningen af ​​forbindelse inhibitorer på lægemiddelresistens blev bestemt ved at eksponere cellerne for en række koncentrationer af anticancer lægemidler, såsom mitoxantron i fravær eller nærvær af forskellige koncentrationer af inhibitoren. Styrken og overfølsomhed indeks over inhibitorer blev beregnet som følger:

Drug ophobning og transportere kinetisk analyse

Drug ophobning assay blev udført som tidligere [16] beskrevet, [26] med visse modifikationer. Kort fortalt 10

6 celler i kultur blev præinkuberet med forskellige koncentrationer af PZ-39, FTC, eller vehikelkontrol (0,1% DMSO) i 1 time ved 37 ° C, efterfulgt af tilsætning af 20 uM mitoxantron og inkubering i 30 min. Reaktionen blev stoppet ved tilsætning af iskold PBS og centrifugering, vasket med iskoldt PBS og underkastet analyse af flowcytometri.

Drug-uptake assay under anvendelse af membranvesikler blev udført som vi tidligere beskrevet [16] ved brug af [

3H] mitoxantron som ABCG2 substrat. Kinetiske analyser blev udført ved anvendelse data genereret i nærværelse af forskellige koncentrationer af [

3H] mitoxantron, ATP og PZ-39 til frembringelse af Lineweaver-Burk-plot. Kinetic konstanter kilometer, Vmax, og Ki blev beregnet under anvendelse af procedurer som beskrevet tidligere [27].

Støtte Information

Figur S1.

Virkning af PZ-39 på ABCG2 oligomerisering.