PLoS ONE: Diabetes Fremmer DMH-induceret Kolorektal Cancer ved at øge aktiviteten af ​​glycolytiske enzymer i Rats

Abstrakt

Formålet med dette studie var at undersøge sammenhængen mellem diabetes mellitus og kolorektal carcinogenese samt mulig mekanisme er involveret i denne interaktion. Diabetes rottemodeller blev induceret med en lav dosis af STZ efterfulgt af en lav dosis af DMH til at inducere kolorektal cancer. Dannelsen af ​​ACF i colon og forekomsten, antal og størrelse af tumorer blev målt. Aktiviteten af ​​glycolytiske enzymer i colon væv blev også målt. Resultaterne viste, at både det samlede antal ACF og antallet af foci, der indeholder et andet antal krypter blev forhøjet i diabetiske rotter. Ved afslutningen af ​​den eksperimentelle behandling blev forekomsten, antal og størrelse af tumorer også steget i diabetiske rotter. Samlet indikeret disse data, at diabetes øget risikoen for tyktarmskræft. Aktiviteten af ​​HK og PK i colon væv blev øget i diabetiske rotter, hvorimod aktiviteten af ​​PDH blev nedsat. Desuden er aktiviteter af disse enzymer i intratumor var højere end i peritumor. Disse data viste, at den høje glycolysen kan spille en rolle i kolorektal carcinogenese i diabetiske rotter

Henvisning:. Jia Y, Xu G, Zhou W, Wang Z, Meng L, Zhou S, et al. (2014) Diabetes Fremmer DMH-induceret Kolorektal Cancer ved at øge aktiviteten af ​​glycolytiske enzymer i rotter. PLoS ONE 9 (10): e110455. doi: 10,1371 /journal.pone.0110455

Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA

Modtaget: Juni 4, 2014, Accepteret: 12. september 2014 Udgivet: 17 oktober 2014

Copyright: © 2014 Jia et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af The Natural Science Foundation of Shandong-provinsen (2009ZRB01346). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft er en fælles gastrointestinale maligne tumorer. Det er den tredje mest almindelige kræftform og den tredje hyppigste årsag til kræft død hos mænd og kvinder i USA [1], [2]. I de senere år, med forbedring af levestandarden og livsstilsændringer, er forekomsten af ​​kolorektal cancer steget år for år i udviklingslandene. Flere lignende risikofaktorer er blevet fundet mellem diabetes mellitus og kolorektal cancer. Disse omfatter en “vestlig livsstil”, med kost lavt i frugt og grøntsager eller fiber og højt indhold af fedt og kogt kød, samt begrænsede fysisk aktivitet [3], [4]. Epidemiologiske fund til dato har vist, at type 2-diabetes mellitus er tæt knyttet til den øgede risiko for colorectal cancer [3] – [8]. Men nogle resultater ikke stemmer overens med denne forening, fordi diabetes mellitus er en gruppe af komplekse metaboliske sygdomme karakteriseret ved hyperglykæmi. Adskillige forstyrrende faktorer, herunder varighed af diabetes, varierende niveauer af metabolisk kontrol, brug af forskellige lægemidler til terapi, og den mulige tilstedeværelse af kroniske komplikationer, komplicere nøjagtig vurdering af kræftrisikoen hos diabetespatienter. Desuden kan forskellige epidemiske faktorer fra forskellige lande, etniske grupper og regioner påvirke sammenhængen mellem diabetes og kræft [3], [7], [9].

De mulige mekanismer involveret i diabetes mellitus-relateret kræft kan være forbundet med langvarig insulinresistens og hyperinsulinæmi, som er blevet grundigt beskrevet til dato [10] – [13]. Hyperinsulinæmi kan påvirke forekomsten og udviklingen af ​​tarmkræft gennem en række forskellige mekanismer. En unormal stigning af insulin og insulin-lignende vækstfaktor-1 (IGF-1) i serum kan føre til forekomsten af ​​tumorer ved at fremme omdannelsen og proliferation af colorektale epithelceller, påvirker cellecyklussen og inhibere celle apoptose [10] . Patienter behandlet med insulin i lang tid har en højere risiko for kræft, og med den stigende varighed insulinbehandling, kan forekomsten af ​​kræft øges [12], [13]. Alligevel er det muligt, at en særlig faktor kan påvirke risikoen for tyktarmskræft både ved at påvirke koncentrationerne af insulin og gennem andre mekanismer [14], [15].

I nærværelse af oxygen, de fleste celler primært metaboliserer glucose til pyruvat via glykolyse og derefter fuldstændig oxidere pyruvat til carbondioxid gennem citronsyre cyklus. Imidlertid tumorceller generere så meget som 60% af deres ATP gennem glycolysen, og den glycolytiske sats af tumorceller er op til 200 gange højere end for normale celler, uanset nærvær eller fravær af oxygen [16], [17] . Dette fænomen, anerkendes cirka syv årtier siden, er kendt som Warburg virkning. Dette fænomen er forårsaget af unormal ekspression af mange glycolytiske enzymer. Flere vigtige enzymer, såsom hexokinase (HK) og pyruvatkinase (PK) vides at spille en afgørende rolle i at initiere og opretholde den høje glucose katabolisme af hurtigt voksende tumorer [18], [19]. PK er også blevet rapporteret at bidrage til akkumuleringen af ​​mellemprodukter med glycolyse for følgende anabolske processer: syntese af nukleinsyrer, aminosyrer og phospholipider [20]. PK formidler en vækst fordel for tumorceller, især under hypoxiske betingelser.

De vigtigste elementer i diabetes mellitus er hyperglykæmi og dysfunktion af glukosemetabolismen. På grund af hyperglykæmi, er permeabiliteten af ​​kapillærkar faldet, og de mitokondriske enzymer, der er relateret til glucose metabolisme blev hæmmet [21], således at carbon metabolisme af oxidativ phosphorylering inhiberes. Hos diabetespatienter, kan normale celler med en lav glykolyse ikke skaffe nok energi fra glukose metabolisme og kan dø. celler med en høj glycolyse, kan imidlertid kompensere for beskadigelse af enzymer i mitokondrier og generere mere ATP gennem glycolysen at opretholde den hurtige proliferation og transformation af normale celler til tumorceller. Flere vigtige enzymer og proteiner involveret i glucosemetabolisme hos diabetiske rotter blev undersøgt ved mansor et al. [22]. Aktiviteten af ​​PDH, et stærkt reguleret enzym af mitokondriel glucosemetabolisme, og glucosetransporter 4 (GLUT4) var faldet betydeligt. PDH inhibitor pyruvatdehydrogenase-kinase 4 (PDK4) niveauet blev forøget. Disse resultater viste den lave oxidativ phosphorylering i mitokondrier i diabetiske rotter.

I den foreliggende undersøgelse blev diabetes induceret i Sprague-Dawley (SD) rotter under anvendelse STZ, efterfulgt af induktion af colorektal cancer ved hjælp DMH. Vi søgte at afgøre, om type 2-diabetes mellitus var forbundet med risiko for kolorektal cancer hos rotter, og de mulige mekanismer involveret i denne proces.

Materialer og metoder

Reagenser

STZ, DMH og methylenblåt blev indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO). Kommercielle kits til immunfarvning af PCNA var fra Beijing Zhongshan Goldbridge Biotechnology Co. (Beijing, Kina). Assay-kits til påvisning aktiviteter hexokinase (HK) og pyruvatkinase (PK) blev indkøbt fra Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kina).

Dyr

Sixty Sprague-Dawley ( SD) rotter (160-180 g) blev købt fra Vital floden Laboratory Animal Technology Co Ltd (Beijing, Kina). Alle rotter blev opstaldet i standard polypropylen bure (3 rotter /bur) og holdt i et rum under standardiserede betingelser (22 ± 3 ° C, 12 timer lys /12 timer mørke, luftfugtighed 50 ± 10%) med fri adgang til foderpiller og postevand. Dyrene får lov at akklimatisere i 1 uge på foder og vand. Rotterne blev tilfældigt opdelt i fire grupper på 15 dyr hver: (1) kontrolgruppen; (2) STZ-gruppe; (3) DMH-gruppe; og (4) STZ + DMH gruppe. Rotterne i kontrolgruppen og DMH gruppe blev forsynet med en normal pille kost (NPD), og dem i STZ-gruppen og STZ + DMH gruppe blev forsynet med en fedtrig kost (HFD). Sammensætningen og udarbejdelse af HFD (tabel 1), blev som tidligere beskrevet [23]. Legemsvægten af ​​rotter blev målt en gang om ugen. Alle undersøgelser blev udført med godkendelse af dyret eksperimentelle etik bedømmelsesudvalg Shandong University School of Medicine.

Udvikling af diabetes model

Efter 2 måneder af kosten manipulation, rotterne i STZ-gruppe og STZ + DMH gruppe blev injiceret intraperitonealt (ip) med en lav dosis af STZ (35 mg /kg legemsvægt; STZ blev opløst i 0,1 mol /l citronsyre-buffer, pH 4,4), mens rotterne i kontrolgruppen gruppe og DMH gruppe blev givet et køretøj citratbuffer (pH 4,4) i et volumen på 1 ml /kg, ip Blodprøver blev udtaget umiddelbart før og 1 uge efter injektion af STZ eller dets vehikel fra halevenen efter faste i 24 timer.

Udvikling af colorektal cancer

To uger efter injektion af vehikel eller STZ, rotterne i interventions- grupper blev injiceret (ip) med enten DMH (25 mg /kg legemsvægt; DMH blev opløst i normalt saltvand) eller 0,9% NaCl gang om ugen i 12 uger. En uge efter den sidste injektion af DMH blev fem rotter fra hver gruppe aflivet efter faste i 24 timer for ACF identifikation. Blodprøver blev opsamlet ved hjertepunktur. Colonvæv blev opsamlet og delt i to dele. En del blev opbevaret i flydende nitrogen til påvisning af aktiviteten af ​​enzymer, og den anden del var til observation af ACF. Tolv uger efter den sidste injektion blev de resterende rotter aflivet ved beregning af tumorincidensen, gennemsnitlige antal tumorer og tumorvolumen. Derefter blev colonvæv høstet og delt i to dele. En del blev opbevaret i flydende nitrogen til påvisning af aktiviteten af ​​enzymer, og den anden side blev fikseret i 4% paraformaldehyd i patologi analyse. Alle dyrene blev aflivet ved CO

2-kvælning

blodparametre

Blodprøver blev opsamlet og centrifugeret ved 1000 g i 10 min for at indsamle serummet, som blev opbevaret ved. – 20 ° C indtil analyse. Fasteblodsukkerniveauet (FBG) -niveauer blev målt ved glucoseoxidasemetoden (GOD, Applygen Technologies Inc., Beijing, Kina). Serumkoncentrationen af ​​triglycerid (TG), total cholesterol (TC), low-density lipoprotein kolesterol (LDL-C), og høj densitet lipoprotein kolesterol (HDL-C) blev bestemt ved anvendelse af en automatiseret biokemisk analysator (TOSHIBA-40FR). Serum insulin (INS) koncentrationer blev målt ved anvendelse af enzymkoblet immunosorbentassay (ELISA) kits ifølge producentens protokol (Cusabio, Wuhan Huamei Biotech Co. Ltd, Wuhan, Kina).

Identifikation af ACF

ACF blev identificeret som beskrevet tidligere. Kort fortalt blev koloner høstet og vasket med 0,01 mol /l PBS efterfulgt af fiksering i 4% neutral-pufret paraformaldehyd i 24 timer. Colon væv blev farvet i 0,5% opløsning af methylenblåt i 5 minutter, efterfulgt af en skylning vask. Det samlede antal ACF og antallet af afvigende krypter (ACs) i hvert fokus blev talt under et lysmikroskop (40 ×).

Beregning af tumorincidensen, antal og volumen

Tumor forekomst er antallet af rotter, som tumorer blev udviklet i tyktarmen væv med gentagne injektioner af DMH under hele eksperimentet processen. Rotterne at tumorer blev visualiseret i almindelighed ved grov undersøgelse i colon vævet ved afslutningen af ​​eksperimentet var indikerer tumorbærende rotter. Tumoren incidens, gennemsnitlige tumor nummer og tumorstørrelse blev beregnet ved hjælp af følgende formler [24]:

Histologisk analyse og prolifererende Cell (PCNA) farvning

Normalt kolon væv, colon tumor og væv støder op til tumorer blev høstet og fikseret i 4% neutral-pufret paraformaldehyd i 24 timer. Vævene indlejret i paraffin blev skåret i 4-um sektioner på histologi objektglas og farvet for hematoxylin og eosin (HE) -farvning og PCNA immunfarvning under anvendelse af et streptavidin-biotin-immunperoxidase kompleks metode (et kommercielt kit) ifølge producentens instruktioner. Brown-gul farvede kerner blev betragtet som positive. Til bestemmelse af den proliferative indeks blev fem høj effekt linse (HP) synsfelter (200 celler hver), der består af i alt 1000 celler tælles. Den proliferative indeks (PI) blev udtrykt som procentdelen af ​​PCNA-positive kerner blandt det totale antal celler talt.

Assay af enzymaktivitet

Enzymaktiviteterne blev målt i både peritumoral og tumorale regioner. Hvis der ikke blev fundet nogen tumorer, blev vævsprøverne dissekeret tilfældigt. Frosset væv (0,1 g) blev homogeniseret i et glas-homogenisator med 0,9 ml normalt saltvand. For at bevare aktiviteten af ​​enzymer, blev hele formalingsproces udført på is. Aktiviteten af ​​hexokinase (HK), pyruvat kinase (PK) og pyruvat dehydrogenase (PDH) blev målt.

Statistiske Analyser

Alle resultater blev præsenteret som middel ± S.E.M. og alle P-værdier er rapporteret er to-tailed og P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. For parametre med Gauss fordeling, sammenligninger kropsvægt mellem hver to grupper og også mellem NPD-fodret og HFD-fodret rotter, den ‘antal ACF “, den” tumorer /Alle rotter’, ‘Tumorer /tumorbærende rotter “og” volumen af ​​tumorer «mellem DMH og STZ + DMH gruppe, enzymer aktiviteter mellem peritumoral og intratumoral og tillige mellem to grupper blev alle udført ved anvendelse af uparret Students t-test. Tumorincidens blev sammenlignet under anvendelse af Chi square test. Dataanalyse blev udført ansætte den statistiske pakke for samfundsvidenskab, udgave 18 (SPSS Software, SPSS Inc., Chicago, USA).

Resultater

Fysiske parametre

Den tid forløbet af eksperimentet er vist i figur 1. en uge efter begyndelsen af ​​eksperimentet, én rotte i kontrolgruppen døde uventet. På grund af en alvorligt vægttab, en rotte i STZ + DMH-gruppen døde også 3 uger før tumor observation.

STZ blev administreret som 35 mg /kg, i.p. og DMH blev administreret som 25 mg /kg /uge, i.p. Forkortelserne angiver STZ: streptozotocin; DMH: 1,2-dimethylhydrazin; ACF:. Afvigende krypt foci

Figur 2 illustrerer, at kropsvægten af ​​alle rotter holdes stigende over de to måneder protokol, og fodring af HFD resulterede i en statistisk signifikant stigning i kropsvægt i forhold til NPD -fed rotter (413,68 ± 2,76 vs. 370,90 ± 4,69, P 0,05). Efter injektion af STZ, legemsvægt rotter i kontrolgruppen og STZ gruppe holdes stigende under hele forsøgets varighed, og vægten af ​​de i STZ gruppe er steget hurtigere end i kontrolgruppen. Men sammen med injektion af DMH, legemsvægten af ​​rotter begyndte at falde, og vægten af ​​de i STZ + DMH gruppe faldt hurtigere end dem i DMH gruppe. Ved afslutningen af ​​eksperimentet blev legemsvægt rotter i STZ gruppe er steget betydeligt i forhold til kontrolgruppen (581,82 ± 4,88 vs. 515,07 ± 2,76, P 0,05). I modsætning hertil DMH-induceret (DMH gruppe og STZ + DMH gruppe) vægte blev reduceret sammenlignet med dem for kontrolgruppen (461,25 ± 7,68 eller 357,24 ± 9.14 vs. 515,07 ± 2,76, P 0,05), og summen af ​​rotter i den STZ + DMH gruppe var lavere end i DMH-gruppen (357,24 ± 9.14 vs. 461,25 ± 7,68, P 0,05)

Værdier er udtrykt som middelværdi ± SEM. og analyseret under anvendelse af uparrede Students t-test ved P 0,05. Ved afslutningen af ​​eksperimentet, * P 0,05 over kontrolgruppen.

# P. 0,05 vs. DMH gruppe

Serologisk analyse

Blood biokemiske indekser (FBG, TG, TC, HDL-C, LDL-C, INS) var målt umiddelbart før og en uge efter injektion af vehikel eller STZ (tabel 2). Serum FBG-niveauer samt TG, LDL-C og INS blev alle signifikant forøget i HFD-rotter sammenlignet med NPD-rotter før injektionen af ​​STZ (P 0,05, henholdsvis). Der var imidlertid en reduktion af HDL-C (0,41 ± 0,02 vs. 0,51 ± 0,03, P 0,05). Injektion af STZ resulterede i en signifikant stigning af FBG, TG, TC og LDL-C associeret med en signifikant reduktion af HDL-C. Endvidere selvom injektionen af ​​STZ frembragte en reduktion af INS niveau i HFD-rotter (72,86 ± 3,75 versus 89,72 ± 2,62, P 0,05), niveauet af INS var stadig betydeligt højere end den for i NPD-fodrede rotter (72,86 ± 3,75 vs. 30,90 ± 3,28, P 0,05).

ACF observation

Efter 12 ugers DMH injektion blev colon ACF identificeret i DMH gruppen og STZ + DMH-gruppe (figur 3), men ikke i kontrolgruppen og STZ-gruppe. Uparret Students t-test blev anvendt til at påvise forskellen mellem DMH gruppe og STZ + DMH gruppe. Som vist i tabel 3, det samlede antal ACF i STZ + DMH-gruppen var signifikant højere end i DMH-gruppen (230,80 ± 8,85 vs. 141.00 ± 5,26, P 0,05). Antallet af foci indeholdende 1 krypt, 2 krypter og ≥3 krypter blev også signifikant forøget. I STZ + DMH gruppe, antallet af foci indeholdende mere end 3 krypter var endnu højere end for foci indeholdende 2 krypter (74.60 ± 3.11 vs. 45,40 ± 1,57, P 0,05). Desuden blev nogle væv, der ligner tumor findes i STZ + DMH gruppe (figur 3F).

Fig. 3A: normal krypt foci (100 ×). Fig. 3B: Crypt udvidelse og deformation (40 ×). Fig. 3C: ACF dannet af 2 afvigende krypter (40 ×). Fig. 3D: ACF dannet af 3 afvigende krypter (40 ×). Fig. 3E: ACF dannet af ≥3 afvigende krypter (40 ×). Fig. 3F:. Tumor-lignende væv (40 ×)

Forekomst, antallet og omfanget af colon tumorer

Ved afslutningen af ​​forsøget blev alle rotterne aflivet (10 i DMH gruppen og 9 i STZ + DMH gruppe). Syv rotter i DMH-gruppen og otte i STZ + DMH gruppe blev fundet at have tumorer (tabel 4). Forekomsten af ​​tumorer i STZ + DMH-gruppen var højere end i DMH-gruppen, men forskellen nåede ikke nået statistisk signifikans (88.89% vs. 70,00%, P 0,05). Volumenet af tumorer, det samlede antal tumorer og gennemsnitligt antal tumorer i STZ + DMH gruppe blev signifikant forøget sammenlignet med den i DMH-gruppen (P 0,05, henholdsvis). Volumenet af de største tumor fundet i STZ + DMH gruppen nåede til 665,5 mm

3, men den mindste i denne gruppe var kun 6 mm

3. I modsætning hertil volumenet af de største tumor i DMH gruppen var kun 75 mm

3, og den mindste var kun 4 mm

3 (figur 4). Tumorerne vækst i tarmlumen forstyrret afføring, hvilket resulterer i svært afføring og opbygning af tarmluft i nogle rotter (figur 4D).

Fig. 4A: Den største tumor opnået fra STZ + DMH gruppe. Fig. 4B: Flere små tumorer sammen isoleret fra DMH gruppen. Fig. 4C: Adskillige tumorer indsamlet fra en rotte i STZ + DMH gruppe. Fig. 4D:. Tumorvækst i tarmlumen forstyrrer afføring, hvilket resulterer i vanskelige afføring og bygning af gas i tarmen i nogle rotter

Proliferation indeks for kolorektale tumorceller

PCNA var stærkt udtrykt i DMH-induceret colon-tumorceller, især i DMH + STZ-gruppe. Som vist i figur 5, spredning indeks (PI) i DMH + STZ-gruppen var signifikant højere end i DMH-gruppen (84,5 ± 6,72 versus 52,3 ± 5,58, P 0,05). Disse data indikerede, at DMH behandling fremmes signifikant celleproliferation, der blev fremskyndet af STZ-induceret diabetes.

PI blev udtrykt som procentdelen af ​​PCNA-positive kerner blandt det totale antal talte celler. Værdier er udtrykt som middelværdi ± S.E.M. og analyseret under anvendelse af uparrede Students t-test ved P 0,05. * P. 0,05 vs. DMH gruppe

Analyse af glycolytiske enzymer

Ingen tumordannelse blev påvist i kontrolgruppen og STZ-gruppe, hvorfor disse colon vævsprøver blev dissekeret tilfældigt . I DMH gruppen og STZ + DMH gruppe blev colon prøver indsamlet fra peritumoral og intratumorale regioner henholdsvis. Aktiviteterne i HK, PK og PDH i colon væv blev målt og vist i figur 6.

Ingen tumordannelse blev påvist i gruppen og STZ gruppe Kontrol, så dissekere prøverne tilfældigt. Prøver blev indsamlet fra intratumoral og peritumorale regioner henholdsvis i DMH-gruppen og STZ + DMH gruppe. Aktiviteterne af hexokinase (HK), pyruvatkinase (PK) og pyruvatdehydrogenase (PDH) i colon væv blev målt. Værdier er udtrykt som middelværdi ± S.E.M. og analyseret under anvendelse af uparrede Students t-test ved P 0,05. Fig. 6A: Analyse af HK. * P 0,05 over kontrolgruppe.

# P 0,05 vs. Peritumor hhv.

$ P 0,05 vs. DMH gruppe henholdsvis; Fig. 6B: Analyse af PK. * P 0,05 over kontrolgruppe.

# P 0,05 vs. Peritumor henholdsvis; Fig. 6C: Analyse af PDH. * P 0,05 over kontrolgruppe.

# P 0,05 vs. Peritumor hhv.

$ P 0,05 vs. DMH gruppe hhv. Fig. 6D: Analyse af HK, PK og PDH aktiviteter på forskellige tidsforløb i STZ + DMH gruppe. * P 0,05 vs. Startpunkt hhv.

# P. 0,05 vs. STZ injektion henholdsvis

Som vist i figur 6A, aktiviteter HK i intratumorale væv i DMH-gruppen og STZ + DMH gruppe var signifikant steget i forhold til at i peritumorale væv og de normale væv (herunder kontrolgruppen og STZ-gruppe, P 0,05, henholdsvis). Aktiviteten af ​​HK i STZ gruppen var også højere end i kontrolgruppen og de peritumorale væv i DMH-gruppen (61,26 ± 1,57 vs. 44,61 ± 1,48 og 48,01 ± 1,70, P 0,05, henholdsvis). Uanset den intratumoral eller peritumoral placering, HK aktivitet i STZ + DMH-gruppen var højere end i DMH-gruppen (P 0,05, henholdsvis).

aktiviteter PK (figur 6B) i intratumoral væv af tyktarmen i DMH gruppen og STZ + DMH gruppe var alle signifikant steget i forhold til, at i de peritumorale væv og var også højere end kontrolgruppen (P 0,05, henholdsvis). Der blev imidlertid ikke forskel i intratumorale væv fundet mellem DMH gruppe og STZ + DMH gruppe. Aktiviteten af ​​PK i STZ-gruppen var højere end i kontrolgruppen (111,42 ± 4,10 vs. 82,40 ± 4,96, P 0,05) og var højere end de peritumorale væv i STZ + DMH gruppe uden at nå statistisk signifikans (P 0,05). Aktiviteten af ​​PK i de peritumorale væv i STZ + DMH gruppen var højere end kontrolgruppen (102,66 ± 4,68 vs. 82,40 ± 4,96, P 0,05), men ingen forskel blev observeret mellem kontrolgruppen og de peritumorale væv i DMH gruppe

En væsentlig reduktion af PDH-aktivitet (figur 6C) er fundet i diabetiske rotter sammenlignet med kontrolgruppen. (1,34 ± 0,05 vs. 2,32 ± 0,05, P 0,05). Desuden blev aktiviteten af ​​PDH i intratumoral væv faldet betydeligt i sammenligning med de peritumorale væv (P 0,05, henholdsvis). Både i de introtumoral og peritumorale væv, aktiviteten af ​​PDH i STZ + DMH-gruppen var signifikant lavere end DMH (P 0,05, henholdsvis).

Fire punkter i tidsforløbet af eksperimentet blev udvalgt til angiver ændringerne i disse tre enzymer aktivitet i STZ + DMH gruppe (figur 6D). Ingen rotter blev aflivet ved startpunktet og DMH injektion punkt, og data for disse to punkter blev erstattet af dataene i kontrolgruppen og STZ-gruppe ved afslutningen af ​​eksperimentet henholdsvis. Som vist i figur 6D, blev aktiviteterne i HK og PK alle steget betydeligt, efter at type 2-diabetes blev induceret (62,26 ± 2,06 vs. 44,61 ± 1,48, 100,79 ± 1,49 vs. 80,54 ± 4,27, P 0,05). Betragtninger, var der en reduktion i aktiviteten af ​​PDH (1,34 ± 0,05 vs. 2,32 ± 0,05, P 0,05). Desuden viste de nuværende resultater, at gentagne DMH injektion resulterede i en yderligere stigning i HK og PK og reduktion i PDH aktiviteter (P 0,05, henholdsvis).

Diskussion

Et af de vigtigste mål ifølge den foreliggende arbejde var at bestemme, om type 2 diabetes mellitus kan øge risikoen for colorectal cancer i en dyremodel. Det andet mål var at undersøge de mulige mekanismer involveret i denne proces. Derfor blev aktiviteterne i HK, PK og PDH i colorektale væv målt for at vurdere bidraget af metaboliske ændringer i processen af ​​tumorigenese. Således blev vores indledende forsøg rettet mod at generere en model af type 2-diabetes, der ville nøje afspejle den naturlige historie og metaboliske egenskaber for menneskelig type 2 diabetes, hvorefter kolorektal cancer blev induceret ved hjælp DMH.

dyremodel for type 2-diabetes blev induceret ved anvendelse af højt fedtindhold fodring i kombination med en lav dosis af STZ (35 mg /kg). Mansor et al. har rapporteret, at denne model ikke blot kunne replikere patologien af ​​human diabetes, men også efterligne sygdomsprocessen, men dosen af ​​STZ skal vælges med omhu [22]. Diabetiske rotter induceret af forskellige doser af STZ (15, 25, 35, 45 og 55 mg /kg) kombineret med HFD blev undersøgt af K. Srinivasan et al. [23]. De metaboliske forandringer som følge af højere doser af STZ (45 og 55 mg /kg) lignede type 1-diabetes fænotype. I modsætning hertil lave doser af STZ (15 og 25 mg /kg) ikke producere væsentlig hyperglykæmi. Derfor HFD i kombination med en lav dosis af STZ (35 mg /kg) var den mest ønskelige metode til at inducere type 2-diabetes. I vores undersøgelse, efter 2 måneders diæt, de HFD-fodret rotter var allerede mildt hyperglykæmiske og kropsvægten steg hurtigt som følge af indtagelse af en kost rig på energi i form af mættet fedt i forhold til NPD-fodret rotter. I mellemtiden, øget niveau af INS betydeligt i forhold til de NPD-fodret grupper. Disse data viste, at HFD-fodret rotter allerede havde rejst insulinresistens med kompenserende hyperinsulinæmi [25]. Efter injektionen af ​​STZ, blev niveauet af blodet biokemiske indices i HFD-fodret grupper alle signifikant forøget, undtagen for HDL-C og INS. Reduktionen af ​​INS kan skyldes ødelæggelse af pancreas-beta-celler ved injektion af STZ [26], [27], men niveauet af INS var stadig højere end for NPD-fodrede rotter. Som Srinivasan demonstreret, de forhøjede koncentrationer af glucose var relativt stabile i denne model, som kan anvendes til langtidsundersøgelser på diabetiske komplikationer [23].

I den foreliggende undersøgelse, at DMH-induceret colon carcinogenese model blev anvendt til vurdering af risikoen for kræft i diabetiske rotter i lyset af dannelsen af ​​ACF og tumorhyppighed. Mohania D et al, med succes udviklet en kolorektal cancer model med denne agent [28]. ACF blev valgt som et mellemprodukt biologisk evaluering indeks i patogenesen af ​​colorektal cancer. ACF henviser til unormal ændring af den normale foci. Greaten af ​​foci, epitel fortykkelse, og foci med flere eller multiple mutationer samlet sammen i et samlingspunkt fordeling er kendetegn for ACF [29] – [32]. Både hos gnavere eller mennesker, i patogenesen af ​​colorektal cancer induceret af kræftfremkaldende stoffer, ACF er præcancerøse læsioner i colorektal cancer og anses for at være gode biologiske markører til vurdering af virkningen af ​​lægemidler, der anvendes til at forhindre og kontrollere dannelsen af ​​kolorektal cancer i rotter [32], [33]. Rodrigues et al. påvist, at DMH-induceret kolorektal cancer model i rotter er en gyldig værktøj til at undersøge sammenhængen af ​​ACF med kolorektal cancer. ACF kan betragtes som tidlige morfologiske markører i patogenesen af ​​veldifferentierede tumorer i colon carcinogenese [32]. Resultaterne af denne undersøgelse viste, at antallet af ACF og antallet af foci indeholdende forskellige antal krypter i STZ + DMH gruppe steg sammenlignet med DMH gruppe. I DMH gruppen, 89,4% ACF haft en eller to krypter, og kun 10,6% ACF havde tre eller flere krypter. Men i STZ + DMH gruppe, forekomsten af ​​ACF med en eller to krypter var 67,7% og 32,3% havde tre eller flere krypter. I modsætning hertil STZ gruppe havde ingen ACF formation. Epidemiologiske fund har vist, at forekomsten af ​​kolorektal cancer hos diabetespatienter var tæt relateret til diabetes varighed. Således har vi udledes, at der er behov for en meget længere tid for rotter i STZ-gruppen for at udvikle ACF. Den betydelige stigning i foci indeholdende ≥3 krypter og påvisning af tumor-lignende væv i STZ + DMH gruppen, at tilstedeværelsen af ​​diabetes mellitus afkortet varighed tumorigenese. I overensstemmelse, Zaafar et al. har rapporteret, at diabetes fremmer størrelsen af ​​cellen og de inflammatoriske reaktioner i mucosale lag som lymfoid proliferation, overbelastning af blodkar og fibrose [34]. I slutningen af ​​vores nuværende undersøgelse blev tumorer fundet både i DMH gruppen og STZ + DMH gruppe. Forekomsten, antal og størrelse af tumorer i STZ + DMH koncernen steg sammenlignet med DMH gruppe. I modsætning hertil blev der ikke tumorer fundet i STZ-gruppe. Betragtninger, blev ingen læsioner generelt visualiseret ved grov undersøgelse i Zaafar undersøgelse [34]. Forskellige dyr blev udvalgt i forsøgene kan være den mulig forklaring på dette fænomen. Mus blev anvendt i deres eksperiment mens rotter blev udvalgt i vores undersøgelse. Forskellen på legemsstørrelse kan afspejle størrelsen af ​​tumoren, så tumorer var vanskelige at visualisere i mus colonvæv. Der var imidlertid ingen signifikant forskel i forekomsten af ​​tumorer mellem STZ + DMH gruppe og DMH gruppe i aktuelle resultat. Mulige forklaringer på dette fænomen kan omfatte begrænsede stikprøvestørrelse, med kun 15 rotter i hver gruppe. Samlet disse data viste, at diabetiske rotter har en høj risiko for tyktarmskræft.

Hurtig spredning er det vigtigste element af tumorceller. Prolifererende cellekerneantigen (PCNA) er et DNA klemme, der fungerer som en processivitet faktor for DNA-polymerase δ i eukaryote celler og er essentielt for replikation. Bostick et al. har rapporteret, at ekspressionen af ​​PCNA er tæt forbundet med spredning af cellen i colon væv og kan anvendes som en meget pålidelig indikator til at vurdere spredning dynamik tumorcelle [35]. Den foreliggende undersøgelse viste, at PCNA blev højt udtrykt i alle tumorvæv og at ekspressionen af ​​PCNA blev forøget i colon ACF sammenlignet med normale intestinale kirtler. PCNA-ekspression kan afspejle cellulær proliferation aktivitet og anvendes som en pålidelig indeks til vurdering kinetikken for tumorcelleproliferation. Vores resultater viste, at PCNA blev udtrykt i DMH-induceret coloncancer-celler, og den stærkeste proliferation aktivitet blev observeret i DMH + STZ-gruppe. Disse data indikerede, at STZ behandling kunne fremme DMH-induceret celleproliferation.

Forrige hypotese om de mulige mekanismer involveret i DM-relateret cancer var unormal stigning af insulin-lignende vækstfaktor-1 (IGF-1) og