PLoS ONE: Beviser for Epithelial-Mesenchymale Transition in Cancer Stamceller af hoved og hals planocellulært Carcinoma

Abstrakt

Indledning, vækst, gentagelse, og metastase af hoved og hals pladecellecarcinomer (HNSCC) har været relateret til opførslen af ​​kræft stamceller (CSC), der kan identificeres ved deres aldehyd-dehydrogenase-isoform-1 (ALDH1) aktivitet. Vi kvantificeres og beriget ALDH1

+ celler i HNSCC cellelinjer og efterfølgende karakteriseret deres fænotypiske og funktionelle egenskaber som invasion kapacitet og epitelial-mesenkymale overgang (EMT). Sfæroid kultur beriget CSC fra fem HNSCC cellelinier med op til 5 gange. I sfæroid-afledte celler (SDC) og den parentale monolag-afledte cellelinie ALDH1, CD44, CD24, E-cadherin, α-SMA, og vimentin ekspression blev sammenlignet ved flow-cytometri og immunofluorescens sammen med proliferation og cellecyklus-analyse. Invasion aktivitet blev evalueret af Matrigel assay og udtryk for stemness-relaterede transkriptionsfaktorer (TF) Nanog, Oct3 /4, Sox2 og EMT-relaterede gener Snail1 og 2, og Twist af real-time PCR. Alle cellelinier dannet sfæroider, der kunne selv forny og være serielt igen passerede. ALDH1 udtryk var signifikant højere i SDC. ALDH1

+ -celler viste øget koloni-dannelse. Andelen af ​​celler med et formodet CSC markør konstellation af CD44

+ /CD24

– var meget variabel (0,5% til 96%) i monolags- og sfæroide kulturer og overlappede i 0% -33% med CD44

+ /CD24

– /ALDH1

+ celle delmængde. SDC havde signifikant højere invaderende aktivitet. mRNA af stemness gener Sox2, NANOG, og Oct3 /4 blev øget betydeligt i SDC af alle cellelinjer. Twist var signifikant forøget i to, mens Snail2 viste en betydelig stigning i den ene og et signifikant fald i SDC af to cellelinier. SDC havde en højere G0 fase andel, viste ekspression på højt niveau af α-SMA og vimentin, men faldt betydeligt E-cadherin ekspression. HNSCC-linjer havnen potentiale CSC, kendetegnet ved ALDH1 og stemness markør TF udtryk samt egenskaber som invasiv, ubevægelighed, og EMT. CSC kan beriges ved forankringsuafhængige kultur teknikker, som kan være vigtige for efterforskningen af ​​deres bidrag til terapi modstand, tumor tilbagefald og metastase

Henvisning:. Chen C, Wei Y, Hummel M, Hoffmann TK, Gross M, Kaufmann AM, et al. (2011) Bevis for Epithelial-Mesenchymale Transition i Cancer Stamceller af hoved og hals pladecellecarcinom. PLoS ONE 6 (1): e16466. doi: 10,1371 /journal.pone.0016466

Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania, USA

Modtaget: September 20, 2010; Accepteret: December 20, 2010; Udgivet: 27 Januar 2011

Copyright: © 2011 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev finansieret udelukkende af penge fra Charite-Universitätsmedizin. Ingen eksterne finansieringskilder for denne undersøgelse blev anvendt. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

HNSCC udgør ca. 6% af alle kræfttilfælde og for ca. 650.000 nye tilfælde og 350.000 dødsfald på verdensplan hvert år [1], [2], [3]. Fremskridt i terapi har forbedret livskvalitet, men overlevelsesrater er uændrede i de seneste årtier. Dødeligheden af ​​denne sygdom er fortsat høj på grund af udviklingen af ​​fjernmetastaser og fremkomsten af ​​lokale og systemiske gentagelser resistente over for kemo- og strålebehandling. Det er derfor vigtigt at udvikle en dybere forståelse af biologi denne sygdom for at udvikle mere effektive behandlingsmetoder.

Beviser er for nylig blevet akkumulere at støtte hypotesen om, at tumorer indeholder en lille subpopulation af celler, der kaldes kræft stamceller celler (CSC), som udviser selvfornyende kapacitet og er ansvarlige for tumor vedligeholdelse og metastase [4]. CD44

+ /CD24

-celler er blevet først foreslået at udvise CSC-egenskaber i brystcancer [5].

Efterfølgende CD133 fandtes at identificere CSC i hjernetumorer [6], colorektal carcinom [7], og pankreatisk carcinom [8]. I HNSCC, Prins et al. først vist, at en CD44

+ cellepopulation besidder egenskaberne af CSC [9], men relativt høje antal af disse celler ( 5000 celler) var nødvendig for at generere nye tumorer i immundefekte mus indikerer enten en lav frekvens af CSC eller en lav specificitet CD44 som CSC-markør i HNSCC. Sidstnævnte hypotese understøttes af den observation, at CD44s og CD44v6 udtryk ikke skelner normalt fra godartet eller ondartet epitel af hoved og hals. CD44s og CD44v6 var rigeligt til stede i langt de fleste af celler i hoved og hals væv, herunder carcinomer [10]. Således identifikation af mere specifikke CSC markører for HNSCC er ønskelig. For nylig blev høj aldehyddehydrogenase 1 (ALDH1, også kendt som ALDH1A1) aktivitet vist at identificere CSC i HNSCC og andre epiteliale cancere [11], [12], [13], [14], [15]. Men i brystkræft den ALDH1

+ befolkning viser, en overraskende lille overlap med den tidligere beskrevne CD44

+ /CD24

– fænotype på kun 0,1-1,2%. Interessant nok i brystcancer de celler, der bærer begge fænotyper syntes at være yderst tumorigene, at kunne generere tumorer fra så få som 20-celler [15]. Det skal stadig bestemmes, om den samme fænotypiske mønster af stamceller i HNSCC er forbundet med en tilsvarende tumorigent potentiale.

Ikke-adhærente sfære assays stigende grad til at vurdere stamcelle-aktivitet i normalt væv og formodede CSC. Neurosfæren er den bedst undersøgte sfære assay. Centralnervesystemet celler dyrket på ikke-klæbende overflader giver anledning til neurosfærer der har kapacitet til selv-fornyelse og kan i princippet generere alle celletyper i hjernen [16], [17]. Kapaciteten til gentagen generering af neurosfærer fra enkelte celler er generelt betragtet som bevis for selvfornyelse [18]. For nylig blev det beskrevet, at sfæroid-afledte celler (SDC) fra gliosarcoma rotte cellelinier besidder CSC kapacitet [19]. Indtil videre er det uvist, om kugleformede kulturer af HNSCC kan berige for CSC.

Normale bloddannende stamceller er i stand til at forny sig selv og give anledning til alle blod celletyper. De er ikke eller meget langsomt delende celler og opholde sig knoglemarv nicher i en sovende tilstand. Evnen til at opretholde denne ikke-delende tilstand, eller med andre ord, ophold i G0 fase af cellecyklussen, kaldes ubevægelighed [20]. Det er blevet foreslået, at CSC deler mange egenskaber med normale stamceller da størstedelen af ​​dem også bør forblive hvilende og være i stand til selv at forny. Fordi størstedelen af ​​anti-cancer medicin målretter aktivt dividere (cykling) celler, hvilende CSC forblive i live og kan være årsag til tilbagefald og progression af cancer. Ki-67-antigenet er det prototypiske cellecyklus relaterede kerneprotein, udtrykt af prolifererende celler i alle faser af den aktive cellecyklus (G1, S, G2 og M-fase), men det er fraværende i hvilende (G0) celler.

en anden evne CSC er at udføre epitel-mesenkymale overgang (EMT), et vigtigt skridt i løbet af embryogenese [21], [22], [23] og sårheling [24]. De seneste oplysninger tyder på, at genetiske programmer er relevante for EMT også forbigående aktiveres i epitel kræft spiller en rolle i udviklingen af ​​kræft, hvorigennem epitelial kræft invadere væv og metastaserer. Selvom EMT program er nødvendig for normal udvikling, det uregelmæssige aktivering af EMT bidrager til forskellige patologiske betingelser, herunder fibrose og carcinoma progression [25], [26]. Under EMT epitelceller nedbryde celle-celle- og celle-ekstracellulær matrix kontakter og migrere til andre steder i kroppen [27]. Under cancer progression, EMT synes at give cancerceller med kapacitet til at infiltrere det omgivende væv og i sidste ende metastaserer til fjerne steder [28]. For nylig er det blevet rapporteret, at induktion af EMT i differentierede immortaliserede humane mammae epitelceller førte til købet af CD44

+ /CD24

– stamcelle fænotype [29]. Endvidere blev det vist, at disse formodede CD44

+ /CD24

– CSC isoleret fra neoplastiske menneskelige bryst væv udtrykte høje mRNA-niveauer, der koder for EMT-associerede markører Snail1 (SNA), Snail2, og Twist. Ondartede tumorer består af kræftceller og tumor-associerede værtsceller, hvor sidstnævnte tiltrækker mere interesse for nylig på grund af deres deltagelse i tumor invasion og metastase, og terapeutisk respons [30], [31]. Myofibroblaster er de vigtigste komponenter i tumorstroma. Alligevel oprindelsen af ​​disse celler forbliver kontroversiel hidtil. Ekspressionen af ​​a-glat muskulatur actin (α-SMA) betragtes markør af de fuldstændigt differentierede myofibroblaster. Ny dokumentation viser, at myofibroblasts kan afledes af epitelial (tumor) celler via EMT [32], [33]. Denne ide understøttes af den iagttagelse, at kompakte sfæroider dannet af ovariecancerceller i ascites display kontraktile adfærd, besidder høj invaderende kapacitet in vitro og ekspressionen af ​​α-SMA, som også er forbundet med høj kontraktile kapacitet [34].

i det foreliggende arbejde, vi testede, hvis forankringsuafhængige celledyrkningsteknikker tillader generering af sfæroid-kulturer, og hvis disse kulturer blev beriget for celler med funktionelle og fænotypiske egenskaber, der kendetegner CSC of HNSCC. Her giver vi bevis for, at myofibroblasts kan afledes fra HNSCC anvendelse af en sfæroid cellekultur model, der beriger for CSC-lignende celler som karakteriseret ved en høj andel af ALDH1 positivitet, proliferativ ubevægelighed og invasive kapacitet.

Resultater

HNSCC cellelinjer indeholder celler med selvfornyende kapacitet, der danner tumor spheroids

Flere forskellige tilgange har været anvendt til at identificere CSC. Strategien anvendt til vores eksperimenter blev in vitro-sfæroid kolonidannelse metode. Vi undersøgte evnen hos fem HNSCC-afledte cellelinier (UD-SCC1, UT-SCC22, UM-SCC11B, UT-SCC9, UT-SCC24A) at vokse forankring uafhængigt som sfæroid-kulturer. Celler blev udpladet ved en densitet på 20.000 /ml. Efter in vitro-dyrkning i 5-10 dage i serumfrit medium under adhærerende betingelser, alle undersøgte cellelinjer dannet sfæroider, der spænder fra 50 til 500 celler pr sfæroide (figur 1A). Den selvfornyende kapacitet i disse tumor sfæroider blev vurderet ved hjælp af den metode, publiceret af Ghods et al [19]. Kort fortalt blev sfæroiderne opsamlet og dissocieret til en enkelt cellesuspension, der efterfølgende blev udpladet ved en klonal densitet på 1.000 celler pr. Tumor subspheroids spænder fra 20 til 40 celler var tydelige efter 10 til 14 dage (figur 1B, C). I modsætning hertil har forældrenes monolag cellekulturer dyrket under de samme betingelser ikke danne sfæroider hvis forgyldt på denne lave koncentration, selv efter 21 dage. Når sfæroiderne blev overført tilbage til en almindelig vævskulturkolbe coatet i monolag cellekultur sfæroiderne klæbet til kolben, og cellerne voksede ud fra sfæroid og dannede et konfluent monolag. Fænotypen af ​​disse celler var identisk med de parentale cellelinier (figur 1D).

Repræsentative billeder af cellelinien UD-SCC1 er vist. (A) Den første generation af sfæroider. (B) A subspheroid dannet efter podning i en koncentration på 1.000 celler /ml. (C) En sfæroide dannet i det 21. generation. (D) Sfæroide klæber og voksende til sammenflydning efter genudplade ind kolber overtrukket for vævskultur. (E) Parental cellelinie dyrket permanent som et monolag kultur.

Fænotypisk karakterisering af SDC

udtryk for den formodede stamceller markør ALDH1 i SDC og den respektive forældrenes monolag cellelinje anvendt som kontrol blev sammenlignet med CD44

+ /CD24

– udtrykkende population af flerfarvet FACS-analyse

Interessant alle SDC havde et øget antal ALDH1 positive celler i sammenligning med parentale cellelinjer. (figur 2). Den højeste andel af ALDH1

+ -celler blev fundet i sfæroider genereret fra UD-SSC1 cellelinie (46,4 ± 8,1%), som var 5 gange højere end den tilsvarende parentale cellelinje (9,4 ± 5,3%).

(A) repræsentative FACS-analyse af to cellelinier efter Aldefluor farvning. Sammenligning af frekvenser af ALDH1 positive celler i monolag til SDC og DEAB kontrol. DEAB er en specifik hæmmer af ALDH1. (B) Resultaterne repræsenterer et udtryk for ALDH1 i celler fra kugleformede kulturer (afdækkede kolonner) sammenlignet med monolag celler (åbne søjler). ALDH1 ekspression af SDC er generelt signifikant forøget (A, B). UD-SCC22, UT-SCC24A, og UM-SCC11B viser en delvis mesenkymale fænotype har allerede relativt høj ALDH1 udtryk i forældrenes cellelinjer. (** P 0,01, * p 0,05)

Tumor celler med en CD44

+ /CD24

– fænotype viste sig at have CSC ejendomme i en række solide tumorer. [4]. Vi har derfor også undersøgt forholdsvis CD44 og CD24-ekspression i HNSCC cellelinier og fandt, at andelen af ​​CD44

+ /CD24

– celler er meget variabel (0,5-97%). Overlappet med ALDH1

+ celler var lille (0-2,2%) med undtagelse af de to cellelinjer UM-SCC11B og UT-SCC22 som havde et overlap på ca. 33% og blev komponeret til over 95% af CD44

+ /CD24

– celler. Interessant er andelen af ​​CD44

+ /CD24

– blev celler ikke konsekvent beriget af sfæroidet dyrkningsmetode (tabel 1). Dette resultat rejste spørgsmålet, hvor godt ALDH1 er egnet til identifikation af celler med CSC egenskaber i HNSCC. At gribe dette spørgsmål blev ALDH1 positive og negative celler fra sfæroiderne genereret fra cellelinierne UT-SCC9 og UD-SCC1 adskilt af FACS-sortering. Efterfølgende blev deres evne til kolonidannelse vurderet. UT-SCC9 og UD-SCC1 blev valgt, fordi sammenlignet med de andre cellelinjer de genererede flere sfæroider med højere berigelse af ALDH1

+ -celler. Dataene viser, at ALDH1

+ celler kan danne på 3 til 4 gange flere kloner end ALDH1

– celler (figur 3). Lys mikroskopisk observation efter 2 uger viste, at de er dannet af ALDH1 kloner

+ celler i gennemsnit indeholdt 197 (197 ± 47) celler sammenlignet med 33 (33 ± 16) celler i kloner genereret fra ALDH1

– celler (p 0,01). Vore data viser også, at enkelt ALDH1

+ celler signifikant bedre kan regenerere en sfæroid i en forankringsuafhængig kultur med serum-frit medium suppleret med bFGF og EGF (UT-SCC9: 17,1%, UD-SCC1: 19,3%), mens under de samme betingelser enkelt ALDH1

– celler regenereret kun i ét tilfælde en sfæroide. (Tabel 2, figur S1).

To tusinde ALDH1-sorterede celler blev podet og efter 14 dage blev kolonier, der dannede kvantificeret. Den ALDH1

+ delpopulation i UD-SCC1 og UT-SCC9 cellelinjer har en højere klon formation effektivitet i forhold til ALDH1

– delpopulation (** p 0,01).

sammenfattende SDC genereret fra HNSCC linjer udtrykker høje niveauer af den formodede CSC markør ALDH1, danner betydeligt flere kloner, som også væsentligt regenererer oftere i sphæroider derefter ALDH1

– celler og har en varierende overlapning med CD44

+ /CD24

-. befolkning

SDC show steget invaderende kapacitet in vitro

Central til definitionen af ​​CSC er evnen til at igangsætte og drive væksten i primær tumor og af invasion og metastase. Et tæt samarbejde mellem procentdelen af ​​celler med CSC fænotype (CD44

+ /CD24

-) i den primære tumor og udvikling af metastaser i brystkræft blev for nylig rapporteret [35]. Også indikation for metastatiske potentiale af celler med CSC-fænotype i brystkræft kommer fra den iagttagelse, at brystkræftceller detekteret i knoglemarven overvejende viste denne fænotype [36].

Analogt til denne observation, vi spurgte, om CSC afledt af kugleformede kulturer af HNSCC vise en lignende invasive potentiale. Ved at anvende en Matrigel invasion kammer, sammenlignede vi invaderende kapacitet af celler, enten rejst i sfæroid eller monolagskultur. SDC fra alle fem testede cellelinier viste en signifikant forøget invaderende kapacitet på 2,1 til 8.6 gange over forældrekontrol (figur 4).

Matrigel invasion kamre blev anvendt til at sammenligne invaderende kapaciteten mellem celler afledt fra sfæroider (skraveret kolonner) eller monolag (åbne søjler). SDC fra alle cellelinjer undersøgte show højere invaderende aktivitet in vitro end monolag-afledte celler. (** P 0,01, * p 0,05).

Overekspression af stemness-relaterede gener i SDC

Det blev rapporteret, at Oct4, Sox2, og Nanog, der danner en selvorganiseret kerne af transkriptionsfaktorer (TF), vedligeholde pluripotens og selv-fornyelse af humane embryonale stamceller [37], [38]. Vi ønskede at vide, om CSC også dele denne funktion i TF udtryk med embryonale stamceller (ES). Til dette formål har vi kvantitativt sammenlignet mRNA ekspression af disse TF mellem SDC og parentale monolag-afledte celler. Vi fandt, at mRNA-niveauer af Oct3 /4, Sox2, og Nanog alle blev væsentligt forøget i SDC. Den største stigning blev observeret i UT-SCC22, hvor en 52-fold forøgelse i Sox2 ekspression blev fundet i sfæroider. Den mindste ændring blev fundet i UT-SCC9, hvor en 1,23 ganges forøgelse i Oct3 /4-ekspression blev fundet i sfæroider. Nøglen TF involveret i EMT, Snail1 var også signifikant forøget i alle SDC genereret fra de fem forskellige HNSCC cellelinier. Interessant to andre TF involveret i EMT, Snail2 og Twist, viste en ekspressionsmønster i overensstemmelse med CD24-status. I UD-SCC1, UT-SCC9, og UT-SCC24A hvor de fleste af cellerne er CD44

+ /CD24

+, det Snail2 niveau faldt i sfæroider mens Twist viste ingen signifikant ændring. Men i UT-SSC22 og UM-SCC11B, som blev komponeret til over 95% af CD44

+ /CD24

– celler Snail2 og Twist, viste en signifikant stigning (figur 5). Disse iagttagelser medførte, at Snail2 og Twist ekspressionsniveauet blev korreleret til CD24 fænotype.

Messenger RNA isoleret fra sfæroider og monolagskulturer blev kvantificeret til ekspression af det angivne TF. Forholdet mellem ekspression i sfæroid til monolag celler er givet. Væsentlige forskelle var * p 0,05; ** P 0,01. MRNA niveau af stemness-relaterede TF Nanog, Oct3 /4, og Sox2 blev øget markant i sfæroider. Nøglen TF i EMT Snail1 blev også øget i alle sfæroider men en anden to TF involveret i EMT, Snail2 og Twist, viste et udtryk mønster afhængig af CD44 /CD24-status.

SDC er mere fredfyldte end deres forældres monolag-afledte modstykker

For cellecyklus-analyse ved FACS, de cellelinjer UT-SCC24A, UT-SCC9, UD-SCC1, UT-SCC22, og UM-SCC11B dyrket i sfæroide eller enkeltlagskultur blev farvet for Ki-67-FITC og DNA modfarvet med propidiumiodid. Celler, der er bosiddende i G1 /G0 peak, der var negative for Ki-67 farvning blev anset for at være den hvilende fraktion (G0 fase). I alle cellelinjer, er andelen af ​​celler i G0 fase viste en yderst signifikant stigning i SDC, hvilket indikerer, at SDC indeholder en højere andel af hvilende celler end parentale monolag-afledte celler (figur 6).

(A ) Dobbelt farvning med Ki-67 og propidiumiodid til måling af proliferation og cellulær DNA-indhold. Enkelte celler blev gated på FL2-W og FL2-A. DNA-indholdet og Ki-67-ekspression blev bedømt ved flowcytometrianalyse. (B) Hyppigheden af ​​hvilende celler i SDC som sammenlignet med monolag-afledte celler. I alle tilfælde skal de celler afledt fra sfæroider indeholder en meget signifikant større procentdel af hvilende (G0) celler. (** P 0,01).

En subpopulation af celler i sfæroider har erhvervet funktioner i myofibroblasts og kan have været underkastet EMT

myofibroblaster er komponenter af tumor stroma og kan have en rolle i opbygningen af ​​CSC-niche, der kan bidrage til at bevare stemness af CSC. Alligevel oprindelsen af ​​disse celler forbliver ukendt. Myofibroblaster producere flere faktorer, som kan stimulere proliferation af cancerceller og lette infiltration af væv. I litteraturen har ikke-adhærente sfæroider genereret fra cancercellelinjer blevet vist at indeholde formodede CSC. Disse sfæroider kunne opretholdes i kultur i lange perioder, hvilket indebærer, at sfæroiderne kan give en niche egnet til vedligeholdelse og vækst af CSC. Vi spurgte derfor, om der findes i) myofibroblaster i den niche skabt af sphæroider, ii) er disse myofibroblaster stammer fra epitel tumorceller gennem EMT, og iii) er der tegn på, at denne proces er reversibel?

For at løse dette sagen, undersøgte vi ekspressionen af ​​myofibroblastlignende markører vimentin og α-SMA i SDC af 3 cellelinier som har forskellige ALDH1 ekspressionsniveauer i monolagskultur (lav: UD-SCC1: 9,4 ± 5,3%, medium: UT-SCC22: 16,9 ± 4,1 %, høj: UT-SCC24A: 25,8 ± 3,0%). Vi fandt, at de forskellige cellelinier og SDC genereret fra disse cellelinier varierede i andelen af ​​celler, der udtrykker vimentin og α-SMA (tabel 3). UD-SCC1 viste ingen α-SMA udtrykkende celler og svag (12,5 ± 2,5%) vimentin ekspression af cellerne i monolagskultur. I modsætning hertil UT-SCC24A (figur 7) og UT-SCC22 monolag-afledte celler havde en relativt høj frekvens af vimentin og α-SMA udtrykkende celler, som viser, at disse cellelinjer har både epitel- og mesenchymale egenskaber. Interessant, disse to cellelinier har en relativt høj procentdel af celler i monolag kulturer, der ALDH1 positive (tabel 3). Men som kugleformede kulturer, alle cellelinjer indeholdt flere α-SMA og vimentin-positive celler end de tilsvarende parentale monolag cellelinier.

(A) Immunofluorescens-farvning af monolaget (A1-3 og B1-3) og sfæroide (C1-3 og D1-3) kulturer fra UT-SCC24A med antistoffer rettet mod α-SMA (grøn) og vimentin (rød). Alle SDC (felt C og D) viser høje niveauer af mesenchymale markører a-SMA og vimentin i forhold til deres monolag modstykker. (B) E-cadherin ekspression analyse ved FACS. I forhold til deres monolag kolleger, viste sfæroider faldt E-Cadherin ytringsfrihed; to populationer af celler, der stammer fra UT-SSC24A kan adskilles i henhold til E-cadherinekspression niveau, hvilket indikerer, at SDC har erhvervet myofibroblastlignende karakteristika ved EMT.

EMT er også ledsaget af tab af celle-celle-kontakter til epitelceller, kendetegnet ved en nedregulering af E-cadherin ekspression. Antallet af E-cadherin udtrykkende celler i SDC og monolag blev kvantificeret ved FACS (figur 7, tabel 3). SDC viste signifikant øget andele af E-Cadherin negative lave udtrykkende celler sammenlignet med deres monolag-afledte modstykker, hvilket indikerer tab af cellulær vedhæftning i denne delpopulation.

Endelig har vi også testet re-vedhæftning af sphæroider til kultur plast. Interessant, når sfæroiderne fæstnet til kolben, og begyndte at vokse ud som et monolag kultur, α-SMA og vimentin niveau faldt, og de fleste af de celler, der voksede ud fra sfæroiderne farves negative for disse to markører (figur 8).

(a-C) Light-mikroskopiske billeder med fasekontrast danner UD-SCC1 sphæroider genmonteres at dække dias under processen med re-vækst til et monolag fænotype. (A) 24 timer efter refiksation, nogle spindel-lignende celler vokser ud fra adhærerede sfæroider. (B) 72 timer efter refiksation, de fleste af de vedhæftede celler ‘form ligner deres parentale monolag modstykke (C). (D-E) Indirekte immunofluorescens-farvning af påsættes igen sfæroider efter 24 timer farvet med DAPI (D1, E1), α-SMA (D2, grøn), og vimentin (E2, rød). Billeder D3 og E3 viser overlay med nukleare farvning. Pile skildrer outgrowing celler udstråler fra sfæroiden. Udtrykket af α-SMA og vimentin faldt i outgrowing celler (pile) efter refiksation og det meste af farvningen var begrænset til sfæroider mens de fleste af de celler dyrket fra sfæroider var ufarvet.

Diskussion

I tumorbiologi mange bestræbelser er blevet gjort for at forklare de embryonale-lignende funktioner i transformerede cancerceller. Evne CSC at genopbygge tumoren fra en enkelt celle kan forklare mange af de forskelle, der diskriminerer tumorceller fra differentierede somatiske celler som udødelighed, ubevægelighed, invasion, der fører til metastase, og tilbagefald efter behandling. Prince og kolleger [9], viste, at en mindre population af CD44

+ HNSCC-celler besidder CSC egenskaber, som kunne give anledning til nye tumorer in vivo (≈5,000 celler injiceret). Mack og kolleger spørgsmålstegn ved brugen af ​​CD44 som en specifik CSC markør i HNSCC siden CD44 rigeligt blev udtrykt i de fleste tumorceller inden HNSCC (60% -100%), og derfor ikke kunne anvendes til at skelne normal fra godartede eller ondartede epiteler af hovedet og hals [10]. ALDH1 blev for nylig vist sig at være en mere passende markør for at identificere formodede CSC af HNSCC og andre epitelial kræft [11], [12], [13], [14], [15]. I HNSCC viste Chen et al, at 3000 ALDH1

+ HNSCC celler fra fem patienter i xenotransplanted mus resulterede i alle tilfælde i dannelsen af ​​synlige tumorer 6 uger efter injektion, mens 10

4 ALDH1

– celler mislykkedes at generere tumorer. [12], [39]. Vi beskriver en fremgangsmåde til formering og berigelse af ALDH1

+ cellekulturer af HNSCC cellelinier. De stamcellelignende karakteristika ved disse celler blev analyseret ved at sammenligne overfladeantigen ekspression og ekspression af embryonale TF samt funktionelle egenskaber af de parentale monolag cellelinier. Den iagttagelse, at sfæroide-kulturer ikke består af en homogen cellepopulation udløste yderligere delanalyser, der afslørede en celle population med udtryk for EMT-markører. Dette kan indikere, at disse celler har en aktiveret EMT-program og viser en potentielt tæt forhold mellem CSC og celler med en aktiveret EMT program, som kan have afledt af CSC.

sfæroider tre-dimensionelle (sfæriske) klynger af tumorceller dyrket fra en eller flere cellekloner. I forhold til celle fordobling gange målt i monolagskultur, hastigheden og mønster af klumpformet vækst in vitro bedre kampe, der blev observeret i tumorer in vivo [40]. Anchorage uafhængig vækst har vist sig at være en ejendom deles af normale væv celler, der udviser stamceller egenskaber [41]. Også CSC afledt af melanom [42], brystcancer [43], og gliosarcoma [19] var i stand til at blive formeret forankring selvstændigt og vise fænotypen af ​​adhærerende sfæroider.

Som eksemplificeret i brystcancer fx formodede CSC (CD44

+ /CD24

-) kan beriges in vitro ved at isolere mammospheres fra suspensionskulturer [43], [44]. I vores undersøgelse fandt vi hyppigheden af ​​CD44

+ /CD24

– celler i HNSCC linjer at være yderst variabel (fra 0,5% til 97%). Desuden kunne de ikke blive beriget af klumpformet kultur. I modsætning hertil blev der fundet ALDH1 positive celler at være stærkt beriget med kugleformede kulturer fra alle fem HNSCC cellelinier. Hvis podet på et meget lavt densitiy, FACS sorteret ALDH1

+ -celler dannede signifikant flere kolonier derefter den ALDH

– befolkning, hvilket indikerer en højere proliferativ kapacitet af denne subpopulation. Andre har vist, at ALDH1

+ eller ALDH1

+ /CD44

+ /CD24

– cellepopulationer isoleret fra HNSCC-patienter har en højere tumorigent potentiale derefter ALDH1

– celler, selv om de var CD44

24

– hvis xenotransplanted i mus [12]

Kræft og normale stamceller (SC) deler proliferative egenskaber af selvfornyelse, ubevægelighed og udtryk af centrale transkriptionsfaktorer (TF. ). Chickarmane et al. [45] nedsat en computer-model til at beskrive de centrale transskription faktor kombinationer i SC og definerede høje niveauer af Oct3 /4, Sox2, og Nanog. På den anden side, Ji et al. [46] sammenlignet rolle Oct3 /4 og Nanog i transformerede (t-hPSCs), og normale humane pluripotente stamceller (hPSCs). I modsætning til normal SC, selv-fornyelse og overlevelse af t-hPSCs fandtes at være uafhængig af Oct3 /4 udtryk. I modsætning hertil genetisk knockdown af Nanog forårsagede fuldstændig tab af selvfornyelse samtidig med apoptose i T-hPSCs. I vores undersøgelse ekspressionen af ​​Oct3 /4, Sox2, og Nanog var opreguleret i SDC i de fem HNSCC afledte cellelinier. Dette indebærer, at SDC kan have stamcellelinjer egenskaber.

Studies beskæftiger sig med genekspression profilering ved anvendelse in vivo invasive celler eller celler, som undergår EMT in vitro, viste et skift fra en proliferativ til en invasiv fænotype. Efter aftale til denne observation har celleproliferation markør Ki-67 vist sig at mærke kun et lille mindretal af celler ved den invasive foran i forhold til de mere differentierede centrale del af tumoren, hvilket tyder på, at ikke-prolifererende tumorceller der er sluppet tumormassen kunne have metastatisk potentiale [47]. I vores undersøgelse fandt vi, at SDC havde en højere andel af Ki-67 negative celler sammenlignet med de tilsvarende monolagskulturer. Dette indikerer, at SDC er mere hvilende end celler afledt af monolag. Vi fandt også, at SDC har en øget invasion kapacitet, hvilket indebærer, at disse celler kan have en højere evne til at metastasere. Salg

myofibroblaster er en slags mesenchymal celle spiller en central rolle i tumorinvasion og metastase og terapeutiske respons. De kan producere flere faktorer, der kan stimulere proliferation af cancerceller og lette deres infiltration [31]. Men er ikke klart oprindelsen af ​​disse myofibroblaster. EMT er blevet rapporteret at spille en vigtig rolle i initiering CSC [29]. I denne undersøgelse har vi vist, at de myofibroblastlignende celler er en underpopulation af SDC. Disse sfæroider udelukkende hidrører fra klonede tumorceller. Det kan derfor konkluderes, at de myofibroblaster kunne kun komme ud epitelial kræftceller ved at ændre epitel til en mesenkymale fænotype gennem EMT. Endnu vigtigere er, som vi fandt, at over 90% af SDC farvedes positive for α-SMA og vimentin mens procentdelen af ​​ALDH1

+ -celler lå i området fra 37% til 46,4%. Et signifikant fald af E-cadherin ekspression kunne påvises i SDC, hvilket indikerer en reduktion af celle-celle-kontakt i kugleformede kulturer. Disse markør udtryk var reversible under dyrkningsbetingelser, hvor sfæroider kunne klæbe og celler voksede radialt ud til at danne et monolag.