PLoS ONE: Epigenetisk Inaktivering af heparansulfat (Glucosamin) 3-O-sulfotransferase 2 i lungekræft og dens rolle i Tumorigenesis

Abstrakt

Baggrund

Denne undersøgelse havde til formål at undersøge den funktionelle betydningen af ​​heparansulfat (glucosamin) 3-

O

-sulfotransferase 2 (

HS3ST2

) hypermethyleringsassocierede i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC).

Metode /vigtigste resultater

HS3ST2

hypermethylering blev kendetegnet ved seks lunge cancer cellelinjer, og dens kliniske betydning blev analyseret ved hjælp af 298 formalin-fikseret paraffinindlejrede væv og 26 friske frosset væv fra 324 NSCLC patienter. MS-HRM (methyleringsspecifik høj opløsning smeltning) og EpiTYPER

TM assays viste betydelig hypermethylering af CpG øen i promotorregionen af ​​

HS3ST2

i seks lung cancercellelinier. Den tavshed genet blev demethyleret og re-udtrykt ved behandling med 5-aza-2′-deoxycytidin (5-Aza-dC). En promotor-assay viste også kernepromotoren aktivitet af HS3ST2 blev reguleret ved methylering. Exogen udtryk for HS3ST2 i lungekræft celler H460 og H23 hæmmede celle migration, invasion, celledeling og at knockdown af HS3ST2 i NHBE celler induceret celle migration, invasion, og celledeling

i

vitro

. En negativ korrelation blev observeret mellem mRNA og methylering niveauer af HS3ST2 i 26 friske frosne tumorer væv (ρ = -0,51,

P

= 0,009; Spearman rang korrelation).

HS3ST2

hypermethylering blev fundet i 95 (32%) af 298 primære NSCLCs. Patienter med

HS3ST2

hypermethylering i 193 node-negative fase I-II NSCLCs med en median follow-up periode på 5,8 år havde dårlig samlet overlevelse (hazard ratio = 2,12, 95% konfidensinterval = 1,25-3,58,

P

= 0,005) sammenlignet med dem uden

HS3ST2

hypermethylering, efter justering for alder, køn, tumorstørrelse, adjuverende behandling, tilbagefald, og differentiering.

konklusioner /betydning

Den foreliggende undersøgelse tyder på, at

HS3ST2

hypermethylering kan være en uafhængig prognostisk indikator for samlet overlevelse i node-negative fase i-II NSCLC

Henvisning:. Hwang JA, Kim Y , Hong SH, Lee J, Cho YG, Han JY, et al. (2013) Epigenetisk Inaktivering af heparansulfat (Glucosamin) 3

O

-Sulfotransferase 2 i lungekræft og dens rolle i tumorigenese. PLoS ONE 8 (11): e79634. doi: 10,1371 /journal.pone.0079634

Redaktør: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, Kina

Modtaget: Maj 22, 2013; Accepteret: September 25, 2013; Udgivet: November 12, 2013 |

Copyright: © 2013 Hwang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Cancer center (NCC 1.110.140 til 1 og 1.110.100 til 2), Korea Healthcare teknologi R D Project, Ministeriet for sundhed, velfærd Familiestyrelsen, Republikken Korea. (A084947AA202308N100010A), og National Research Foundation Korea (NRF) tilskud finansieret af Sydkorea regering (MEST) (nr 2011 til 0.029.138), Republikken Korea. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald i verden. Trods betydelige fremskridt inden for tidlig påvisning og behandling i de seneste to årtier, er prognosen forbliver fattige, med det overordnede 5-års overlevelse svævende på mindre end 15% [1]. Den dårlige prognose af patienter med lungecancer skyldes stort set fra mikrometastase, hvilket gør helbrede mindre sandsynligt, og delvist fra den høje sats for fornyet efter kurativ resektion; patienter med stadium I lungekræft har en overlevelse tilbagefaldsrater efter helbredende kirurgisk resektion med passende lymfeknudedissektion området fra 20% til 50%, afhængigt af den patologiske stadium [2]. Således opdagelsen af ​​molekylære biomarkører for tidlig påvisning og identifikation af patienter med høj risiko for tilbagefald er helt klart vigtigt.

heparansulfat (HS) er en lineært polysaccharid, der findes i alle animalske væv, og det forekommer som et proteoglycan, hvor to eller tre lineære heparansulfat glycosaminoglycan (GAG) kæder er kovalent bundet ved specifikke serinrester på en kerneprotein gennem en tetrasaccharid-linker [3]. HS kæder er monteret på en kerneprotein af enzymer i Golgi-apparatet og er sammensat af gentagne disaccharidenheder af skiftevis glucuronsyre (GlcA) eller iduronsyre (IdoA) syre og

N

acetyl glucosamin (GlcNAc). Under montering, de gennemgår en række sekventielle ændringer begynder med

N

-deacetylation og

N

-sulfation af glucosamin-rester. Støder op til denne første modifikation, er nogle GlcA rester epimeriseres til iduronsyre af en C5 epimerase og derefter 2-O-sulfateret, med yderligere sulfatering i 6-O og 3-O-positioner af glucosamin-rester til dannelse af modne kæder [4,5 ]. Ændringerne er vigtige for den fine struktur heparansulfatproteoglycaner (HSPG) og i særlige heparansulfat-protein interaktion.

heparansulfat Hotel (

glucosamin

)

3-O-

sulfotransferase

2 Hotel (

HS3ST2

), et medlem af heparan sulfat biosyntetisk enzym familie, besidder heparansulfat glucosaminyl 3-

O

-sulfotransferase aktivitet, der modificerer GAG kæder [6,7].

HS3ST2

hypermethylering er for nylig blevet rapporteret i en række forskellige kræftformer, såsom brystkræft [8,9], kolorektal cancer [8,10,11], mavekræft [12], hæmatologisk neoplasma [13], lungekræft [8], pancreascancer [8], prostatacancer [14], og livmoderhalskræft [15,16].

HS3ST2

hypermethylering blev fundet ved en høj frekvens i duktalt carcinoma in situ af brystkræft [9] og i cytologiprøver af cervikal intraepithelial neoplasi 3 (CIN3) [15], hvilket tyder på

HS3ST2

hypermethylering sandsynligvis sker tidligt i malign transformation af brystet og livmoderhalsen.

HS3ST2

også viser høj methylering i prostatacancer med tilbagefald [14]. Derudover er frekvensen af ​​

HS3ST2

hypermethylering er høj i high-grade squamous intraepithelial læsion (HSIL) af livmoderhalsen sammenlignet med lav kvalitet squamous intraepithelial læsion (LSIL) [16]. Men den klinisk-patologisk betydning af

HS3ST2

hypermethylering forbliver undvigende i lungekræft. For at få bedre indsigt i den rolle,

HS3ST2

hypermethylering i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), vi karakteriseret

HS3ST2

hypermethylering i seks lunge cancer cellelinjer og undersøgt effekten af ​​hypermethylering af

HS3ST2

på fænotypen og prognose for lungekræft i paraffinindlejrede væv fra 298 primære ikke-småcellet lungekræft (NSCLCs).

Materialer og metoder

Cell kultur og vævsprøver

Seks humane lungecancer-cellelinjer (H23, H226, H460, H520, H1650, og A549) og to humane bronchieepithelceller cellelinjer (HBEC og NHBE) blev opnået fra American Type Culture Collection ( Manassas, VA). Cellerne blev dyrket i en udpeget vækstmedium suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT) og 1% antibiotisk-antimycotisk (Invitrogen, USA). Tyve-seks frisk frosset tumor og tilsvarende normale væv, såvel som 298 paraffinindstøbte tumorvæv, blev indhentet fra i alt 324 NSCLC patienter, som gennemgik helbredende resektion ved Institut for thorax og Cardiovascular Surgery, Samsung Medical Center, Seoul, Sydkorea fra august 1994 og november 2005. Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board på Samsung Medical center, og skriftligt informeret samtykke til anvendelse af væv blev opnået fra hver patient før operationen. Postoperativ opfølgning for overlevelse eller fornyet blev udført som beskrevet tidligere [2]. Patologisk TNM stadie blev bestemt i henhold til retningslinjerne i den amerikanske Blandede Udvalg om kræft [17]

Genomisk DNA-ekstraktion og natriumbisulfit modifikation

H . E (Hematoxylin og eosin) farvning af frisk -Frozen og paraffinindstøbte væv blev udført; tumor områder indeholdt mindst 75% neoplastisk væv. Genomisk DNA fra dyrkede celler og fra 26 frisk frosset tumor og tilsvarende normale væv og 298 paraffinindlejrede tumorvæv blev ekstraheret under anvendelse af MagAttract DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) og DNeasy Tissue kit (Qiagen, Valencia, CA), henholdsvis. Et mikrogram af genomisk DNA blev modificeret ved natriumbisulfit hjælp af EZ DNA-methylering-Gold Kit (Zymo Research, Irvine, CA).

MS-HRM assay, EpiTYPER

TM assay, og methylering-specifik PCR

For at finde meget denatureret regioner i

HS3ST2

promotor, en 2 kb region, der indeholder de 1,5 kb

HS3ST2

promotoren blev analyseret med en methyleringsspecifik høj opløsning smelte (MS-HRM) assay på en LightCycler®480 real-time PCR instrument (Roche, Switerland). status methylering af et 1,5 kb region, som viste sig at være stærkt demethyleret ved MS-HRM assay blev yderligere analyseret kvantitativt ved hjælp af EpiTYPER

TM assay (Sequenom, San Diego, CA) at analysere methylering status på individuelle CpG’er. Analyserede regioner er repræsenteret i figur 1A. Primere til hvert assay blev designet ved hjælp SEQUENOM (San Diego, CA) EpiDesigner software (tabel S1 og S2). status methylering af

HS3ST2

i de 298 formalinfikserede paraffinindlejrede væv blev bestemt under anvendelse methylering-specifik PCR (MSP) med to sæt primere (tabel S3) dækker promotorregionen, som tidligere beskrevet

2. Reaktioner blev varmt startet ved 94 ° C før tilsætning af 2,5 enheder Taq-polymerase. Amplifikation blev udført over 35 cyklusser (30 s ved 94 ° C, 30 s ved annealingstemperatur, 30 sekunder ved 72 ° C), efterfulgt af 4 minutter ved 72 ° C. Resultaterne fra MSP-analyse blev visuelt scoret af to forfattere (Y Kim og D-H Kim). Prøver med en stærkere bånd intensitet end den negative kontrol i methyleringsspecifik PCR blev betegnet methyleret, og prøver uden synligt PCR-produkt blev betragtet som ikke-methyleret.

(A) CpG ø kort over

HS3ST2

promotor og regionerne analyserede bruger MS-HRM og EpiTYPER assay. (B) Methylering status

HS3ST2

blev først vurderet i seks lungekræft cellelinier og to bronchieepithelceller cellelinjer under anvendelse MS-HRM. (C) Methylering status for individuelle CpG’er på et 1,5 kb promotorregion (HRM-04, 05, 06, 07, 08, og 09) blev analyseret kvantitativt i cellelinierne ved anvendelse af EpiTYPER

TM assay. Methylering niveauer er afbildet som en farveændring på en kontinuerlig skala fra rød (0% methyleret) til hvid (100% methyleret). (D) Udskrift niveauer af

HS3ST2

blev sammenlignet mellem højt methylerede lungekræft-cellelinjer og bronchieepithelceller cellelinier ved QRT-PCR (sort bjælke). Inddrivelse af

HS3ST2

transskription blev vurderet efter behandling af seks lunge cancer cellelinjer med 5-Aza-dC i 72 h (grå bar vs hvid bar;

P

-værdier er baseret på Wilcoxon underskrevet-rank test). (E) Methylering status CpG’er omkring stærkt methylerede ATG område af

HS3ST2

genet blev vurderet efter behandling med 5-aza-dC i 72 timer. Den Heatmap viser typiske mønstre af demethylering i kræftceller i respons på 5-Aza-dC, og procenterne angiver gennemsnitlige methylering niveauer.

Analyse af HS3ST2 udtryk

For at undersøge udtrykket af HS3ST2 på niveauet af mRNA, blev cDNA syntetiseret ud fra to ug totalt RNA ved anvendelse af SuperScript

TM III Første-Strand Synthesis System (Invitrogen, CA). MRNA ekspression af HS3ST2 blev analyseret under anvendelse af RT-PCR og kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR). Kvantitativ realtids-PCR blev udført på en LightCycler

® 480 Real-Time PCR System (Roche Applied Science). GAPDH blev anvendt som en reference-gen, og den relative ekspression blev beregnet ved hjælp af ΔC

T metoden (ΔC

T = C

T fra GAPDH – C

T fra HS3ST2). Eksperimentet blev udført tredobbelt og QRT-PCR anvendte primere var de samme, som i RT-PCR. Primerne blev konstrueret til at indeholde exon-exon junction (tabel S3).

5-Aza-dC behandling in vitro

Seks lungekræft cellelinier blev inkuberet med 10 pM 5-aza-2 ‘-deoxycytidine (5-Aza-dC, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 72 timer. Efter inkubation blev mRNA-ekspression og methylering kvantificeret ved kvantitativ realtids-PCR og EpiTYPER

TM assay henholdsvis.

Reporter Assay

Serielle deletionskonstruktioner af HS3ST2 promotoren blev skabt, og forskellige længder af promotorområder (-984 ~ + 12, -742 ~ + 12, -495 ~ + 12, -245 ~ + 12) blev amplificeret under anvendelse af PCR-primere (tabel S4) og klonet ind i pGL3-basisk vektor. Promotor sekvens var

in vitro

methyleres af CpG-specifikke

Sss

jeg methylase (New England Biolabs, Ipswich, MA). Promotor- aktiviteter methylerede og ikke-methylerede konstruktioner blev sammenlignet ved Dual Luciferase assay (Promega, Madison, WI).

Cell migration, invasion og proliferation assay

I

in vitro

migration celle, invasion, og proliferationsassays, en pAcGFP1-C1-

HS3ST2

cDNA-klon blev fremstillet ved anvendelse af primerne, der er anført i tabel S3, og H460 og H23 celler blev transficeret med en ug pAcGFP1-C1-

HS3ST2

og pAcGFP1-C1 (tom vektor) ved anvendelse af Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, USA). Otteogfyrre timer efter transfektion blev HS3ST2 ekspression bekræftet ved immunoblotting under anvendelse af primære antistoffer rettet mod GFP (sc-9996; Santa Cruz Biotechnology, CA) og α-tubulin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Cellemigrering analyseret ved at tillade celler at migrere nedad natten over ved 37 ° C gennem en 8-m pore filterindsats (BD, USA) og derefter ved farvning med 1% krystalviolet; de opløste celler blev målt ved 564 nm i en VERSA

max mikropladelæser (Molecular Devices, USA). Invasionen assay blev udført ved at tælle Diff-Quick

TM (Sysmex, Japan) farvede celler i en Matrigel-coated insert efter en 48 timers inkubation. For proliferationsassayet blev brønde podet med 1 x 10

3 celler per brønd og en MTT assay blev udført hver 24 timer; prolifererende celler blev målt ved absorbans ved 570 nm.

Knockdown af HS3ST2

HS3ST2-specifikke små interfererende RNA (siRNA målsekvens:. 5′-CCCAGCTACTTTGTCACTCAA-3 ‘Cat No. SI00442015, Qiagen) eller negativ kontrol siRNA (Kat 10272810, Qiagen) blev transficeret til NHBE-celler. Efter 72 timers transfektion blev lyddæmpning af HS3ST2 bekræftet ved immonublotting hjælp primære antistoffer rettet mod HS3ST2 (kat. Nr PA5-26522, Thermo Scientific) og normaliserede med β-actin. Virkningen af ​​HS3ST2 knockdown på cellemigration, celleinvasion og celleproliferation blev analyseret som beskrevet ovenfor.

Kvantitativ methyleringsspecifik PCR

Methylering status CpG øen i promotorregionen af ​​

HS3ST2

i 26 frisk frosset tumorvæv blev kvantitativt analyseret under anvendelse af fluorescens-baserede kvantitativ real-time PCR assay MethyLight, som beskrevet af Gonzalo et al [10]. Kort fortalt blev MethyLight reaktioner udført i et slutvolumen på 12,5 pl indeholdende 1,0 pi bisulfit-behandlet DNA, 900 nM af hver primer og 250 nM TaqMan probe. Termocycling reaktioner blev kørt under anvendelse af en 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA), og

ALU-C4

genet blev anvendt som en intern reference til at normalisere mængden af ​​indført DNA [18]. Primerne og fluorescensmærkede TaqMan prober anvendt i den foreliggende undersøgelse er vist i tabel S5.

Immunhistokemi af Ki-67

Immunohistokemisk analyse af Ki-67 blev udført som tidligere beskrevet [19] . Fraktionen af ​​Ki-67-positive celler (Ki-67 mærkning indeks) blev defineret som procentdelen af ​​kerner farves positivt med antistoffet.

Statistisk analyse

Wilcoxon rank sum test ( eller

t

-test) og Fishers eksakte test (eller Chi-squared test) blev anvendt til univariat analyse af de kontinuerlige og kategoriske variabler, henholdsvis. HS3ST2 mRNA niveauer mellem tumorvæv og matchede normale væv blev sammenlignet under anvendelse af Wilcoxon-test. Spearman rang korrelationskoefficient blev beregnet til evaluering af sammenhængen mellem udtryk og methylering af

HS3ST2

. Effekten af ​​

HS3ST2

hypermethylering på overlevelse eller fornyet blev estimeret ved Kaplan-Meier-overlevelseskurver, og betydningen af ​​forskelle i prognose mellem grupperne blev evalueret ved log-rank test. Cox proportionel risiko analyse blev udført for at estimere hazard ratio på

HS3ST2

hypermethylering for overlevelse, efter kontrol for potentielle forstyrrende faktorer.

Resultater

Analyse af methylering omkring HS3ST2 promotor

status methylering af

HS3ST2

omkring

HS3ST2

promotor blev analyseret ved hjælp af MS-HRM (figur 1B) og EpiTYPER

TM analyser (figur 1C) i seks lung cancer cellelinjer og to normale bronchieepithelceller cellelinier. Status for methylering af en 2,0 kb region indeholdende promotorsekvensen af ​​

HS3ST2

blev først screenet ved MS-HRM. Bemærkelsesværdige smeltekurve dissociation blev observeret i seks fragmenter (HRM-04, 05, 06, 07, 08, og 09) mellem lungekræft cellelinjer og normale bronchieepithelceller cellelinier (figur 1b). Fordi methyleret cytosin kræver en højere smeltetemperatur end ikke-methyleret cytosin, smeltekurveme af de methylerede fragmenter forskudt til højre i forhold til normale cellelinier. At evaluere methylering status på individuelle CpG’er på 1,5 kb promotorområde herunder de seks fragmenter, vi kvantitativt analyseret individuelle CpG’er med EpiTYPER

TM assay (figur 1C). Normale cellelinier blev hypomethylated i hele 1,5 kb sekvenser, men lungekræft cellelinier blev normalt hypermethyleret omkring ATG translation start site. Selv om nogle CpG’er ved ATG translationsstartstedet af

HS3ST2

var delvist methyleret i H226 og H1650-celler, de fleste CpG’er var meget methyleret i andre lungekræft cellelinier.

5-Aza-dC induceret demethylering og re-udtryk for tavshed HS3ST2

For at undersøge om nedregulering af

HS3ST2

er afhængig hypermethylering af genet, vi analyserede re -expression (Figur 1D) og demethylering (figur 1E) af tavshed

HS3ST2

ved QRT-PCR og EpiTYPER

TM assay efter behandling af lungekræft celler med 10 pM 5-Aza-dC i 72 timer. HS3ST2 mRNA niveauer var væsentligt lavere i seks lunge cancer cellelinjer end i to bronchieepithelceller cellelinier (sort bjælke; Figur 1D). Lyddæmpet

HS3ST2

blev re-udtryk i alle lungekræft cellelinier efter 5-Aza-dC behandling (hvid bar figur 1D). Ændringen i niveauet af methylering som respons på 5-Aza-dC blev yderligere analyseret ved individuelle CpG’er omkring stærkt methylerede ATG område af

HS3ST2

genet (figur 1E). Selvom graden af ​​demethylering afveg blandt cellelinjer blev demethylering findes i alle cellelinjer følgende 5-Aza-dC behandling. Demethylering forekom mere væsentligt i H460 eller H1650 celler, som var mindre tæt denatureret, end i tæt denatureret H23 celler. Disse resultater antyder, at

HS3ST2

hypermethylering kan være forbundet med transkriptionel nedregulering af genet.

HS3ST2

promotor-aktivitet faldt med promotor methylering

Promotor aktivitet blev målt i H23-celler (figur 2A) og HEK-293T-celler (figur 2B) af Dual Luciferaseassayreagens at afgøre, om

HS3ST2

methylering påvirker gentranskription. Fire konstruktioner (-984 ~ + 12, -742 ~ + 12, -495 ~ + 12, -245 ~ + 12) for hver methylerede og ikke-methylerede promotorsekvenser blev produceret. Methylerede konstruktioner af

HS3ST2

promotoren blev opnået med SSSI methylase (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) i nærvær af S-adenosylmethionin. Promotoraktivitet blandt methylerede konstruktioner af

HS3ST2

promotor var ikke proportional med længden af ​​hver konstruktion i cellerne, men promotoraktiviteten blev navnlig nedsat, når promotorsekvenser mellem -742 bp og -495 bp blev slettet. For methylerede konstruktioner, promotoraktivitet var ens i alle konstruktioner og i det væsentlige lavt sammenlignet med den for tilsvarende ikke-methylerede konstruktioner. Denne observation tyder på, at kernepromotoren omfatter en DNA-region af -742 bp gennem -495 bp fra transkriptionsinitieringsstedet.

De dobbelte luciferaseaktiviteter af fire HS3ST2 promotorkonstruktioner blev målt i H23 (A) og HEK- 293T (B) cellelinjer. En kb promotor konstruktion blev serielt slettet, og luciferaseaktivitet af hver konstruktion blev sammenlignet mellem konstruktioner behandlet med (grå søjle) og uden SSSI methylase (sort søjle).

HS3ST2 hæmmede celle migration, invasion, og spredning

For at undersøge funktionen af ​​

HS3ST2

i tumorigenese af lungen, celle migration, invasion, og spredning var undersøgt i H460 og H23 lunge kræftceller.

HS3ST2

cDNA blev klonet i pAcGFP-C1 og transficeret ind H460 og H23 celler: data for H23 celler er i figur S1. Overekspression af transficerede pAcGFP-C1-

HS3ST2

blev overvåget ved RT-PCR (figur 3A), QRT-PCR (figur 3B), og immunoblotting (figur 3C). Overekspression af

HS3ST2

væsentligt reduceret cellemigration kapacitet med 53% (

P

= 0,0017, Figur 3D og 3E). Cell invasion aktivitet faldt med 83% i H460 celler transficeret med pAcGFP-C1

HS3ST2 Hotel (

P

= 0,0019, Figur 3F og 3G); celledeling også betydeligt faldt over tid (figur 3H 3I). Disse observationer tyder på, at

HS3ST2

kan hæmme lunge tumorigenese ved at reducere celle migration, invasion, eller celledeling i lungekræft.

(AC) pAcGFP-C1

HS3ST2

var transficeret ind H460 lungecancerceller. Specifik overekspression af

HS3ST2

sammenlignet med tom vektor blev bekræftet ved RT-PCR (A), QRT-PCR (B), og western blotting (C). (GD) H460-celler blev podet i et Boyden kammer med en tom vektor eller med én pg pAcGFP-C1

HS3ST2

i transwell migration (D migrerende celler blev målt ved absorbans ved 564 nm; invaderende celler blev talt under et mikroskop. Resultaterne præsenteres i forhold til

i

vitro

migration eller invasion af ikke-inducerede H460 celler (100%). (H 4D).

(A) HS3ST2 siRNA blev transficeret ind NHBE celler, og siRNA-medieret knockdown blev bekræftet ved Western blotting. (B) Cellelevedygtighed blev målt ved MTT-assay bestemmes ved at evaluere absorbansen af ​​den konverterede farvestof ved en bølgelængde på 570 nm. (C pladecellekræft, planocellulært karcinom cDifferentiation data mangler i 68 sager CSV Hent CSV

For at analysere forholdet mellem

HS3ST2

hypermethylering til celleproliferation, Ki-67-ekspression blev vurderet ved immunhistokemisk farvning (figur 5D). Ki-67 spredning indeks viste sig at være signifikant forskellige i henhold til den status methylering af

HS3ST2 Hotel (

P

= 0,02, figur 5E): den gennemsnitlige Ki-67 spredning indeks var 29% og 22% i tumorer med og uden

HS3ST2

hypermethylering hhv. Forholdet mellem Ki-67 spredning indeks og

HS3ST2

hypermethylering var også ens i adenocarcinom (

P

= 0,04) og pladecellekræft (

P

= 0,009).

Survival analyse

Gentagelse overlevelse (RFS) og samlet overlevelse blev sammenlignet i henhold til methylering status

HS3ST2

tværs tumor stadie. For at analysere effekten af ​​

HS3ST2

hypermethylering på patientens prognose, stratificeret vi data ved tumor fase, fordi tumor fase er signifikant associeret med patientens overlevelse i NSCLC.

HS3ST2

hypermethylering var ikke forbundet med RFS (data ikke vist). Men effekten af ​​

HS3ST2

hypermethylering på samlet overlevelse viste et andet mønster i henhold til inddragelse af lymfeknuder i 248 trin I-II NSCLCs. For 193 node-negative fase I-II NSCLCs, den 5-årige overlevelsesrate var 59% og 71% hos patienter med og uden

HS3ST2

hypermethylering henholdsvis (figur 6A). Og denne forskel var signifikant forskellige (

P

= 0,04). Dog samlet overlevelse var ikke signifikant forskellig mellem patienter med og uden hypermethylering af

HS3ST2

i 55 node-positive tilfælde. (

P

= 0,69, figur 6B)

Samlet overlevelse blev sammenlignet i henhold til methylering status

HS3ST2

i 193 node-negative fase i-II NSCLCs (A) og i 55 node-positive fase i-II NSCLCs (B).

HS3ST2

hypermethylering i en gruppe, der ikke har involvering af lymfeknude viste en signifikant negativ effekt på den samlede overlevelse (

P

= 0,04).

COX proportionale farer analyse

Stratificeret Cox proportionel risiko analyse (tabel 2) for 248 trin i-II NSCLCs blev udført for at kontrollere for potentielle forstyrrende virkninger af variabler, såsom alder, køn, tumorstørrelse, adjuverende behandling, gentagelse, og differentiering, og til beregning af hazard ratio (HR). Patienter med

HS3ST2

hypermethylering i 193 node-negative NSCLCs havde en 2,12 gange (95% konfidensinterval [CI] = 1,25-3,58;

P

= 0,005) større risiko for fiasko i forhold til dem uden

HS3ST2

hypermethylering. Dog samlet overlevelse hos patienter med inddragelse af lymfeknude var ikke signifikant forskellig i henhold til den status methylering af

HS3ST2

(HR = 0,84, 95% CI = 0,34-3,82;

P

= 0,69).

HS3ST2

hypermethylering

HR

en

95% CI

en

P

-værdi Hotel (A) Knude-positive casesNo1.00 (N = 55) Yes0.840.34-3.820.69 (B) lymfeknude-negativ casesNo1.00 (N = 193) Yes2.121.25-3.580.005Table 2.