PLoS ONE: Expression og Polymorfi af Toll-lignende receptor 4 og Virkning på NF-KB medieret Betændelse i Colon kræftpatienter

Abstrakt

Vores mål var at evaluere sammenhængen mellem udtryk og polymorfi af TLR4 /NF-KB veje og tyktarmskræft. TLR4 (

rs4986790

,

rs10759932

,

rs10759931

rs2770150

) blev genotype i blodprøver fra tyktarms-patienter og raske kontrolpersoner. TLR4 og cytokiner inflammatoriske ekspression blev vurderet ved real time PCR på 40 matchende normale og colon væv og proteinniveauet ved immunhistokemi. Det høje TLR4 ekspression i colon cancer væv skyldes primært infektioner med bakterier i colon hos mennesket og fører til induktion af en akut sekretion af inflammatoriske cytokiner medieret af NF-KB. Også rapporterer vi her et klart bevis for en sammenhæng mellem TLR4

rs10759931

polymorfi (OR = 0,086, CI: 0,04 til 0,18, P = 0.00001). Denne polymorfi påvirker hele befolkningen uden at være specifik for begge køn eller enhver aldersgruppe. I modsætning hertil

rs2770150

er associeret med tyktarmskræft hos kvinder over 50 år, og er tæt forbundet med de reducerede niveauer af kvindelige kønshormoner i post-menopausal periode (OR = 0,188, CI: 0,074-0,48 , P = 0,00084).

rs10759932

rs4986790

synes at have nogen forbindelse med tyktarmskræft. Vores data tyder på, at TLR4 SNPs muligvis kunne tjene som biomarkører for beslutningstagning i tyktarmskræft behandling

Henvisning:. Semlali A, Reddy Parine N, Arafah M, Mansour L, Azzi A, Al Shahrani O, et al. (2016) Udtryk og Polymorfi af Toll-lignende receptor 4 og Virkning på NF-KB medieret Betændelse i Colon kræftpatienter. PLoS ONE 11 (1): e0146333. doi: 10,1371 /journal.pone.0146333

Redaktør: Shrikant Anant, University of Kansas School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: April 29, 2015; Accepteret: 20. november 2015; Udgivet: 15 januar 2016

Copyright: © 2016 Semlali et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Grant nummer RGP-VPP-260, https://dsrs.ksu.edu.sa/en. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Forkortelser : TLR4, Toll-lignende receptor 4; CRC, colorectal cancer; SNP’er, single-polymorfier; LRRs, leucinrige gentagelser; DAMP, Patogen-associeret molekylær mønster; Dæmper, Skader-associeret molekylære mønster molekyler; TNF, tumornekrosefaktorer; TIR, Toll-interleukin1 receptor; NF-KB, Nuclear faktor kappa-let kæde-enhanceren af ​​aktiverede B-celler; MAP, Mycobacterium avium subsp. Para tuberkulose; QPCR, kvantitativ PCR; CI s, Konfidensintervaller

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en kompleks sygdom, og en af ​​de mest almindelige typer af kræft. De risikofaktorer for tyktarmskræft synes at være bestemt af samspillet mellem genetik og en række miljømæssige påvirkninger. Flere linjer af beviser støtter det synspunkt, at svækkelse af immunsystemet kan bidrage til risikoen for at udvikle mange kræftformer, og aktivering af immunsystemet er energisk forfølges for kræftbehandling. I denne forstand er foreningen af ​​medfødte immunitet med coloncancer opstå. Endvidere blev patienter med immundefekt vist sig at have en øget risiko for kræft [1], og de seneste undersøgelser har vist, at nedsat signalering af medfødte immunforsvar receptorer kan bidrage til kræft patogenese [2-5]. Medfødte immunitet hovedsagelig aktiveres og reguleres af Toll-lignende receptorer (TLRs) [6] findes i membranerne i immunceller, såsom neutrofiler, dendritiske celler og makrofager samt på celler af hudoverfladen og uro-genital og mavetarmkanaler [7] . Toll-lignende receptor-aktivering er ansvarlig for drab på mikrobielle celler under infektion mens værten celler intakte [8-10]. Ligner andre TLRs er TLR4 består af tre domæner: en ekstra-cellulære domæne omfattende resterne 24-631 og indeholder leucin-rige gentagelser (LRRs), en trans-membran region med en enkelt trans-membran helix mellem resterne 632-652, og et C-terminalt cytoplasmatisk domæne signalering [11, 12]. TLRs udgør en særlig vigtig gruppe af mønstergenkendelse receptorer (PRRS) [13], og er placeret på celleoverflader eller inden endosomer. Disse er overvejende udtrykt i væv er involveret i immunforsvaret og har vigtige roller i host forsvar mod patogene organismer. Til dato har 10 funktionelle TLRs blevet beskrevet hos mennesker; TLRs 11-13 findes hos gnavere (rotter og mus) [14] .TLRs spiller en afgørende rolle i aktiveringen af ​​immunsystemet ved at regulere produktionen af ​​antivirale peptider og inflammatoriske cytokiner [15-19] til stærkt konserverede strukturelle motiver kendt som patogen-associeret molekylære mønstre (PAMPs) .TLRs har været impliceret i medfødte immunitet [5, 12, 20, 21], og ændringer af TLR reaktioner kan resultere i alvorlige virale og bakterielle infektioner eller en højere risiko for kræft [4, 5, 20]; de har også været impliceret i den inflammatoriske reaktion af intestinale epitelceller [22].

signalering domæner af TLR’er er kendt som Toll IL-1-receptor (TIR) ​​domæner fordi de deler homologi med signaleringsdomæne af IL -1R familiemedlemmer [23], som inducerer NF-kB og IRF3 translokation og trans-aktivering [24] og aktiveringen af ​​forskellige inflammatoriske cytokin gener [25, 26] af en MyD88-afhængige vej fælles for alle TLRs, undtagen TLR3 [ ,,,0],27, 28]. En anden TLR signalering mekanisme kendt som MyD88-uafhængige vej er forbundet med stimulering af IFN-β og modningen af ​​dendritiske celler gennem adapteren Trif /tICAM-1 [29] eller gennem sporvogn /tICAM-2, som er begrænset til den TLR4 pathway [30].

TLR4 genet er lokaliseret på chromosome9 og koder for et protein, der fungerer i immunresponset ved at aktivere nuklear faktor kappa-let kæde-enhanceren af ​​aktiverede B-celler (NF-kB) [ ,,,0],18]. Nedskrivningen af ​​TLR signalering

in vivo

bliver tydeligt gennem tilstedeværelsen af ​​single-polymorfier (SNPs), som har været forbundet med receptor hypo-lydhørhed og følsomhed over for bakterie-, svampe- og virusinfektioner [31]. En tidligere undersøgelse fremhævede inddragelse af TLR aktivering og TLR polymorfier i mange sygdomme, såsom prostatacancer [32]. Derfor kan en formindskelse i funktionen af ​​TLR’er være forbundet til en stigning risikoen for kræft. Det har for nylig vist, at en polymorfi i promotorsekvensen TLR2 og en TLR4 variant allel er involveret i

Helicobacter pylori

(

H

.

pylori

) associeret gastrisk cancer [33, 34] .Desuden en polymorfisme i TLR10-TLR1-TLR6 gen-klyngen er forbundet med en øget risiko for prostatacancer [35], og funktionel TLR4 ekspression in vivo er kendt for at være ansvarlig for LPS-induceret trombocytopeni [36]. TLR-2 polymorfier er også involveret i areduced respons efter udfordring med mykobakterier, whereasTLR4 polymorfier er kendt for at være forbundet med en reduceret respons på lipopolysaccharid og udvikling af mavekræft [37, 38]. A TLR4 SNP (

rs11536898

) er også forbundet med tyktarmskræft [39] .Recently, en human TLR4 (Asp299Gly) SNP er blevet foreslået at være mere specifikt forbundet med LPS hypomodtagelighed og en øget risiko for at udvikle prostatakræft blandt en nord indiske befolkning [40]. Yderligere er TLR’er blevet påvist at spille en rolle i progressionen af ​​polypper til tumorer, og reduceret TLR4 ekspression er blevet associeret med den øgede metastase potentiale af colorektal cancer (CRC) [41, 42]. En syntetisk metaanalyse baseret på data fra 22 studier bekræftede også sammenslutningen af ​​TLR4 SNP Asp299Gly med øget gastrointestinal kræftrisiko, men med nedsat prostatakræft risiko [43]. Men en modstridende rapport af et multi-race undersøgelse foretaget i Malaysia viste ingen sammenhæng mellem en TLR4 polymorfi (Asp299Gly) og risikoen for CRC [44]. Det er således klart, at der er behov for at validere disse resultater yderligere undersøgelser. Den aktuelle undersøgelse har til formål at evaluere udtrykket af TLR4 i CRC og undersøge potentielle konsekvenser af fire SNP’er af humant TLR4 (

rs32770150

,

rs310759931

,

rs10759932and rs4986790

) med risiko for tyktarmskræft i Saudi-Arabien befolkning.

Resultater

Analyse af kliniske data parametre

i alt 115 tyktarmskræft tilfælde og 102 raske kontrolpersoner indgik i Studiet. De kliniske karakteristika for patienterne, herunder alder, nationalitet, familiens historie, rygevaner, og stadium af tyktarmskræft, blev opsamlet og sammenlignet med dem for kontrolpatienterne (tabel 1). Undersøgelsen alder varierede mellem 45 og 88 år, med en gennemsnitsalder på 56,04 ± 14,37 for tilfælde tyktarmskræft og 52,84 ± 15,88 for kontrollen. Der var ingen signifikant forskel i den gennemsnitlige alder mellem de to grupper. Den mandlige og kvindelige forholdet var ikke signifikant forskellig mellem de tilfælde og kontroller (66/49 for patienter og 60/42 for kontroller).

Øget TLR4 genekspression i tyktarmskræft væv i forhold til at matche normale væv

De vævsprøver anvendt til RNA-analyse (n = 40 matchende væv) blev straks gemt i RNA-senere løsning. Efter RNA-ekstraktion, en kvantitativ real-time revers transkription PCR blev udført for at sammenligne mRNA differentiel ekspression af TLR4. Som vist i fig 1A, blev TLR4 stærkt udtrykt (p 0,001) i colon cancer væv sammenlignet med normale colon væv (2,53 ± 0,32) og (1,01 ± 0,01) (fig 1A)

Totalt cellulært. RNA frisk ekstraheret fra tilsvarende normale og tyktarmskræft væv blev revers transkriberet til cDNA og derefter anvendt til at måle TLR4mRNA ekspression (Panel A). Væv blev immunofarvet via bestemte TLR4 antistof (panel B).

For at bekræfte mRNA udtryk data, vi bestemmes TLR4 proteinekspression ved immunhistokemi. Som vist i (Fig 1B), blev positive immunofarvning for TLR4 generelt observeret i kolon epitelceller og også i nogle stromale segmenter celler. Men intensiteten af ​​farvningen var højere i adenocarcinom kolon tumorvæv.

Sammenhæng mellem TLR4 polymorfier og modtagelighed for udvikling tyktarmskræft i saudiarabiske patienter

Fordelingen af ​​alleler og genotyper og sammenslutningen analyse er beskrevet i tabel 2. Alle SNPs genotypede blev testet for Hardy-Weinberg ligevægt (HWE). DNA-prøver fra blod af de 115 patienter og 102 raske kontrolpersoner blev genotype for tilstedeværelsen af ​​fire TLR4 SNP’er (

rs2770150

T /C,

rs10759931

A /G,

rs10759932

T /C og

rs4986790

A /G). De fænotypiske og genotypiske karakteristika for patient- og kontrolgrupper er sammenfattet i tabel 3.

De data for tre TLR4 SNPs,

rs2770150

,

rs10759932

og

rs4986790

, som er placeret i promotoren, viste ikke nogen sammenhæng med tyktarmskræft i Saudi befolkning. For SNP

rs10759931

, hvilket resulterer i Asp299Gly, fordelingen af ​​alleler og genotyper var signifikant forskellige mellem patienter og kontroller. G-allelen viste sig at være signifikant mere meget hyppigere blandt patienterne (0,87) sammenlignet med kontrolgruppen (0,3). En homozygot GG i samme SNP var også meget hyppige i patienten sammenlignet med kontrolgruppen (0,81

vs

. 0,1) og blev stærkt associeret med udvikling af tyktarmskræft blandt Saudi befolkning. tilstedeværelsen af ​​allelen A i tilfælde af heterozygoter og homozygote (AA) synes imidlertid at bibringe beskyttelse mod kolorektal cancer (OR 0,026; 95% CI 0,011-0,058; p ≤0.00001).

associering mellem genotypefrekvenser af TLR4 gen polymorfier og køn

for at vurdere sammenhængen mellem tyktarmskræft risiko og individuelle SNPs baseret på en patients køn blev genotype distributioner efter køn i tyktarmskræft sammenlignet med de kontrolpersonerne (tabel 3 og 4). Interessant nok i den kvindelige gruppe (35 patienter og 31 kontroller), T allel af SNP rs2770150 præsenteret en frekvens, der var signifikant højere hos patienter end i kontrollerne (0,78 versus 0,6) (OR 2,38; 95% CI 1,2-4,8 og p = 0,012). Omvendt genotyper TC og CC var fire gange mindre hyppige i de tilfælde, sammenlignet med kontrollerne (OR 0,14; 95% CI 0,04-0,48 og p = 0,0009). Allele (C) signifikant meget hyppigt blandt kontrollerne (0,40) sammenlignet med patientgruppen (0,22) (p = 0,0002). Fordelingen af ​​CC genotype mellem påvirkede og ikke-påvirkede hunner var forskellige (p = 0,019) (tabel 3). SNP

rs2770150

CC genotype ikke viste signifikant risiko i kvindelige patienter efter anvendelse Bonferroni korrektion. I modsætning hertil SNP

rs2770150

var ikke forbundet med kolorektal cancer hos mænd (40 patienter og 34 kontroller (tabel 4).

SNP

rs10759931

, som viste en høj association med tyktarmskræft risiko i den samlede befolkning, også præsenteret en signifikant association i den kvindelige (46 patienter og 38 kontroller) og mandlige (62 patienter og 48 kontroller) undergrupper. Men genotyper GA og AA i den kvindelige gruppe var hyppige i kontrolprøverne sammenlignet med patienter tyktarmskræft (OR = 0,025 95% CI 0,007-0,090 og p 0,00001; tabel 3) Det samme blev gjort i de mandlige patienter sammenlignet med de raske mænd:. Georgien + AA var 0,2 og 0,87 (p 0,00001; tabel 4) for SNP’er

rs10759932

og r

s4986790

, ingen signifikant forskel i fordelingen af ​​genotyper mellem berørte og ikke-berørte kvinder og mænd. blev observeret (p 0,05). (tabel 3 og 4)

associering mellem genotypefrekvenser af TLR4 gen polymorfier og alder

Yderligere analyse af TLR4 genotype fordeling efter korrelation med alderen viste, at medianalderen for debut af nuværende tyktarmskræft prøver er 56 år, og i kontrolgrupper er 52 år. For at evaluere associationen mellem TLR4 SNP’er med en yngre alder ved diagnose af coloncancer, vi stratificeret patienterne som ≤50 eller 50 år. Genotypen fordeling for de enkelte SNPs sammen med den statistiske analyse er vist i tabel 5 og 6.Det T allel af SNP rs2770150 præsenteret en frekvens, der var signifikant højere hos patienter over 50 år end i kontrollerne. Omvendt C allelen var signifikant mindre hyppige i de tilfælde, sammenlignet med kontrollerne (0,24 versus 0,36) (OR 0,57; 95% CI 0,3-0,9 og p = 0,038) (tabel 6), hvorimod ikke blev observeret nogen forskel for denne SNP for undergruppen med patienter under 50 (tabel 5). Men efter anvendelse Bonferroni korrektion SNP rs2770150 CC genotype ikke viste signifikant risiko i 50 år gammel patients.rs10759931, som viste en signifikant association i den samlede undersøgelse, også indikeret en betydelig risiko i begge subpopulationer af patienter (p 0.00001) (tabel 5 og 6). Ingen signifikant forskel i fordelingen af ​​genotyper mellem berørte og ikke-berørte personer for begge subpopulationer blev observeret (p 0,05) for de to andre SNPs (

rs10759932

rs4986790

; Tables 5 og 6).

inflammatoriske Innate Molekyler respons i forhold til tyktarmskræft udvikling

Formålet med denne undersøgelse var at evaluere forskelle og relationer mellem ekspression af TLR4 og cytokiner, specifikt variationer i ekspressionen af ​​inflammatoriske cytokiner interleukin (IL1β1, IL6, IL-8 og IL-17. tilstedeværelsen af ​​inflammatoriske celler og ekspressionsniveauer af vigtige cytokiner involveret i tyktarmskræft inflammationsprocessen blev kvantificeret ved anvendelse af real-time reverse transkriptase (RT) -PCR fra 40 coloncancer væv og 40 normale matchende væv. mRNA’et af cytokiner var væsentligt højere niveauer (10-22 ganges forskelle) i colon cancer væv sammenlignet med normale colon prøver, som vist i figur 2, idet de højere proinflammatoriske responser i CRC prøver. Dette skyldes overekspression af TLR4 aktivitet hos patienter med tyktarmskræft.

Cytokinproduktion blev vurderet ved QRT-PCR på colon cancer væv og matchende normale væv (gennemsnit ± SD, n = 40 patienter, data normaliseret til

GAPDH

, kontrol (åbne søjler), kræft (massive søjler), * P 0,00 t-test)

Øget NF-KB-p65-ekspression i colon cancer væv

for at bekræfte vores hypotese, at den meget niveau af TLR4 i kolon kræftpatienter fører til induktion af et inflammatorisk respons medieret af multiple pathways specifikt NF-KB og inducere en akut sekretion af inflammatoriske cytokiner som såsom IL-6, en sammenlignende undersøgelse af NF-KB-ekspression blev udført ved immunhistokemi på kræft kolon væv og normale matchende væv. Immunhistokemi analyse afslørede, at NF-KB p65-ekspression i colon cancer væv kraftigt i forhold til normal colon væv (Fig 3) .Vores resultater antyder en kritisk rolle af NF-KB som signalmolekyle i inflammatoriske proces, som letter ekspression og sekretion af pro-inflammatoriske cytokiner, der fører til en række inflammatoriske reaktioner fra TLR4 aktivering. Salg

Væv blev immunofarvede via bestemte NF-kB-antistof (p65) ved 1/100 (n = 10).

diskussion

Sammenhængen mellem betændelse og carcinogenese blev første gang beskrevet for 10 år siden [45-47] .Siden da har betændelse blevet rapporteret at øge proliferation og migration /invasion i forskellige typer af tumorceller [47 ], og forbindelsen mellem kommensale mikroorganisme-induceret betændelse af slimhinden er for nylig blevet mistænkt for at være knyttet til CRC. Omvendt vores hypotese er, at TLR4 spiller en vigtig rolle i det medfødte immunsystem, og at ændringen af ​​den strukturelle funktion af dette protein, hvilket i sidste ende hæmmer immunovervågning i colon mucosa, kan føre til tumorudvikling [48]. Det er dokumenteret, at TLR4 aktivering fremmer carcinogenese og modstandsdygtighed over for kemiske behandlinger i brystkræft [49, 50], mens blokere TLR4 aktivering kan bremse brystkræft vækst og forlænge overlevelsen [2]. Derfor er vi først undersøgt sammenhæng mellem modtagelighed for at udvikle CRC i Saudi befolkning og TLR4 udtryk og TLR4 polymorfi. Vores resultater viser, at TLR4 er overudtrykt i tyktarmskræft tumor epitelceller, som udgør den første linje i forsvaret mod udenlandske agenter. Desuden er vores analyse viste også, at TLR4 ekspression er signifikant forøget i colon tumorvæv sammenlignet med matchende normale colonvæv. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere arbejde rapporterer overekspression af TLR4in forskellige kræftformer, såsom gastrisk cancer progression [51], brystkræft [49, 50, 52], tyktarmskræft [52], og ovariecancer [53]. Det højere i TLR4 ekspression i colon cancer væv sammenlignet med normalt væv skyldes primært infektioner med bakterier i colon hos mennesket, der forklarer en potentiel oprindelse for tyktarmskræft. Disse resultater tyder på, at aktiveringen af ​​TLR4 ekspression i colon cancervæv kan fremme tumorvækst og modstandsdygtighed over for apoptose, en konklusion, der understøttes af den tidligere undersøgelse, som viste, at blokering af TLR4 signalering forsinkelser tumorvækst og forlænger overlevelsen af ​​dyr [41 , 54]. TLR4 signalering i kræft betragtes som en tveægget sværd: hvis TLR4 er aktiveret på immunceller, kan det forbedre anti-tumor-immunitet, og dermed TLR4 kunne anvendes som en markør til påvisning af en disposition for en cancer; dog kronisk betændelse fremkaldt af TLR4 aktivering er en stor risikofaktor for udviklingen af ​​kræft [55] .TLR4 kunne være en vigtig aktør i tyktarmskræft udvikling og nedskrivninger inTLR4 signalering in vivo bliver tydeligt gennem tilstedeværelsen af ​​single-polymorfier (SNPs).

Dette er den første rapport undersøger en mulig sammenslutning af flere commonTLR4 polymorfier med tyktarmskræft i Saudi Arabians. I betragtning af den højere frekvens af

TLR4

G allel i CRC patienter sammenlignet med raske kontrolpersoner, klare beviser præsenteres for en ny sammenhæng mellem TLR4

rs10759931

polymorfi og modtagelighed for udvikling tyktarmskræft i Saudi Arabian befolkning.

TLR4

GG genotypen er den mest udbredte i Mellemøsten, især i den saudiarabiske befolkning. Denne polymorfi påvirker hele befolkningen uden at være specifik for begge køn eller enhver aldersgruppe. AA-genotypen er generelt repræsenteret i andre populationer og er beskyttende mod tyktarmskræft således GG genotype kan tjene som en genetisk markør til diagnosticering af coloncancer i denne etniske population. I modsætning hertil

TLR4

polymorfi

rs2770150

er associeret med tyktarmskræft hos kvinder over 50 år, og er tæt forbundet med de reducerede niveauer af kvindelige kønshormoner i løbet af postmenopausale periode. Tidligere undersøgelser har allerede beskrevet rolle østrogen og progesteron i beskyttelsen mod tyktarmskræft hos kvinder [56-59]. I den forstand undersøgte vi denne polymorfi i præ- og postmenopausale kvinder til at afklare dette fænomen.

Den mest almindelige missense polymorfisme, D299G, som forekommer i exon 4 af det humane TLR4 gen (A896G), ligger inden for det ekstracellulære domæne af receptoren. X-ray strukturer af både vildtype og muteret (D299G) receptorer med LPS og MD-2 domæner er blevet bestemt [60], der tydeligt viser, at denne polymorfi ikke påvirker dimerisering men medfører en betydelig lokal konformationel ændring på den D299G websted [61]. Denne konformationelle ændring kan forringe ligandbinding og sænke receptorens signalering respons på LPS, og nedsat TLR4 signalering har vist sig at interferere med rekruttering af MyD88 og Trif [62], hvilket ville føre til en deprimeret immunreaktion mod enhver kommensal bakteriel aggression i slimhinde celler. Denne polymorfi sammen med TLR4rs2770150 viste ingen sammenhæng med tyktarmskræft i denne etniske gruppe, selv om disse to SNPs viste en stærk forbindelse med prostatakræft [32] og gastrisk kræft [63] i andre undersøgelser, og i andre populationer.

TLR4 Aktivering af ligander fører til cytokinproduktion, der fremmer en vigtig rolle i patogenesen af ​​samme cancer, især i initiering og vedligeholdelse af inflammation. Rollen af ​​cytokiner, såsom IL-6 spiller vigtige roller i en lang række biologiske aktiviteter i immune hematopoies er regulering og onkogenese. De fleste af disse cytokiner er også blevet påvist i flere epiteliale tumorer [64], er involveret i proliferation og differentiering af forskellige maligne tumorceller [65]. Overekspression af IL-6 er blevet fundet i prostatacancer [66, 67], brystcarcinom [68] og mundtlige pladecellecarcinom [69].

Her viser vi forøget ekspression af TLR-4 på coloncancer væv og dets rolle i de inflammatoriske veje især via NF-KB-vej, en fundamental molekylær hub forbinder inflammation og cancer. Inhibering af aktiveringen af ​​NF-KB ved at blokere MyD88 signal vil reducere frigivelsen af ​​proinflammatoriske cytokiner, lindre inflammatoriske respons og opnå en terapeutisk virkning.

Sammenfattende tilvejebringer vi forbindelser mellem TLR4 genekspression og TLR4 polymorfier, som er blevet antaget som vigtige for den kræftfremkaldende proces for tyktarmskræft i Saudiarabien befolkning. Vores data tyder på, at genetisk variation i TLR4 kan påvirke udviklingen af ​​tyktarmskræft. Replikation af disse fund er berettiget i betragtning af den biologiske sandsynlighed for foreningen og samspillet med kost og livsstil faktorer, der kan ændre disse genetiske effekter. Desuden mener vi, at vores undersøgelse giver en vigtig mekanistisk link, der kunne være udgangspunktet for yderligere undersøgelser, og vigtige SNPs i denne gener kunne muligvis tjene som biomarkører for beslutningstagning i tyktarmskræft behandling.

Materialer og metoder

undersøgelse befolkninger og prøvetagning

i alt 115 tyktarmskræft tilfælde og 102 raske kontrolpersoner blev inkluderet i denne undersøgelse, som blev godkendt af den lokale institutionelle review board. Prøverne blev rekrutteret fra King Khalid Universitetshospital i Riyadh, Saudi-Arabien. Alt spørgeskema data og (væv og blod) prøver blev indsamlet i den indledende rekruttering af både sager og kontroller. Deltagerne blev bedt om at udfylde et selvadministreret spørgeskema om deres sociodemografiske kendetegn (fx alder, familie historie af kræft), livsstil (for eksempel, rygevaner og alkoholindtag), og personlig sygehistorie. De sager og kontroller blev frekvens-matches af alder og køn. De kliniske karakteristika for de patienter, herunder alder for udvælgelsen af ​​den saudiske befolkning (ikke-saudiarabiske borger personer blev udelukket), familie historie, rygevaner, stadie af tyktarmskræft, medicin og tilstedeværelsen af ​​andre sygdomme blev indsamlet og sammenlignet. Undersøgelsen alder varierede mellem 45 og 88 år, med en gennemsnitsalder på 57,04 ± 14,37 for tilfælde tyktarmskræft og 56,51 ± 15,70 for kontrollerne (tabel 1). Vævsprøverne blev anvendt til RNA-ekstraktion. Blodprøverne blev opbevaret i EDTA-rør ved -80 ° C og anvendt til genomisk DNA ekstraktion.

Generelle reagenser

DNA /primere og SNP’er blev opnået fra Life Technologies /Invitrogen (Burlington, ON , Canada). Anti-TLR4 antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA, USA) .RNA senere for RNA stabilisering opnåedes fra Ambion /Life Technologies (Burlington, ON, Canada). RNA kits var fra Qiagen (Hilden, Tyskland). CDNA høj kapacitet revers transkription kit var fra Applied Biosystems (Warrington, USA). SYBR Green blev opnået fra Bio-Rad (Mississauga, ON, Canada).

DNA-ekstraktion

Genomisk DNA blev ekstraheret fra helblod ved anvendelse af Qiamp kittet (Qiamp DNA Blood Mini Kit, Qiagen, Valencia, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Kort beskrevet blev 200 til 300 pi blod opbevaret i EDTA-rør ved -80 ° C i ligevægt ved stuetemperatur, blandet med protease og lysepuffer og inkuberet ved 56 ° C i 10 minutter. Derefter blev 100% ethanol tilsat, og blandingen blev passeret gennem søjlen ved hjælp af centrifugering. Søjlen Membranen blev vasket, og DNA’et blev elueret with100 pi elueringspuffer (AE). Koncentrationen af ​​ekstraheret DNA blev bestemt ved anvendelse af en Nano-Drop8000spectrophotometer (Thermo Scientific) .Den renheden af ​​DNA blev evalueret ved standard A260 /A280 og A260 /A230-forhold.

Total RNA isolering

I alt væv RNA blev isoleret ved anvendelse af DNA /RNA Mini kit (Qiagen, Hilden, Tyskland), som beskrevet af Alanazi et al [70]. Kort fortalt blev væv lyseret i 350 μllysis puffer med 3,5 pi β-mercaptoethanol. Lysatet blev efterfølgende filtreret og homogeniseret med 70% ethanol, og DNA’et blev fyldt på søjlen og fordøjet med DNase ved stuetemperatur i 30 minutter. Bagefter blev søjlen vaskes membranen, og RNA blev elueret med 40 pi RNase-frit H

2O og opbevaret i opsamlingsrør nuklease-fri ved -80 ° C. Den koncentration, renhed og kvalitet af den isolerede RNA blev alle bestemt ved anvendelse af Agilent 2100 Bio analysesystemer og Agilent Lille RNA-analyse kit ifølge instruktionerne fra producenten (Agilent Technologies, Waldbronn, Tyskland).

cDNA-syntese

som beskrevet af Semlali et al [71, 72], 1 pg af RNA hver prøve blev revers transkriberet til cDNA under anvendelse af en høj kapacitet cDNA revers transkription kit (Applied Biosystems, Warrington, USA) .De betingelser til fremstilling af cDNA templates til PCR-analyse var 10 minutter ved 25 ° C, 2 timer ved 37 ° C, og 5 minutter ved 85 ° C. Det syntetiserede cDNA blev lagret ved -20 ° C eller 4 ° C til efterfølgende PCR-reaktioner.

Kvantitativ realtids-PCR

TLR4 mRNA-ekspression blev detekteret ved RT-qPCR som tidligere beskrevet [71 , 72]. Ekspressionen af ​​hus-føring gen GAPDH blev anvendt som en endogen kontrol for normalisering af mængden af ​​prøven RNA. Reaktionerne blev udført ved anvendelse af en PCR SYBR Green Supermix fra Applied Biosystems. Sekvenserne for TLR4, cytokiner og GAPDH-primere er vist i S1 tabel.

Real-time PCR blev udført ved anvendelse a7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Primerne blev tilsat til reaktionsblandingen ved en slutkoncentration på 250 nM. Som tidligere beskrevet [72], 5μlof hver cDNA-prøve blev tilsat til en 20-pi PCR blanding indeholdende 12,5 pi SYBR Green Supermix, 0,5 pi specifikke primere og 7 pi RNase- /DNase-frit vand. PCR-reaktionen bestod af med 50 ° C i 2 minutter og 95 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 sekunder, 62 ° Cfor30 minutter og 30 sekunder ved 72 ° C. Alle real-time PCR assays blev udført tre gange, og specificiteten af ​​hvert primerpar blev verificeret ved tilstedeværelsen af ​​en top enkelt smeltetemperatur. GAPDH produceret ensartede ekspressionsniveauer varierende med mindre end 0,5 CT’er mellem prøve betingelser og blev derfor anvendt som reference gen til denne undersøgelse. De amplificerede produkter blev separeret på en agarosegel for at bekræfte, at der ikke var nogen falske produkter amplificeret. Resultaterne blev analyseret ved hjælp af 2

-ΔΔCt (Livak) relativ udtryk metode.

Immunhistokemi (IHC) analyse

Paraffin-indlejrede blokke af tyktarmskræft og normale colon vævsprøver blev skåret i 3-um-tykke snit. Disse blev monteret på saltvand-coatede objektglas og inkuberet i 15 til 20 minutter i en varmluftsovn ved 60 ° C. Vævssnit blev deparaffineret med EZ Prep (Ventana, Arizona, USA) ved 75 ° C, varme forbehandlet i Cell Conditioning 1 (CC1, Ventana, Arizona, USA) under anvendelse af en “standard celle conditioning” protokol for antigen-genvinding ved 100 ° C, og derefter inkuberet med en dråbe inhibitor opløsning i fire minutter ved 37 ° C. Objektglas blev derefter vasket og inkuberet i 32 minutter ved 37 ° Cwith anti TLR4 og anti NF-KB (fortyndet 1: 100; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) primært antistof og efterfølges af en inkubering med det sekundære antistof UltraView universel HRP multimer . De immunolocalized TLR4 proteiner blev visualiseret ved hjælp af en kobber-forstærket DAB reaktion.