PLoS ONE: Rolle af IGF-bindende protein 3 i modstandsbevægelsen af ​​EGFR Mutant Lung Cancer Cells til EGFR-Tyrosin kinase Inhibitors

Abstrakt

De fleste patienter, der behandles med EGFR-tyrosinkinaseinhibitorer (EGFR-TKI’er) til sidst udvikle erhvervet resistens. Tab af ekspression af insulin-lignende vækstfaktor (IGF) -bindende protein-3 (IGFBP-3) er blevet foreslået som en mulig mekanisme af resistens over for EGFR-TKI’er i A431 og HN11 cellelinier. Her, undersøgte vi IGFBP-3-ekspression i to EGFR mutant lungekræft cellelinier med resistens over for EGFR-TKI’er og undersøgt værdien af ​​serum IGFBP-3-niveau som en markør for resistens. Virkningen af ​​induktion eller undertrykkelse af IGFBP-3-ekspression på modstand blev også evalueret. HCC827 underlinjer med resistens over for gefitinib (HCC827 /GR) og erlotinib (HCC827 /ER) blev etableret. Tab af IGFBP-3-ekspression blev detekteret ved Western blotting i begge cellelinier uden ændringer i transkriptionsaktivitet, og ELISA viste signifikant lavere mængder af secerneret IGFBP-3 i dyrkningsmedierne af de mutante cellelinier end for den parentale linje. Trods tabet af IGFBP-3-ekspression, IGFR signaleringsaktivitet forblev uændret. Tvunget udtryk for IGFBP-3 ved adenovirus-medieret transfektion eller rekombinant IGFBP-3 let øget vækst-hæmmende og apoptotiske virkninger af EGFR-TKI’er, hvorimod undertrykkelse af IGFBP-3 ikke påvirkede følsomhed over for EGFR-TKI. Serum IGFBP-3 niveauer målt ved ELISA før og efter udviklingen af ​​EGFR-TKI-resistens hos 20 patienter viste ingen signifikante ændringer (1815,3 ± 94,6 ng /ml inden behandling vs. 1778,9 ± 87,8 ng /ml efter EGFR-TKI resistens). Sammenfattende selvom IGFBP-3 nedregulering er forbundet med erhvervelse af resistens over for EGFR-TKI’er uanset mekanismen, dens virkning på modstanden var ikke signifikant, hvilket indikerer, at IGFBP-3 ikke kan spille en vigtig rolle i resistens over for EGFR-TKI’er og serum IGFBP-3-niveau er ikke en pålidelig indikator for modstand

Henvisning:. Choi YJ, Park GM, Rho JK, Kim SY, så GS, Kim HR, et al. (2013) rolle IGF-bindende protein 3 i modstandsbevægelsen af ​​EGFR Mutant Lung Cancer Cells til EGFR-tyrosinkinaseinhibitorer. PLoS ONE 8 (12): e81393. doi: 10,1371 /journal.pone.0081393

Redaktør: Giuseppe Viglietto, University Magna Graecia, Italien

Modtaget: 13. maj 2013; Accepteret: 14 okt 2013; Udgivet: December 5, 2013 |

Copyright: © 2013 Choi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling (2011-467) fra Asan Institut for Life Science, Seoul, Korea. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

EGFR er et transmembrant receptor, som tilhører en familie af fire beslægtede proteiner, EGFR (ErbB-1), HER2 /neu (ErbB-2), HER3 (ErbB-3) og HER4 (ErbB-4) [1]. Ved ligandbinding, EGFR former homo- eller heterodimerer med andre ErbB-receptorer, der fører til aktivering af intracellulære signalveje kaskader. De to store intracellulære signalveje, der aktiveres af EGFR er RAS-RAF-MEK-MAPK-vejen, som kontrollerer gentranskription, cellecyklusfremadskriden og celleproliferation, og PI3K-Akt pathway, som aktiverer en kaskade af anti-apoptotiske og prosurvival signaler . [2]

Ikke-småcellet lungekræft (NSCLCs), der huser aktiverende mutationer og /eller forstærkning af EGFR locus er særligt følsomme over for EGFR-tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er) såsom gefitinib (Iressa; AstraZeneca International) og erlotinib (Tarceva, OSI Pharmaceuticals) [3] – [9]. Ca. 70-80% af NSCLCs huser en somatisk mutation i tyrosinkinasedomænet af EGFR-genet reagerer på gefitinib /erlotinib [3], [4], [10]. Men erhvervet resistens over for EGFR-TKI-terapi næsten altid udvikler sig efter en median på ca. 10 måneder fra start af behandling, selv hos patienter, der udviser en indledende dramatisk respons på disse stoffer. Erhvervet resistens er blevet forbundet med en sekundær mutation i EGFR-genet, T790M [11], [12], som er blevet påvist hos ca. 50% af cancere med erhvervet resistens over for EGFR-TKI’er [13], [14]. Desuden blev amplifikation af MET onkogen identificeret som en anden mekanisme af erhvervet resistens medieret af phosphorylering af ErbB-3 og den deraf følgende aktivering af PI3K [15], [16]. Tilsvarende overekspression af AXL kinase er blevet associeret med resistens over for EGFR-TKI’er [17].

I en nylig undersøgelse, tab af ekspression af insulin-lignende vækstfaktor (IGF) -bindende protein 3 (IGFBP- 3) blev foreslået som en mulig mekanisme af resistens i A431 og HN11 cellelinier [18]. I den undersøgelse erhvervet resistens over for EGFR-TKI’er blev modelleret ved anvendelse af A431 skællede cancercellelinie, som huser vildtype EGFR-genamplifikation. Den gefitinib-resistente A431 A431 GR opretholdt PI3K-signalering i nærvær af gefitinib ved at aktivere IGF1 receptor (IGF1R) pathway. Inhibering af IGF1R signalering restaureret evne gefitinib at nedregulere PI3K /Akt signalering og inhiberer A431 GR cellevækst. Genekspression analyser viste signifikant nedregulering af IGFBP-3-ekspression i A431-GR-celler, og tilsætning af rekombinant IGFBP-3 genoprettede evnen for gefitinib at nedregulere PI3K /Akt signalering og at inhibere cellevækst. I en anden model af erhvervet gefitinib resistens etableret i gefitinib-sensitive vildtype EGFR udtrykkende HN11 hoved- og halscancer cellelinje blev Akt phosphorylering opretholdt i nærværelse af gefitinib, og modstanden blev overvundet ved kombineret EGFR og IGF1R inhibering. Kollektivt antyder disse resultater, at tab af ekspression af IGFBP’er i tumorceller behandlet med EGFR-TKI’er resulterer i aktiveringen af ​​IGF1R signalering, hvilket igen medierer resistens over for EGFR antagonister. Derfor kombineret terapeutisk inhibering af EGFR og IGF1R kan ophæve denne erhvervet mekanisme af resistens over for lægemidler. Imidlertid har en model af erhvervet resistens til gefitinib ikke udviklet i EGFR mutant lunge kræftceller, hvilket er af klinisk betydning.

De fleste af de cirkulerende IGF-1 binder til hovedstolen IGF-bindende protein, IGFBP- 3 [19]. Serum IGF-1 og IGFBP-3-koncentrationer kan måles let og kunne have værdi som indikatorer for risiko kræft. Epidemiologiske undersøgelser har vist, at høje IGF-1 og lave IGFBP-3 niveauer uafhængigt forbundet med en høj risiko for almindelige cancerformer, herunder lungecancer [20]. IGFBP-3 er blevet foreslået som et potentielt mål for lungekræft behandling, som adenovirus-medieret overekspression af IGFBP-3 inhiberede væksten af ​​NSCLC-celler in vitro og in vivo ved at inducere apoptose gennem inhibering af PI3K /Akt /PKB og MAPK signalveje [21].

i den foreliggende undersøgelse blev IGFBP-3-ekspression undersøgt i EGFR mutant lungecancerceller med erhvervet resistens over for EGFR-TKI’er, og værdien af ​​serum IGFBP-3-niveau blev evalueret som en markør for resistens. Effekten af ​​induceret IGFBP-3 på at overvinde modstanden blev også evalueret.

Materialer og metoder

Cell Culture og reagenser

HCC827 cellelinje blev købt fra American Type Culture Collection (ATCC: Rockville, MD, USA). Celler blev dyrket i RPMI 1640 medium indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin og 100 enheder /ml penicillin og streptomycin, og holdt ved 37 ° C i et fugtigt kammer indeholdende 5% CO

2. Gefitinib og erlotinib var køb fra Selleck kemikalier (Houston, TX, USA). Rekombinant humant IGFBP-3 (RH IGFBP-3) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Adenovirusvektoren udtrykker humant IGFBP-3 (Ad /IGFBP3) blev venligst stillet til rådighed af Dr. Ho-Young Lee (The University of Texas MD Anderson Cancer Center) [21].

Etablering af Gefitinib- og Erlotinib -resistente cellelinier

gefitinib og erlotinib-resistente varianter af HCC827 blev isoleret ved trinvis eksponering for stigende doser af gefitinib og erlotinib. HCC827 celler blev behandlet med 10 nM gefitinib og erlotinib i 72 timer. Celler blev kontinuerligt udsættes for stigende lægemiddelkoncentrationer på op til 1 uM over 8 måneder. EGFR-TKI-resistente kolonier blev udvalgt ved koncentrationer eksponering af 5 uM, og de to isolerede kloner blev betegnet som HCC827 /GR og HCC827 /ER hhv. Generering af HCC827 /ER cellelinje er tidligere blevet beskrevet [17]. Resistente celler blev opretholdt i medikamentfrit medium i mindst 2 uger før eksperimenter for at fjerne virkningerne af lægemidlerne.

Cell Levedygtighed Assay

levedygtigheden af ​​cellerne blev målt ved anvendelse af MTT assay og trypan blå celletælling. Celler blev udpladet i 96-brønds sterile plastplader og udsat for varierende koncentrationer af lægemidler i medium indeholdende 1% FBS. Efter 72 h, 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) blev tilsat, og krystallinsk formazan blev opløseliggjort med natriumdodecylsulfat (SDS) opløsning.

de kombinerede virkninger blev vurderet med trypan blå celletælling. HCC827 /GR og HCC827 /ER-celler blev udpladet i 60 mm skåle og behandlet med EGFR-TKI’er og Ad /IGFBP-3-infektion eller rh IGFBP-3 i 72 timer i medium indeholdende 1% FBS. De celletal blev bestemt med en ADAM-MC automatisk celletæller (NanoEnTek, Seoul, Korea), ifølge producentens instruktioner. Resultaterne er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg og fejlsøjlerne tilkendegiver standardafvigelser (SDS).

Western Blot

Proteiner blev separeret på SDS-polyacrylamidgeler, og elektrooverført til Immobilon-P-membraner (Millipore, Bedford, MA, USA). Antistoffer specifikke for p-EGFR, EGFR, MET, Her2, Her3, IGF1R, p-Akt, Akt, p-ERK, ERK, Axl, IGFBP-3 og actin blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), og dem, for p-HER2, p-ErbB3, p-MET og p-IGF1R (Tyr1131 og Tyr1135 /1136) fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Proteiner blev påvist med et forstærket kemiluminescens Western blotting (Amersham Biosciences, NJ, USA), ifølge producentens anvisninger.

Semikvantitativ Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

Total RNA-isolering og cDNA-syntese blev udført under anvendelse af RNA mini-kit protokol (Qiagen Inc., Valencia, CA) og Accupower RT mix reagens, ifølge producentens anvisninger (Bioneer Corp., Seoul, Korea). De oligonukleotidsekvenser til amplifikation var som følger: fremadrettet primer, 5’ATATGGTCCCTGCCGTAGA-3 ‘, og revers primer, 5′-AAATCGAGGCTGTAGCCAG-3′, for IGFBP-3; fremadrettet primer, 5’-GCGAGAAGATGACCCAGATC-3 ‘, og revers primer, 5′-CCAGTGGTACGGCCAGAGG-3’, for β-actin.

Transfektion af Lille interfererende RNA

Små interfererende RNA (siRNA ) oligonucleotider specifikke for IGFBP-3 blev opnået fra Thermo (Thermo Electron Corp., Waltham, MA; IGFBP-3 siRNA-1) og Qiagen (IGFBP-3 siRNA-2). Transfektion af siRNA blev udført under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Målgenekspression blev målt 24 timer senere med western blot-analyse. For MTT-assayet blev celler podet på plader med 96 brønde efter siRNA transfektion, derefter behandlet med de angivne lægemidler i 72 timer.

ELISA for Serum IGFBP-3 ELISA

Residual serum efter rutine kemi test blev indsamlet fra 20 patienter før EGFR-TKI-terapi og efter erhvervelsen af ​​EGFR-TKI’er modstand med skriftligt informeret samtykke. Det blev opbevaret ved -80 ° C indtil assay. IGFBP-3-koncentrationer i celledyrkningsmediet og serum blev målt under anvendelse af et humant IGFBP-3 ELISA-kit (R nedstrøms Akt signalering blev vedholdende aktiveret i de resistente underlinjer HCC827 /GR og HCC827 /ER.

HCC827, HCC827 /GR og HCC827 /ER2 celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af gefitinib og erlotinib i 72 h i medium, der indeholder 1% FBS. Cellernes levedygtighed og IC

50 værdier blev bestemt ved hjælp af MTT-analysen.

(A) Basal udtryk for EGFR og EGFR-relaterede signalmolekyler i HCC827, HCC827 /GR og HCC827 /ER celler evalueret ved Western blotting. Virkningerne af gefitinib (B) og erlotinib (C) på EGFR-signalering blev også undersøgt. HCC827, HCC827 /GR og HCC827 /ER-celler blev behandlet med 0,1 og 1 uM gefitinib og erlotinib i 72 timer i medium indeholdende 1% FBS. Protein (30 ug) fra cellelysater blev udsat for Western blot analyse for de angivne proteiner.

Tab af IGFBP-3 i HCC827 /GR og HCC827 /ER Celler

Vurdering af IGFBP-3 ekspression og IGF1R signalering i forældrenes og resistente cellelinier viste, at IGFBP-3-ekspression signifikant nedreguleret i HCC827 /GR og HCC827 /eR celler; blev dog opdaget ingen signifikante forskelle i total og aktiveret IGF1R mellem resistente og forældrenes celler (Figur 2). IGFBP-3-sekretion blev signifikant reduceret i HCC827 /GR og HCC827 /ER-celler sideløbende med sin reduceret ekspression niveau (figur 3B). Der blev imidlertid ingen korrelation mellem IGFBP-3-protein og mRNA-niveauer detekteret (figur 3A), hvilket antyder, at nedreguleringen af ​​IGFBP-3 kan ske på post-transkriptionel niveau.

IGFBP-3 mRNA (A) og udskilt IGFBP-3 (B) blev bestemt ved RT-PCR og ELISA i HCC827, HCC827 /GR og HCC827 /ER. ELISA-analysen blev gentaget tre gange, og fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelse (SD). *

P

. 0,001 sammenlignet med HCC827 celler

Følsomhed over for EGFR-TKI’er i Resistente celler blev ikke gendannet ved Induktion af IGFBP-3

For at undersøge inddragelse af IGFBP-3 i modstanden mod EGFR-TKI’er, HCC827 /GR-celler blev mock-inficeret eller inficeret med Ad /IGFBP-3, og induktion af IGFBP-3-ekspression blev bedømt ved Western blotting. Som vist i figur 4A, IGFBP-3 niveauer signifikant højere i HCC827 /GR-celler inficeret med forskellige titere af AD /IGFBP-3 end i fingeret inficerede celler, hvilket er bekræftet ved Western blotting med et anti-FLAG-antistoffet. Endvidere blev IGFBP-3-sekretion i dyrkningsmediet af inficeret HCC827 /GR og HCC827 /ER steg som målt ved ELISA (figur 4B). At undersøge effekten af ​​EGFR-TKI’er på IGFBP-3 overudtrykkende celler, blev celler inficeret med Ad /IGFBP-3 ved 100 MOI og behandlet med EGFR-TKI’er. Men samtidig behandling med Ad /IGFBP-3 og EGFR-TKI’er ikke effektivt at hæmme celleproliferation (figur 4C). For at undersøge rollen af ​​IGFBP-3 i resistens yderligere blev HCC827 /GR og HCC827 /ER-celler behandlet med 1 ug /ml rekombinant human (rh) IGFBP-3 og 1 uM EGFR-TKI’er i 72 timer. Kombineret behandling resulterede i beskeden væksthæmning i HCC827 /GR og HCC827 /ER (37,0% og 32,8%, henholdsvis) på trods af den høje koncentration af rh IGFBP-3 (figur 4D). Selv om genoprettelse af IGFBP-3 inhiberede IGF1R aktivitet, kunne det ikke reducere Akt aktivitet (figur 4E og F). Tilsvarende undertrykkelsen af ​​IGFBP-3 let forøgede IGF1R aktivitet (data ikke vist), men følsomhed over for EGFR-TKI’er blev ikke påvirket (figur 4G og H). Disse resultater viste, at selv induktion af IGFBP-3 let øget effekten af ​​EGFR-TKI’er, var utilstrækkelig til at overvinde EGFR-TKI-erhvervet resistens, hvilket viser, at tabet af IGFP-3 kan ikke være den vigtigste resistensmekanisme i HCC827 celler.

Resistente celler blev inficeret med Ad /IGFBP-3 ved MOI’er af 0 til 100 PFU /celle i 48 timer og IGFBP-3-ekspression blev bestemt ved Western blotting (A) og ELISA (B). (C) HCC827 /GR og HCC827 /ER-celler blev behandlet med den angivne koncentration af EGFR-TKI’er i 72 timer efter infektion med 100 MOI af Ad /IGFBP-3. (D) HCC827 /GR og HCC827 /ER-celler blev behandlet med 1 pM EGFR-TKI’er og 1 ug /ml rh IGFBP-3 i 72 timer. Resultaterne er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg, og fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelse (SD). (E og F) Celler blev behandlet med lægemidler, rh IGFBP-3 eller Ad /IGFBP-3 som i panel C og D. Efter 24 timer blev cellerne høstet, og modulation af EGFR og IGF1R signalering i de angivne cellelinjer blev påvist ved Western blotting. (G) Kontrol og IGFBP-3 siRNAs (100 nM) blev introduceret i HCC827 celler, og IGFBP-3 suppression blev bekræftet ved Western blotting. (H) Cellelevedygtighed blev målt ved anvendelse af MTT-assayet 72 timer senere.

Serum IGFBP3 Niveauer er ikke korreleret med resistens mod EGFR-TKI’er

Serum IGFBP-3-niveau blev målt ved ELISA i 20 NSCLC-patienter, der viste partielle responser på EGFR-TKI behandling. Af disse 20 patienter, 16 havde EGFR-mutationer og fire blev ikke evalueret. Serum IGFBP-3 niveauer blev ikke ændret som reaktion på udviklingen af ​​resistens over for EGFR-TKI’er (1815,3 ± 94,6 ng /mL før behandling vs. 1778,9 ± 87,8 ng /ml efter EGFR-TKI modstand, p = 0,678, figur 5).

IGFBP-3-niveauer blev bestemt ved ELISA i serum hos patienter med NSCLC. Erhvervet resistens udviklet hos alle patienter, der initialt responderede på EGFR-TKI’er.

Diskussion

IGF vej spiller en rolle i reguleringen af ​​fostrets udvikling, vækst af væv og stofskifte. To forskellige ligander (IGF-1 og IGF-2) plus insulin og to receptorer (IGF-1R og insulinreceptoren), der kan både homo- og heteropolymerisation mediere virkningerne af denne vej [22]. IGF-1R har en 15- til 20-fold højere affinitet for IGF-1 end for IGF-2, og alle IGFBP’erne har en større affinitet for IGF-ligand end de tilsvarende IGF-receptorer. Derfor er aktiviteterne i IGF strengt reguleret af en familie af IGFBP’er, og mindst seks IGFBP’erne (IGFBP-1 til IGFBP-6) er blevet identificeret. Blandt dem, IGFBP-3 er den dominerende cirkulerende bindingspartner af IGF, der tegner sig for 70-80% af IGF-1-binding [23]. IGFBP-3 har længe været etableret som en potent negativ regulator af IGF-1R-aktivering og menes at blokere ligandbinding, selvom det også kan have IGF-uafhængig antiproliferative aktiviteter [24].

Deregulering af IGF signalering har blevet beskrevet i adskillige kræfttyper, herunder lungekræft. For nylig, inhibering af IGFR blev vist at forbedre de væksthæmmende og apoptotiske virkninger af geftinib i H1650-celler, som udviser primær resistens mod EGFR-TKI’er trods en deletionsmutation på exon 19 i EGFR-genet. Dette resultat antydede, at kombineret hæmning af IGFR kunne være nyttigt at overvinde modstanden mod EGFR-TKI’er i lungekræft [25]. En række af IGF receptor inhibitorer, herunder monoklonale antistoffer og små molekylære inhibitorer, er for tiden kliniske forsøg.

IGFBP-3-ekspression markant nedreguleret i A431 gefitinib-resistente celler, som er udviklet under betingelser med kronisk EGFR inhibition [ ,,,0],18], og behandling af disse celler med AG1478, en EGFR-TKI, nedregulerer IGFBP-3 [26]. Disse resultater kan forklare tilpasning af celler dyrket under betingelser med EGFR inhibition, som aktiverer IGFIR, der fører til PI3K /AKT signalering. Re-eksponering af A431-GR-celler til IGFBP-3 resensitised både PI3K pathway og celleoverlevelse for virkningerne af gefitinib [18]. Imidlertid har en model af erhvervet resistens til gefitinib i EGFR mutant lunge kræftcellerne ikke blevet udviklet til dato, på trods af, at erhvervelsen af ​​EGFR-TKI-resistens i NSCLC patienter med EGFR-mutationer understreger sin kliniske relevans. Derfor, i den foreliggende undersøgelse har vi etableret to EGFR-TKI-resistente underlinjer (HCC827 /GR og HCC827 /ER) fra parentale HCC827 celler, som er følsomme over for EGFR-TKI’er grund af deletion mutation i exon 19, ved kontinuerlig udsættelse for gefitinib og erlotinib.

Begge cellelinjer viste nedregulering af IGFBP-3-ekspression ved Western blotting uden ændringer i transkriptionsaktivitet og uanset modstanden mekanismen. Desuden blev niveauet af udskilt IGFBP-3 i dyrkningsmediet af resistente celler signifikant reduceret som vist ved ELISA. Men der blev ikke konstateret ændringer i IGFR signalering trods tabet af IGFBP-3. Dette resultat modsiger, at en tidligere undersøgelse, der viser, at tabet af ekspressionen af ​​IGFBP’er i tumorceller behandlet med EGFR-TKI’er aktiverer IGFIR signalering [18]. Denne uoverensstemmelse kunne være forårsaget af samtidige ændringer i ligander såsom IGF-1 eller IGF-2, niveau af IGFBP-3, selv om dette begreb bør undersøges yderligere.

Lee et al. undersøgte virkningerne af IGFBP-3 på NSCLC-celler efter infektion med en adenovirus konstitutivt udtrykker IGFBP-3 under kontrol af cytomegaloviruspromotoren (Ad5CMV-BP3). IGFBP-3 overekspression inhiberede phosphorylering af Akt og glycogensynthasekinase-3β, og aktiviteten af ​​MAPK. Endvidere IGF-1 reddet NSCLC celler fra serum depletion-induceret apoptose, og dette redning blev blokeret i Ad5CMVBP-3-inficerede H1299 NSCLC-celler [21]. Men i den foreliggende undersøgelse, tvungen ekspression af IGFBP-3 ved infektion med en adenovirusvektor eller tilsætning af rekombinant IGFBP-3 kun lidt øgede vækst-inhiberende og apoptotiske virkninger af EGFR-TKI’er. En undersøgelse af Chang et al. viste, at faldet IGFBP-3-ekspression blev signifikant associeret med kortere sygdomsspecifik overlevelse i trin I NSCLC patienter og indikerede, at hypermethylering af IGFBP-3 promoter kan være forbundet med nedreguleringen af ​​IGFBP-3 [27], [28]. Betydningen af ​​IGFBP-3 i reguleringen af ​​NSCLC celleproliferation, clonogenicity, og tumorvækst blev vist i et in vitro-undersøgelse af den samme gruppe. Men i en nyere undersøgelse, IGFBP-3 ekspression blev ikke korreleret med kliniske variable og var ikke signifikant associeret med respons på kemoterapi og overlevelse [29], [30].

Samlet set en sammenhæng mellem EGFR -TKI behandling og ændringer i IGFBP-3 niveauer ikke er blevet understøttet af aktuelle data. I den foreliggende undersøgelse, serum IGFBP-3 niveauer målt før EGFR-TKI-behandling og efter udviklingen af ​​EGFR-TKI-resistens i 20 NSCLC patienter viste ingen signifikante ændringer (1815,3 ± 94,6 ng /ml inden behandling vs. 1778,9 ± 87,8 ng /ml efter EGFR-TKI resistens). IGFBP-3 er hovedsageligt produceret og udgivet af hepatisk Kupffer og endotelceller i det systemiske kredsløb til at påvirke auxological vækst via endokrine regulering [31]. Derfor kan andelen af ​​cirkulerende IGFBP-3 udskilles fra lunge- kræftceller være for lille til påvisning af væsentlige ændringer i forbindelse med udvikling af resistens, på trods af tabet af IGFBP-3 i lunge kræftceller.

Endelig vi gentog samme eksperimenter på PC-9-celler med en deletionsmutation på exon 19 af EGFR at validere vores observation. Vi har tidligere etablerede gefitinib-resistente celler (PC-9 /GR) fra PC-9 celler [32]. Selvom PC-9 /GR-celler erhvervet T790M-medieret resistens, nedsat ekspression af IGFBP-3 blev også fundet i dem (Supplerende figur S1). Følgelig har genindførelse af IGFBP-3 i PC-9 /GR celler eller lyddæmpning af IGFBP-3 i PC-9 celler ikke påvirke følsomheden over for EGFR-TKI’er.

Sammenfattende selvom IGFBP-3 nedregulering er forbundet med købet af EGFR-TKI-resistens uanset den underliggende mekanisme, dets beskeden effekt på modstand påvist i den foreliggende undersøgelse tyder på, at IGFBP-3 ikke spiller en stor rolle i modstanden af ​​NSCLC celler til EGFR-TKI-terapi. Desuden er vores resultater tyder på, at serum IGFBP-3 er ikke en nyttig markør af resistens i avanceret NSCLC.

Støtte Information

Figur S1.

IGFBP-3-ekspression påvirkede ikke følsomhed over for EGFR-TKI’er i PC-9 celler. Basisekspression og mRNA af IGFBP-3 i PC-9, PC-9 /GR og PC-9 /ER-celler blev vurderet ved Western blotting (A) og RT-PCR (B). (C) PC-9 /GR-celler blev inficeret med Ad /IGFBP-3 ved MOI på 0 til 100 PFU /celler i 24 timer og IGFBP-3-ekspression blev bestemt ved Western blotting. (D) PC-9 /GR-celler blev behandlet med den angivne koncentration af gefitinib og 1 ug /ml rh IGFBP-3 i 72 timer efter infektion med 100 MOI af Ad /IGFBP-3. Cellelevedygtighed blev målt ved anvendelse af en ADAM-MC automatisk celletæller. Resultaterne er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg, og fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelse (SD). (E) Kontrol og IGFBP-3 siRNA (100 nM) blev indført i PC-9-celler, og IGFBP-3 suppression blev bekræftet ved Western blotting. (F) Cell levedygtighed blev målt ved hjælp af MTT-analysen 72 timer senere

doi:. 10,1371 /journal.pone.0081393.s001

(TIF)