PLoS ONE: Ascl2 knockdown Resultater i tumorvækst Anholdelse af miRNA-302b-Related hæmning af tyktarmskræft progenitorceller

Abstrakt

Baggrund

Achaete Scute-lignende 2 (Ascl2), en grundlæggende helix-loop-helix (bHLH) transskription faktor, styrer skæbne af intestinale stamceller. Men den rolle Ascl2 i kolon kræft stamceller er fortsat ukendt. Cellelinjen HT-29 (47,5-95% af CD133

+ befolkning) og LS174T (0,45% af CD133

+ population) blev udvalgt til funktionel evaluering af Ascl2 i kolon kræft stamceller efter gen knockdown af RNA-interferens .

Metodologi /vigtigste resultater

Immunhistokemi viste, at Ascl2 blev øget betydeligt i kolorektale adenokarcinomer. Nedregulering af Ascl2 anvendelse af RNA interferens i dyrkede colon adenocarcinom HT-29 og LS174T-celler reducerede cellulær proliferation, kolonidannende evne, invasion og migration in vitro, og resulterede i vækststandsning af tumorxenotransplantater in vivo. Den Ascl2 proteinniveau i CD133

+ HT-29 celler var signifikant højere end i CD133

– HT-29 celler. Ascl2 blokade via shRNA indblanding i HT-29-celler (shRNA-Ascl2 /HT-29 celler) resulterede i 26,2% af cellerne farvende CD133

+ sammenlignet med 54,7% i kontrol shRNA-Ctr /HT-29-celler. Niveauerne af “stemness” tilhørende gener, såsom CD133, Sox2, Oct4, Lgr5, Bmi1, og C-myc, blev signifikant reduceret i shRNA-Ascl2 /HT-29 og shRNA-Ascl2 /LS174T celler in vitro såvel som i den tilsvarende tumor xenograft (CD133 blev ikke udført i shRNA-Ascl2 /LS174T celler). Den shRNA-Ascl2 /HT-29 celler havde inhiberede evner til at danne tumorspheres sammenlignet med kontrol. De microRNA (miRNA) microarrays, identificeret 26 opreguleret miRNA og 58 nedreguleret miRNA i shRNA-Ascl2 /HT-29 celler. Ekspressionsniveauer af Lad-7b, miRNA-124, miRNA-125b, miRNA-17, miRNA-20a og miRNA-302b, der er involveret i reguleringen af ​​’stemness «, blev kvantificeret med qPCR, som bekræftede deres identitet. Restaurering af miRNA-302b, via sin mimik, førte til genoprettelse af shRNA-Ascl2 /HT-29 ‘stemness’ karakteristika, herunder tumorsphere dannelse og ‘stemness’ associerede gener niveauer, og inddrivelse af cellulære adfærd, herunder kolonidannende evne , invasion og migration in vitro.

konklusioner /betydning

Ascl2 kan være et potentielt mål for hæmning af tyktarmskræft stamceller, og fungerer gennem et miR-302b-relaterede mekanisme.

Henvisning: Zhu R, Yang Y, Tian Y, Bai J, Zhang X, Li X, et al. (2012) Ascl2 knockdown Resultater i tumorvækst Anholdelse af miRNA-302b-Related hæmning af tyktarmskræft progenitorceller. PLoS ONE 7 (2): e32170. doi: 10,1371 /journal.pone.0032170

Redaktør: Ilya Ulasov, University of Chicago, USA

Modtaget: 19 oktober, 2011; Accepteret: 21 januar 2012; Publiceret: 23 feb 2012

Copyright: © 2012 Zhu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af staten Foundation for naturvidenskab i Folkerepublikken Kina 81000154 (til YY) og Natural Science Foundation projekt af CQ CSTC 2008BA5034 (til RW). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer (CRC), den tredje hyppigste årsag til død af kræft på verdensplan og en førende årsag til sygelighed og dødelighed i de udviklede lande [1], er en stor terapeutisk udfordring for kræft. For nylig er kræft stamceller (CSC) hypotese blevet foreslået for at forklare den funktionelle heterogenitet og carcinogenese af cancer. Ifølge denne model, en subpopulation af cancerceller, som udviser stamme-lignende funktioner, opretholde tumordannelse, metastase, og modstand mod behandling [2] – [5]. I denne forbindelse ville forventes CSCS at have en stamcelle-lignende /progenitor fænotype (generelt omtalt som “stemness”). Derudover har flere undersøgelser undersøgt proteinkodende gener og deres produkter, som deltager i stemness vedligeholdelse og tumorgenicitet af tyktarmskræft progenitorceller [6] – [8]. Således er det vigtigt at identificere de regulatoriske mekanismer og signalveje, der er involveret i tyktarmskræft stamceller til at udvikle nye reagenser til at målrette den ildfaste tyktarmskræft stamceller population [9].

Achaete Scute-lignende 2 (Ascl2) , et basisk helix-loop-helix (bHLH) transcription faktor, er en nedstrømsmål af Wnt signalering i intestinale stamceller. In situ hybridisering påvist Ascl2 ekspression i bunden af ​​små og store intestinale krypter, men mangel på ekspression i andre normale væv, bortset placenta [10]. De kombinerede resultater fra disse GAIN- og tab af funktion eksperimenter indebærer, at Ascl2 styrer skæbne tarm stamceller [11]. Flere grupper har vist, at Ascl2 er overudtrykt i kolorektal cancer [10], [12], [13]. Desuden Ascl2 overekspression har potentiale til at flytte hierarkiet af stamceller og stamceller inden levermetastaser resulterer i selvfornyelse stedet differentiering, potentielt kan påvirke den kliniske adfærd af disse tumorer [13]. Således kan Ascl2 være en regulatorisk faktor, der styrer skæbne tyktarmskræft progenitorceller. I det seneste årti er en række udviklingsmæssige veje, der regulerer CSCS blevet belyst [14] – [17]. Imidlertid rolle Ascl2 i tyktarmskræft progenitorceller forbliver ukendt.

Cellelinien HT-29 har et CD133

+ befolkning på 47,5-95% i litteraturen [18], [19] og isolerede CD133

+ -celler fra HT-29 coloncancer cellelinie udviste en højere tumorigent potentiale end CD133

– celler i in vivo tumordannelse assay [20]. Den CD133-proteinet blev først anerkendt som en overflademarkør for hæmatopoietiske stamceller [21], senere, blev det brugt til at genkende cancer stamceller i mange faste tumorer, der opstår i for eksempel bryst- [22], pancreas [23], lever [ ,,,0],24] og colon [18], [19]. Cellelinjen LS174T har en CD133

+ befolkning på 0,45% i litteraturen [20] og 0,1% i vores eksperiment (data ikke vist). Således blev HT-29 og LS174T celler valgt til funktionel evaluering af Ascl2 i kolon kræft stamceller efter gen knockdown af RNA-interferens.

MikroRNA’er (miRNA) er afgørende som post-transkriptionelle regulatorer af genekspression og deltage i flere biologiske funktioner, herunder celleproliferation, differentiering og apoptose [25]. miRNA også bidrage til at bevare stemness af embryonale stamceller og humane CSCS [26] – [28]. Undersøgelse af funktionen af ​​Ascl2 på tyktarmskræft stamceller og miRNA udtryk profiler er afgørende for at belyse de særlige kendetegn ved tyktarmskræft stamceller, hvilket vil gavne udviklingen af ​​nye lægemidler eller nye terapeutiske metoder, der er målrettet tyktarmskræft stamceller. Desuden vil det give ny indsigt i metoder til at udrydde tyktarmskræft på grund af sandsynligheden for, at udryddelsen af ​​tyktarmskræft stamceller vil være et afgørende skridt til at opnå en kur mod tyktarmskræft.

I denne rapport, viser vi den selektive blokade af Ascl2 i HT-29 og LS174T-celler kunne inhibere cellevækst, invasion og migration in vitro, og føre til vækststandsning in vivo, der er delvist relateret til miRNA-302b-relateret inhibering af ‘stemness’ for tyktarmskræft progenitor celler baseret på eksperimenter af shRNA-Ascl2 /HT-29 transficeret med miRNA-302b efterligne. Disse resultater indikerer, at Ascl2 kunne være et potentielt mål i tyktarmskræft stamceller til udvikling af nye behandlingsformer til udryddelse af tyktarmskræft.

Materialer og metoder

Cell kultur

Humane colon adenocarcinom cellelinier HT-29 og LS174T blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC) og blev opretholdt i McCoys 5A-medium (Sigma, USA) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS; HyClone, USA) ved 37 ° C og 5% CO

2, med mediet udskiftet hver anden dag. Celler blev passeret ved 80% sammenløb og podet ved 30% sammenløb for vedligeholdelse af optimale prolifererende betingelser.

RNA-interferens

sekvens, CCGCGTGAAGCTGGTGAAC, rettet Ascl2 (shRNA-Ascl2 /EGFP) [11 ] blev dannet af duplex-DNA, der består af 5′-CACCGCCGCGTGAAGCTGGTGAACTTCAAGACGGTTCACCAGCTTCACGCGGTTTTTTG-3 ‘, 5′-AGCTCAAAAAACCGCGTGAAGCTGGTGAACCGTCTTGAAGTTCACCAGCTTCACGCGGC-3’.

A pGenesil-1.1 blev anvendt uden indsats til kontrol (shRNA-Ctr /EGFP). De annealede DNA-duplekser blev klonet i plasmidet af pGenesil-1.1 fordøjet med Eco31I restriktionsenzym. HT-29 og LS174T-celler blev transficeret med shRNA-Ascl2 /EGFP eller shRNA-Ctr /EGFP-vektor, og derefter vælges med 0,8 mg /ml G418 for HT-29 transficerede celler og 0,4 mg /ml G418 for LS174T transficerede celler, der begynder 48 timer efter transfektion. To uger senere blev celler holdt i 0,4 mg /ml G418 for HT-29 transficerede celler og 0,2 mg /ml G418 for LS174T transficerede celler indtil tre uafhængige stabile transficerede kloner blev etableret. RNA-interferens var stabil i hele spændvidden af ​​eksperimenter under selektionstryk på 0,4 mg /ml G418 for HT-29 transficerede celler og 0,2 mg /ml G418 for LS174T transficerede celler i dyrkningsmediet.

Proliferation Assay

Celleproliferation blev undersøgt på dag 1, 2, 3 og 4. Isolerede celler blev podet ved 1 x 10

4 celler /brønd i plader med 96 brønde (Corning, USA) i et endeligt volumen på 100 pi dyrkningsmedium per brønd. Ved hvert tidspunkt, blev 5 mg /ml MTT (Sigma, USA) tilsat til dyrkningsmediet (20 pl /brønd) og inkuberet i yderligere 4 timer ved 37 ° C i 5% CO

2 atmosfære for at tillade MTT til omdannes til formazankrystaller. Derefter blev de formazankrystaller solubiliseret med 150 pi DMSO (Sigma, USA) i 10 min. Absorbansen blev målt ved en bølgelængde på 490 nm med en mikropladelæser (Thermo, USA). Alle assays blev gentaget tre gange.

kolonidannelse Assay

Celler blev udpladet ved en densitet på 1000 celler pr plade (35 mm, Corning, USA) og derefter inkuberet ved 37 ° C under 5 % CO

2. Mediet blev skiftet hver 3-4 dage. På dagene 20, blev cellerne farvet med Giemsa og observeret under et omvendt mikroskop. Antallet af kolonier i hver plade blev talt. Eksperimentet blev gentaget tre gange og udtrykt som det gennemsnitlige antal kolonier per plade.

In Vitro Invasion Assay

In vitro invasion evne af cellerne blev målt ved anvendelse Transwell kamre overtrukket med Matrigel (Corning, USA) assay. Celler blev podet i 100 pi ved en densitet på 1 x 10

6 celler /ml med 1% FBS i det øverste kammer, og det nedre kammer blev fyldt med 600 pi kulturmedium med 20% FBS som en kemoattraktant. Transbrøndene blev derefter inkuberet ved 37 ° C under 5% CO

2 i 48 timer for at tillade cellerne at invadere. Ved slutningen af ​​inkubationen blev cellerne på den øvre side af Matrigel-coated filter fjernes ved aftørring med en vatpind. Celler, som havde invaderet gennem Matrigelcoatede filter blev farvet med krystalviolet-opløsning. De invasive celler, der migrerede gennem Matrigelcoatede filter til den nedre overflade blev talt under et inverteret lysmikroskop (Olympus, Japan), ved 200 ganges forstørrelse. Celler i fem randomiserede synsfelter ved 200 × blev talt og udtrykt som det gennemsnitlige antal celler pr synsfelt. Eksperimentet blev gentaget tre gange.

Migration

HT-29, LS174T-celler og deres transfektanter, ved 90-100% konfluens i 6-brønds plader, blev dyrket natten over i serumfrit medium . Mediet blev erstattet med PBS, og monolagene blev såret mekanisk med en steriliseret, enægget barberblad. Efter såring blev celler skyllet to gange med steriliseret PBS og inkuberet i McCoys 5A medium indeholdende 10% FBS i 48 timer ved 37 ° C under 5% CO

2. Celler, der var migreret fra den sårede kant blev talt ved 200 ganges forstørrelse under anvendelse af et inverteret lysmikroskop (Olympus, Japan). Celler i 5 tilfældige synsfelter på 200 × og udtrykt som det gennemsnitlige antal celler pr synsfelt. Eksperimentet blev gentaget tre gange.

Tumorsphere-formation assays

I tumorsphere dannelse, encellede suspensioner blev suspenderet i en Dulbeccos modificerede Eagles Medium /F12 (DMEM /F12, Hyclone, USA) suppleret med B-27 (1 ×, Gibco), 20 ng /mL epidermal vækstfaktor (EGF, Peprotech, USA), og 20 ng /ml basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF, Peprotech, USA), og derefter udpladet i 24- såvel ultralav fastgørelsesplader (Corning, USA) i en koncentration på 1000 celler pr. Pladerne blev analyseret 7-10 dage senere til tumorsphere dannelse og blev kvantificeret under anvendelse af et omvendt mikroskop (Olympus) ved 100 × og 400 × forstørrelser. Til efterfølgende kvantificering af celleantal pr tumorsphere blev tumorspheres opsamlet med en 40 um sigte (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) og adskilles med 0,25% trypsin /0,02% EDTA for at gøre en enkelt cellesuspension. De levedygtige celler blev derefter talt under anvendelse trypanblåteksklusion.

In vivo tumorgenicitet

shRNA-Ctr /HT-29, shRNA-Ascl2 /HT-29, shRNA-Ctr /LS174T og shRNA -Ascl2 /LS174T-celler blev resuspenderet i 100 pi (1 × 10

6 celler) 0,9% fysiologisk saltopløsning før injektion. Seks uger gamle BALB /c nøgne hanmus blev købt fra Animal Facility af Research Center i Third Military Medical University og vedligeholdes under standardbetingelser. Alle forsøg blev udført med godkendelse af Animal Studies etiske komité i den tredje Military Medical University (tilladelse nummer: sw 20.090.713). Mus blev subkutant podet med 1 × 10

6 isolerede celler på begge flanker (venstre med shRNA-Ascl2 /HT-29 eller shRNA-Ascl2 /LS174T celler og retten med shRNA-Ctr /HT-29 eller shRNA-Ctr /LS174T-celler, henholdsvis). Tumorstørrelserne blev målt ved anvendelse skydelære. Tumor størrelser blev beregnet ved hjælp af formlen: (længde × bredde

2) /2. Musene blev aflivet ved cervikal dislokation på dag 20 efter inokulering. Transplantaterne blev fjernet, dokumenteret ved fotografering og de tumorvægte måles. Tumorer blev inddelt i to grupper, og enten fikseret med 10% bufret formalin eller konserveret i -80 ° C.

Flowcytometri cellesortering og flowcytometrianalyse

Til isolering af CD133

+ og CD133

– populationer i HT-29-celler, blev enkelt-cellesuspensioner inkuberet med phycoerythrin (PE) -konjugeret anti-humant CD133-antistof (AC133 klon, Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA) og FcR blokerende reagens ( Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA) i farvning opløsning indeholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA i 10 minutter ved 4 ° C. Isotype-matchet muse immunoglobulin G1 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA) tjente som en negativ kontrol. Celler blev analyseret og sorteret med en fluorescens-aktiveret cellesorterer (FACS) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). For den positive og negative population, top 10,8% lyst farvede celler eller de nederste 7,6% svagt farvede celler blev selekteret henholdsvis.

Immunhistokemi

Immunohistokemiske studier af Ascl2 blev udført på human colon mucosa (n = 11), coloncarcinom (n = 11) og tumorxenoplantater fra nøgne mus (n = 6), de humane colon mucosa og cancer væv var fra de samme patienter og alle patienter billede informeret samtykke. Paraffin blev fjernet fra formalin-fikseret, paraffinindstøbt væv; Prøverne blev derefter blokeret og inkuberet med specifikke antistoffer natten over ved 4 ° C. Antistoffet blev detekteret ved SP9002 Histostain ™ -plus Kits (Zymed Co., USA). Alle snit blev modfarvet med hematoxylin. Primære muse Ascl2 monoklonalt antistof (tabel S1) blev anvendt i en fortynding på 1:100. Alle forsøg blev udført med godkendelse af Studies etiske komité for Southwest Hospital, Third Military Medical University (tilladelse nummer: sw 20.090.713).

Immunfluorescensfarvning

HT-29 og LS174T celler, dyrket på steriliserede dækglas, blev farvet med Ascl2 primært antistof (tabel S1), efterfulgt af inkubation med gede-anti-muse-IgG-R (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Californien USA), modfarvning med DAPI, og endelig visualiseret under laserscanning konfokalt fluorescensmikroskop (Carl Zeiss, Inc. Tyskland).

Real-time PCR-analyse

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, USA) ifølge producentens anvisninger. Første streng cDNA blev syntetiseret under anvendelse primeScript ™ RT enzymblanding I, oligo dT-primere og tilfældige hexamerer (Takara, Japan). For at bestemme fold ændringer i hvert gen, blev realtids-PCR udført under anvendelse af første streng cDNA, forward og reverse primere, og SYBR premix Ex Taq ™ Green II (Takara, Japan). Primersekvenserne er opsummeret i tabel S2. Reaktion og signal detektion blev målt ved real-time PCR-system (BioRad, USA). Ekspressionsniveauer blev beregnet som relative ekspression forholdet sammenlignet med β-actin. De realtid PCR’er blev udført tre gange uafhængigt af hinanden.

Western blot assay

Cellelysater eller homogeniserede væv fra tumorxenotransplantater opløst i SDS-prøvebuffer blev separeret ved SDS-PAGE og overført til nitrocellulose membran. Den β-actin blev anvendt som kontrol. Membranen blev probet med specifikt primært antistof natten over ved 4 ° C (de primære antistoffer er opsummeret i tabel S1), efterfulgt af inkubering med HRP-konjugeret sekundært IgG (H + L) antistof (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Californien USA) . Blottene blev forarbejdet med Immobilon ™ western kemiluminescerende HRP substrat (Milipore, USA) og analyseret ved gel imaging analysesystem (BioRad, USA).

miRNA microarray analyse og miRNA kvantificering under anvendelse kvantitativ PCR

Den 6. generation af humane miRNA microarrays (Exiqon, Danmark) blev anvendt til at sammenligne de miRNA udtryk profiler mellem shRNA-Ctr /HT-29 og shRNA-Ascl2 /HT-29 celler. Den microarray indeholder mere end 1891 indfangningsprober, der dækker alle menneskelige, mus og rotte miRNA kommenteret i miRBase 16.0. Totalt RNA blev ekstraheret fra 1 × 10

7 stabil transficeret shRNA-Ctr /HT-29 og shRNA-Ascl2 /HT-29 celler under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, USA). RNA isolering, kvalitetskontrol, mærkning, og hybridisering blev udført ved Shanghai KANCHENG Biochip Company ifølge protokollerne i miRNA microarray-system. Arrays blev scannet ved hjælp af en Microarray Scanner, og de scannede billeder blev derefter importeret til GenePix Pro 6.0 software (Axon) for gitter justering og dataudtræk. Replikerede miRNA blev gennemsnit og miRNA med intensiteter 50 i alle prøver blev udvalgt til at beregne normalisering faktor. Udtrykte data blev normaliseret ved anvendelse af Median normalisering. Efter normalisering blev differentielt udtrykte miRNA identificeret gennem Fold Skift filtrering. Hierarkisk klyngedannelse blev udført under anvendelse MEV software (v4.6, TIGR).

I miRNA qPCR validering, er primersekvenserne for miRNA opsummeret i tabel S3. RNA isolering, kvalitetskontrol, cDNA syntetisere og qPCR blev udført ved Shanghai KANCHENG Biochip Company ifølge protokollerne. En t-test blev anvendt til at identificere differentielt udtrykte miRNA mellem shRNA-Ctr /HT-29 og shRNA-Ascl2 /HT-29 sammenligninger.

Transfektion af miRNA efterligner eller miRNA-inhibitorer i shRNA-Ascl2 /HT-29 celler

shRNA-Ascl2 /HT-29-celler blev transficeret 24 timer efter at være udsået i 6-brønds plader. De miRNA efterligner (100 pmol) eller miRNA-hæmmere (200 pmol) (Guangzhou Ribobio Co Ltd Guangzhou, PR Kina) i 250 ul serum-fri, antibiotika-fri medium blev blandet med 5 ul Lipofectamine 2000 transfektion reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) opløst i 245 pi af det samme medium og fik lov at henstå ved stuetemperatur i 20 minutter. De resulterende 500 pi transfektions- opløsninger blev derefter tilsat til hver brønd indeholdende 1,5 ml medium. Seks timer senere blev hver brønd udskiftet med 2 ml frisk medium suppleret med 10% FBS. De forbigående transficerede celler blev opsamlet efter yderligere 48 timers inkubation til yderligere eksperimenter, herunder tumorsphere dannelse, real-time PCR, Western blot-analyse, kolonidannelse assayet invasion assay og migration analyse. Den forbigående transficerede shRNA-Ascl2 /HT-29 celler under anvendelse af miRNA efterligner negativ kontrol (100 pmol) eller miRNA inhibitorer negativ kontrol (200 pmol) blev anvendt som en kontrol.

Statistical Analysis

I kontinuerlige variabler blev data udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse. Forskelle mellem grupper blev estimeret ved t-test og gentagne-målinger ANOVA-analyse. Alle forskelle blev anset signifikant på niveauet p 0,05, meget signifikant på niveauet p 0,01. Statistiske analyser blev udført af SPSS 13.0 til Windows softwarepakke.

Resultater

Ascl2 er overudtrykt i tyktarmskræft og tyktarmskræft cellelinjer, og Ascl2 indblanding i HT-29 og LS174T celler bemærkelsesværdigt reduceret dets ekspression

Immunhistokemisk farvning blev anvendt til at bestemme, om Ascl2 protein blev udtrykt i human colon mucosa og tyktarmskræft. En stigning i Ascl2 proteinekspression i kernen af ​​colon cancerceller af humane coloncancere (figur 1B) blev observeret i forhold til den specifikke farvning af Ascl2 protein ved kernen af ​​krypt uædle celler med normal colon mucosa (figur 1A). Cellerne med Ascl2 positiv farvning i kernen blev separeret ved negativ farvning celle nøjagtigt i den normale krypt base (figur 1A). Den immunfluorescensfarvning viste, at Ascl2 hovedsagelig blev udtrykt i kernen af ​​HT-29 celler, og svagt udtrykt i cytoplasmaet, hvorimod, Ascl2 blev udtrykt hovedsagelig i cytoplasmaet i LS174T-celler, og svagt udtrykt i kernen. Dens ekspressionsmønster Ascl2 i HT-29 og LS174T-celler var afvigende, med de fleste af HT-29 og LS174T-celler er relativt svag til ekspression (figur 1C). Western blot-analyse viste, at Ascl2 var til stede i både tyktarmskræft cellelinjer HT-29 og LS174T-celler (20 kDa i begge), men fraværende i MHCC-97L, en levercancer cellelinje (Figur 1D).

Ascl2 ekspression er specifikt lokaliseret i kernen af ​​krypt uædle celler med normal human colon mucosa (pilespids) (A), B viser, at Ascl2 specifikt udtrykkes ved kernen af ​​humane coloncancer-celler i humane coloncancer væv (oprindelig forstørrelse af toppanelet af A og B: × 200; oprindelig forstørrelse af lav panel af A og B: × 400). Den immunfluorescensfarvning indikerer Ascl2 beliggende hovedsagelig i kernen af ​​HT-29-celler og cytoplasma i LS174T-celler (C) (Original forstørrelse: x 200). Western blot analyse viser Ascl2 er til stede i HT-29 og LS174T-celler, men fraværende i MHCC-97L-celler (D). Ascl2 indblanding i HT-29 og LS174T celler resulterer i signifikant reduktion af både Ascl2 mRNA analyseret ved real-time PCR og proteinniveauer analyseret ved Western blot-analyse i forhold til kontrol (β-actin) (**: p 0,01) (E og F).

For at banke ned Ascl2 udtryk i HT-29 og LS174T celler blev celler transficeret med shRNA-Ascl2 /EGFP og shRNA-Ctr /EGFP vektorer, fire stabile-transficerede cellelinjer ( shRNA-Ascl2 /HT-29, shRNA-Ascl2 /LS174T, shRNA-Ctr /HT-29 og shRNA-Ctr /LS174T celler) blev etableret. Ascl2 mRNA kvantificeres med real-time PCR blev reduceret i shRNA-Ascl2 /HT-29 og shRNA-Ascl2 /LS174T celler sammenlignet med deres kontroller (Figur 1E). En tilsvarende reduktion i Ascl2 protein blev observeret i shRNA-Ascl2 /HT-29 og shRNA-Ascl2 /LS174T celler sammenlignet med deres kontroller (figur 1F). Der var ingen signifikant forskel mellem shRNA-Ctr /HT-29 og utransficerede HT-29 celler, og mellem shRNA-Ctr /LS174T og utransficerede LS174T celler, i både Ascl2 mRNA og proteinekspression (fig 1E og 1F).

Silence of Ascl2 i HT-29 og LS174T celler førte til ændringer i cellulære adfærd

Colony dannelse assay: shRNA-Ascl2 /HT-29 og shRNA-Ascl2 /LS174T celler udviklede færre kolonier efter 20 dage sammenlignet med deres kontrol (p 0,05) (Figur 2A). Proliferationsassay: De proliferationshastigheder af shRNA-Ascl2 /HT-29, shRNA-Ascl2 /LS174T og deres kontroller blev undersøgt under anvendelse af en MTT-metoden, ifølge fabrikantens protokol, fra dag 1 til 4 efter podning. Som vist i figur 2B, var der betydelige forskelle i vækstraterne mellem shRNA-Ascl2 /HT-29 og HT-29 celler, og mellem shRNA-Ascl2 /HT-29 og shRNA-Ctr /HT-29 celler på dag 3 og 4, også mellem shRNA-Ascl2 /LS174T og LS174T-celler, og mellem shRNA-Ascl2 /LS174T og shRNA-Ctr /LS174T-celler på dag 3 og 4 (p 0,05). In vitro invasion assay: Invasion assays blev udført under anvendelse Matrigelcoatede Transwell kultur kamre. Efter 48 timers inkubering blev antallet af indtrængende celler tælles. Med shRNA-Ascl2 /HT-29 celler, 7 ± 3 celler pr felt (under 200 × forstørrelse ved hjælp af omvendt mikroskop) invaderet gennem membranen. Dette antal var signifikant lavere end den for ikke-transficerede HT-29-celler (37 ± 5) eller shRNA-Ctr /HT-29-celler (31 ± 6) (p 0,01). Ligeledes med shRNA-Ascl2 /LS174T celler, 84 ± 14 celler pr (under 200 × forstørrelse med anvendelse af omvendt mikroskop) invaderede gennem membranen. Dette antal var signifikant lavere end den for ikke-transficerede LS174T-celler (292 ± 32) eller shRNA-Ctr /LS174T-celler (296 ± 30) (p 0,01) (Figur 2C). Migration: Endelig 75 ± 10 shRNA-Ascl2 /HT-29 celler pr felt (under 200 × forstørrelse) flyttes på tværs af skrabet kant efter 48 timer. Dette antal var signifikant lavere end den for ikke-transficerede HT-29-celler (185 ± 15) eller shRNA-Ctr /HT-29-celler (195 ± 25) (p 0,05). 82 ± 9 shRNA-Ascl2 /LS174T celler pr felt (under 200 × forstørrelse) flyttes på tværs af skrabet kant efter 48 timer. Dette antal var signifikant lavere end for utransficerede LS174T celler (177 ± 21) eller shRNA-Ctr /LS174T celler (173 ± 25) (p 0,05). (Figur 2D)

shRNA-Ascl2 /HT 29 og shRNA-Ascl2 /LS174T celler har færre kolonier (*: p 0,05) (A), lavere vækstrater (*: p 0,05) (B), mindre invaderede celler gennem Matrigel-coatede membran (**: p 0,01) (C) og færre celler migrerer over skrabet kant (*: p. 0,05) (D), sammenlignet med deres kontroller (Original forstørrelse: x 200)

Ascl2 indblanding førte til in vivo-vækst anholdelse af tumorer

for at sammenligne vækstrater shRNA-Ctr /HT-29 og shRNA-Ascl2 /HT-29 celler, shRNA-Ctr /LS174T og shRNA-Ascl2 /LS174T celler, i athymiske nøgne mus, den shRNA-Ascl2 /HT-29 eller shRNA-Ascl2 /LS174T-celler blev injiceret i venstre flanke mens shRNA-Ctr /HT-29 eller shRNA-Ctr /LS174T-celler blev injiceret i den højre flanke henholdsvis. Tyve dage efter podning med hver parrede celler (shRNA-Ascl2 /HT-29 og shRNA-Ctr /HT-29 celler i figur 3A, eller shRNA-Ascl2 /LS174T og shRNA-Ctr /LS174T celler (resultater ikke vist)) i hver mus, henholdsvis alle mus (12/12, henholdsvis) udviklede tumorer. Tumorvolumener blev målt ved anvendelse skydelære på forskellige tidspunkter før døden, mens bestemtes vægte efter døden. Volumen og masse i shRNA-Ascl2 /HT-29 eller shRNA-Ascl2 /LS174T tumorer var signifikant lavere end de shRNA-Ctr /HT-29 eller shRNA-Ctr /LS174T tumorer (p 0,05) (Figur 3B og 3C). Desuden Ascl2 udtryk i tumorvæv fra shRNA-Ascl2 /HT-29 eller shRNA-Ascl2 /LS174T celler var signifikant lavere end for shRNA-Ctr /HT-29 eller shRNA-Ctr /LS174T celler, som bestemt ved real-time PCR og western blot-analyse (figur 3D og 3E). Ascl2 udtryk i tumorvæv fra shRNA-Ascl2 /HT-29 eller shRNA-Ascl2 /LS174T celler var signifikant lavere end fra shRNA-Ctr /HT-29 eller shRNA-Ctr /LS174T celler, som det fremgår af immunhistokemisk farvning (figur 3F) .

Alle mus (6/6 henholdsvis) udvikle tumorer 20 dage senere efter 1 × 10

6 shRNA-Ctr /HT-29-celler (højre side og mærket som pil) og shRNA-Ascl2 /HT-29-celler (venstre side og markeret som pilespids) inokuleres i nøgne mus (A), blev LS174T celler ikke er vist. Tumoren volumen (B) og masse vægt (C) i gruppen af ​​shRNA-Ascl2 /HT-29 og shRNA-Ascl2 /LS174T celler er betydeligt lavere end gruppen af ​​shRNA-Ctr /HT-29 og shRNA-Ctr /LS174T celler (*: p 0,05). MRNA’et (D) og protein (E) niveauer af Ascl2 i tumorvæv udvikles fra shRNA-Ascl2 /HT-29 og shRNA-Ascl2 /LS174T celler er lavere end i tumorvæv udviklet fra shRNA-Ctr /HT-29 og shRNA-Ctr /LS174T celler (**: p 0,01). Ascl2 immunfarvning i kernen af ​​kræftceller i tumorxenoplantater fra shRNA-Ctr /HT-29 og shRNA-Ctr /LS174T celler er stærkere end i kernen af ​​kræftceller i tumorxenoplantater fra shRNA-Ascl2 /HT-29 og shRNA -Ascl2 /LS174T celler (F)

Ascl2 udtryk i CD133

+ og CD133

-. HT-29 celler

flowcytometri analyse viste CD133 blev udtrykt i 58,1% af HT-29-celler, med 0,1% HT-29-celler blev påvist i den negative kontrol. 98,6% af cellerne blev bekræftet at være CD133 positive i toppen 10,8% af CD133 positive HT-29 celler ved postsorting selektion blev 98,1% af cellerne bekræftet at være CD133 negativ i svagt 7,6% af CD133 negative HT-29-celler (figur 4A).

CD133 udtrykkes i 58,1% af HT-29-celler. 98,6% af cellerne bekræftes at være CD133 positive med post-sortering udvalg i top 10,8% af CD133

+ HT-29 celler, 98,1% af celler bekræftet at være CD133 negativ med post-sortering valg i svagt 7,6 % af CD133

– HT-29-celler (A). Ascl2 proteinniveauet i forhold til kontrol (β-actin) i CD133

+ HT-29-celler er væsentlig højere end den, CD133

– HT-29-celler (*: p 0,05) (B). Der er et indlysende nukleare farvning af Ascl2 i CD133

+ HT-29 celler, men Ascl2 er næsten negativ i CD133

– HT-29-celler (C) (Original forstørrelse: × 200).

CD133

+ og CD133

– HT-29-celler blev analyseret for ekspression af Ascl2 anvendelse af Western blot-assays. Den Ascl2 proteinniveau i forhold til kontrol (β-actin) i CD133

+ HT-29-celler var signifikant højere end den, CD133

– HT-29-celler (p 0,05) (figur 4B). The CD133

+ og CD133

– HT-29-celler blev immunfarvet med anti-Ascl2 antistof, hvilket viser en nuklear farvning mønster af Ascl2 i CD133

+ HT-29-celler (toppanel figur 4C), og en ubetydelig farvning for Ascl2 i CD133

– HT-29 celler (den lave panel af figur 4C)

Procentdelen af ​​CD133

+ HT-29 celler og “stemness ‘markører var bemærkelsesværdigt. reduceret efter Ascl2 knockdown

den iagttagelse, at Ascl2 udtryk var højere i CD133

+ HT-29 celler end i CD133

– HT-29 celler, førte til den hypotese, at Ascl2 protein er vigtigt for ekspressionen af ​​CD133 i CD133

+ spindel /progenitor HT-29-celler.