PLoS ONE: hnRNP A1 /A2 og SF2 /ASF Regulere Alternativ splejsning af Interferon Regulatory Factor-3 og påvirke Immunmodulerende funktioner i human ikke-småcellet lungekræft Cells

Abstrakt

Heterogen nuklear ribonucleoparticule A1 /A2 ( hnRNP A1 /A2) og splejsning faktor 2 /alternativ splejsning faktor (SF2 /ASF) er afgørende for precursor messenger RNA (præ-mRNA) splejsning. Interferon regulatorisk faktor-3 (IRF-3) spiller kritiske roller i værtsforsvar mod viral og mikrobiel infektion. Trunkerede IRF-3 proteiner fra alternativ splejsning, er blevet identificeret og karakteriseret som funktionelle antagonister for fuld-længde IRF-3. I denne undersøgelse undersøgte vi molekylær mekanisme for splejsning regulering af IRF-3 præ-mRNA og først rapporteret den regulerende virkning af hnRNP A1 /A2 og SF2 /ASF på IRF-3 splejsning og aktivering. RNA-interferens-medieret nedbrydning af hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF i human ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) -celler øget udelukkelse af exon 2 og 3 i IRF-3-gen og reducerede ekspressionsniveauer af IRF-3-protein og IRF- 3 nedstrøms effektormolekyler interferon-beta og CXCL10 /IP-10. Desuden direkte binding af hnRNP A1 og SF2 /ASF særlige bindende motiver i IRF-3 intron 1 blev bekræftet ved RNA elektroforetisk mobility shift-assay. Efterfølgende minigen splejsning assay viste, at IRF-3 minigener med muteret hnRNPA 1 /A2 eller SF2 /ASF bindende motiver øget udelukkelse af exon 2 og 3. Desuden knockdown af hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF i NSCLC celler forstærket fytohæmagglutinin-induceret tumor nekrose faktor-alfa-frigivelse af mononukleære blodceller (PBMC) fra perifert men undertrykt at af interleukin-10 i NSCLC /PBMC co-kulturer. Tilsammen vores resultater antyder, at specifik knockdown for hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF stigning udelukkelse af exon 2 og 3 i IRF-3 præ-mRNA og påvirke immunmodulatoriske funktioner af humane NSCLC-celler

Henvisning:. Guo R, Li Y, Ning J, Sun D, ​​Lin L, Liu X (2013) hnRNP A1 /A2 og SF2 /ASF regulere Alternativ splejsning af Interferon Regulatory Factor-3 og Affect Immunmodulerende funktioner i human ikke-småcellet lungekræft Cells. PLoS ONE 8 (4): e62729. doi: 10,1371 /journal.pone.0062729

Redaktør: Luwen Zhang, University of Nebraska – Lincoln, USA

Modtaget: December 6, 2012; Accepteret: 25 marts 2013; Udgivet: 29 april, 2013 |

Copyright: © 2013 Guo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant nr 30.572.072) til XL og af Beijing Municipal Natural Science Foundation (Grant nr 5.092.009) og National Natural Science Foundation of China (Grant nr 30.871.366) til YL. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Dr. Jinying Ning, som den tredje forfatter af dette manuskript, var en ansat i selskabet Crown Bioscience Inc (Beijing). Han bidrog nogle analyseværktøjer og forudsat rådgivning til dette arbejde. Ingen patenter vil blive delt af Crown Bioscience Inc (Beijing). Ingen produkter i udvikling og ingen markedsførte produkter af Crown Bioscience Inc (Beijing) blev anvendt i denne forskning arbejde. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Alternativ forløber messenger-RNA (præ-mRNA) splejsning er en vigtig posttranskriptionel mekanisme, hvormed celler kan generere et forskelligartet repertoire af proteinisoformer fra et mere begrænset antal gener [1]. Det skønnes, at størstedelen af ​​humane multi-exon gener alternativt splejses [2]. Alternativ splejsning spiller vigtige roller i udvikling, fysiologi og sygdoms- og processen med at fjerne introner selektivt og sammenføjning af resterende exons er underlagt præcis regulering og er ofte forstyrret i inflammatoriske lidelser og cancer [3] – [6]. Talrige undersøgelser har vist, at nogle RNA-bindende proteiner kan deltage i reguleringen af ​​inflammatoriske proces og tumorigenese ved at regulere splejsning eller mRNA stabilitet inflammation- og tumorrelaterede gener [4], [6] – [8]. To RNA-bindende protein familier nukleare, familien af ​​heterogene nukleare ribonucleoproteiner (hnRNP) og familien af ​​serin /arginin-rige proteiner (SR), spiller afgørende roller i reguleringen af ​​alternativ splejsning og mRNA stabilitet. Den hnRNP familien indeholder mindst tyve medlemmer og hovedsagelig binder til sekvenser kaldet splejsning lyddæmpere, som ligger i exoner (ESSs, exoniske splejsning lyddaempere) eller introns (ISSS, intron splejsning lyddæmpere), at fremme exon udelukkelse og fungere som splejsning repressorer [9]. De hyppigst forekommende og bedst karakteriserede proteiner af denne gruppe er hnRNP A1 og hnRNP A2, der deler en høj grad af sekvenshomologi og funktionel homologi [10]. Stigende beviser har vist, at hnRNP A1 og hnRNP A2 er overudtrykt i forskellige former for tumorer og tjene som tidlige tumor biomarkører [7], [11] – [13]. HnRNP U, som en anden hnRNP familiemedlem, er blevet rapporteret at forbedre TLR-induceret proinflammatoriske cytokin produktion ved at stabilisere mRNA’er i makrofager [14]. Familien af ​​SR proteiner, en anden regulator til alternativ splejsning, også mere end tyve medlemmer. Disse proteiner binder til splejsning enhancere, som lokalisere i exoner (Eses, exoniske splejsning enhancere) eller introner (ISES, intron splejsning enhancere), og overvejende fungerer som antagonister af hnRNP-proteiner [15]. Men en række undersøgelser har også afsløret, at SR proteiner regulerer exon springe begivenheder og forskellige SR proteiner viser modsatrettede aktiviteter i fremme exon inklusion eller springe på de samme gener [16], [17]. Splejsning faktor 2 /alternativ splejsning faktor (SF2 /ASF), som den bedst karakteriserede medlem af SR familien, er blevet rapporteret at være opreguleret i multiple humane cancere, herunder lungekræft og livmoderhalskræft, og spiller en vigtig rolle i etableringen og vedligeholdelse af celletransformation [8], [18] – [20]. Nyere forskning afslørede også, at SF2 /ASF medieret IL-17-induceret mRNA stabilitet chemokin CXCL1 i humane livmoderhalskræft celler [21].

stadigt voksende interferon regulatorisk faktor (IRF) familie omfatter transkriptionelle aktivatorer og repressorer som regulere genekspression kritisk for immunrespons, hæmatopoiese, og celleoverlevelse [22] – [24]. IRF-3 er unik blandt IRF familiemedlemmer ved, at den er et centralt direkte transducer af viral dobbeltstrenget RNA og bakterielt lipopolysaccharid-medieret signalering [25], [26]. IRF-3 tjener som et vigtigt transkriptionel aktivator for type I-interferoner (IFNa /p), en delmængde af interferon-stimulerede gener samt nogle chemokin gener, såsom RANTES og CXCL10 /IP-10 og spiller kritiske roller både i det medfødte immunforsvar respons mod viral infektion og efterfølgende aktivering af adaptiv immunitet [27] – [31]. IRF-3-genet består af 8 exoner og 7 introner og koder for et 427-aminosyre-protein. IRF-3 er en phosphoprotein og består af en N-terminal DNA-bindende domæne (DBD) (aminosyrer 1 til 110), en C-terminal IRF-associeret domæne (WAS, aminosyrer 198 til 374), og et transaktiveringsdomæne (TAD, aminosyrer 134 til 394) [32]. Med sine kritiske roller i host forsvar, er aktiviteten af ​​IRF-3 strengt kontrolleret. IRF-3 udtrykkes bredt og findes overvejende i en inaktiv cytoplasmatisk formular. Efter infektion virus eller dobbeltstrenget RNA inducerer phosphorylering af C-terminale serin /threoninrester og fører til en konformationel ændring i IRF-3 med eksponering af både DBD og IAD domæner, hvilket yderligere resulterer i homo- eller heterodimerisering, cytoplasm- til-kerne translokation, association med CBP /p300 coactivatorer, og transkriptionel aktivering af flere målgener [33], [34].

Strukturel integritet er afgørende for IRF-3 for at udføre sin regelmæssige funktion i myriader cellulære veje , som det er blevet påvist ved funktionelle ændringer som følge af alternativ splejsning af IRF-3 præ-mRNA. IRF-3a er den første karakteriserede IRF-3 splejsning isoform og dets oprindelige exon 2 fundet i IRF-3 affattes intron 2 [35]. IRF-3a protein mangler en del af den N-terminale DBD af IRF-3 og er i stand til at binde til klassiske IRF bindende elementer, såsom IFN-stimulerede responselementer (ISREs). Men IRF-3a med et intakt IAD domæne er blevet vist, for at danne en heterodimer med IRF-3 efter virusinfektion og inhiberer IRF-3 transkriptionel aktivitet [36]. For nylig har vi identificeret fem nye splejsning varianter af IRF-3, der er nævnt som IRF-3b, 3C, -3D, -3e og -3f, og afslørede, at disse splejsning varianter er genereret ved sletning af exon 2, 3, eller 6 eller en kombination deraf [37]. Disse hidtil ukendte splejsning isoformer blev bygger til at miste hele regionen af ​​DBD-domænet (IRF-3b, 3C, -3D, og ​​-3f) eller miste dele af TAD og IAD domæner (IRF-3b, -3D, og ​​-3e ). Derudover har vi også vist, at disse hidtil ukendte splejsningsvarianter blev udtrykt i forskellige former for humane celler og væv og syntes at fungere som negative modulatorer af IRF-3 og reducere transaktivering af IFNp-promotoren i forskellig grad. Disse etablerede strukturelle og funktionelle ændringer på grund af alternativ splejsning garanterer yderligere undersøgelse af den molekylære mekanisme for splejsning regulering af IRF-3 præ-mRNA.

I den foreliggende undersøgelse, RNA-interferens-medieret nedbrydning af hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF i human ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) -celler øget udelukkelse af exon 2 og 3 i IRF-3-præ-mRNA. Ved at bruge sekvensanalyse og programmer som ESE Finder, vi identificeret hnRNP A1 /A2 bindingssted (UAGGGA) og SF2 /ASF bindingssted (GGAAGGA) i IRF-3 intron 1. Efterfølgende elektroforetiske mobilitet (EMSA) ved hjælp af vildtype ( vægt) RNA-probe eller RNA med mutation i disse bindingssteder og mutant IRF-3 minigen splejsning assay bekræftede tilstedeværelsen af ​​hnRNP A1 /A2 og SF2 /ASF bindende motiver i IRF-3 intron 1. Endvidere indflydelsen af ​​ændringer af IRF- 3 splejsning mønster på udtryk for dens downstream målgener og cytokinproduktion i NSCLC /perifert mononukleære blodlegemer (PBMC) co-kulturer blev også evalueret.

Materialer og metoder

Cell Kultur og RNA interferens

Humant NSCLC cellelinier A549 og Calu-6 blev opnået fra ATCC (Manassas, VA). Celler blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C med 5% CO

2.

Små interferens RNA’er (siRNA’er) målretning hnRNP A1, hnRNP A2, SF2 /ASF, eller polypyrimidine tarmkanalen bindende protein (PTB eller hnRNP I) mRNA blev udvalgt og siRNA transfektioner blev udført som beskrevet [7] , [38]. Grundet funktionel redundans af hnRNP A1 og hnRNP A2 tidligere rapporteret, blev siRNAs af disse to gener transficeres samtidigt. Kort beskrevet blev eksponentielt voksende A549 og Calu-6-celler podet i plader med 6 brønde (2 × 10

5 celler /brønd). Den næste dag, 80 pmol hnRNP A1 og hnRNP A2 (hver 40 pmol), 40 pmol af SF2 /ASF, eller 40 pmol af PTB duplex RNA’er (Beijing DNA-SYN Biotechnology Co., Beijing, Kina) blev blandet med 6 pi Oligofectamine transfektionsreagens (Invitrogen) plus 250 pi Opt-MEM-medium (Invitrogen) i 20 minutter og blev derefter tilsat til celler. Efter transfektion i 48 timer, blev cellerne yderligere transfekteret med 20 pmol dobbeltstrenget RNA-Poly (I: C) (Sigma, St. Louis, MO) for at aktivere signalering gennem IRF-3-vejen. Efter Poly (I: C) stimulation i 24 timer blev totalt cellulært RNA og protein isoleret til yderligere analyse. For specifikke siRNA transfektioner blev uoverensstemmende siRNA transfektion anvendt som mock-transficeret kontrol.

Total RNA Isolation og semikvantitativ RT-PCR

Totalt cellulært RNA blev isoleret ved hjælp Trizol reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Ca. 3 ug totalt RNA fra hver cellelinje blev spaltet med RNase-fri DNase I (Promega, Madison, WI) for at fjerne DNA-kontaminering og revers transkriberet til cDNA under anvendelse af Superscript III System (Invitrogen). At undersøge mRNA ekspressionsniveauer af målgener i celler, blev typespecifikke primersæt designet og de tilsvarende PCR-produkter blev sekventeret for at bekræfte transkription nøjagtighed. Primersættene, annealingstemperatur til amplifikation, og længden af ​​PCR-produkter er anført i tabel 1. PCR-blandingen bestod af 10 mM Tris-HCI pH 8,0, 50 mM KCI, 1,5 mM MgCl

2, 200 pmol for hvert primer, 2 U Taq DNA-polymerase (Promega), og en 1-2 pi prøve cDNA. De resulterende fragmenter blev underkastet elektroforese på en 1,2-2,5% agarose-gel og visualiseret med ethidiumbromidfarvning. Alle PCR-reaktioner blev gentaget med reproducerbare resultater. β-actin blev anvendt som intern kontrol og totalt RNA ekstraheret fra de samme celler uden revers transkription blev anvendt som negativ kontrol. At sikre, at PCR-reaktioner falder inden for det lineære område af amplifikation, blev de korrekte antal cykling til amplifikation af hver kontrol eller målgen undersøgt (data ikke vist).

Western blot-analyse

Celler blev lyseret i 30 minutter i lyseringsbuffer (15 mM Tris-HCI pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20 og 1 mM DTT) suppleret med proteaseinhibitorer, og opløsningen blev klaret ved centrifugering ved 12.000 rpm i 15 min. Totalt protein (25 ug) i 1 × natriumdodecylsulfat (SDS) prøvepuffer blev separeret ved 10% SDS-PAGE og elektro-overført til nitrocellulosemembran (Amersham Pharmacia Biotech, Chicago, IL). Membranerne blev derefter blokeret med 5% fedtfri mælk og probet med specifikke primære antistoffer: anti-hnRNP A1 (Proteintech Group, Inc., Chicago, IL), anti-hnRNP A2B1 (Proteintech), anti-SF2 /ASF (Santa Cruz Biotechnology , Santa Cruz, CA), anti-PTB (Proteintech), anti-Actin (i-19) (Santa Cruz), eller anti-IRF-3 (Proteintech) (1:1000 til 1:3000 fortynding), hhv. Efter vask med 0,2% Tween 20 /PBS-buffer tre gange blev membraner inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof og fremkaldes med den forøget kemiluminescens-systemet, ECL (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK).

elektroforetiske mobilitet Shift assay (EMSA)

sekvensen af ​​intron 1 af IRF-3-præ-mRNA, opstrøms for exon 2 5′-splejsningssted, indeholder UAGGGA sekvens, som er den samme som den konsensus hnRNP A1 /A2 højaffinitetsbinding websted identificeret af SELEX, UAGGG (A /U) [39]. Ved at bruge ESE Finder program blev andre to bindingssteder (GGAAGGA) af SF2 /ASF identificeret umiddelbart opstrøms for exon 2 5′-splejsningssted. At udforske den mulighed, at hnRNP A1 /A2 og SF2 /ASF binder til disse bindende motiver blev fusionsproteiner GST-hnRNP A1 og GST-SF2 /ASF udtrykt af IPTG induktion og renset med Glutathione Sepharose 4B. Syntetiske RNA oligonukleotider indeholdende vildtype bindingsmotiver for hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF (wt-A1 eller wt-SF2), den G3C mutant bindende motiv for hnRNP A1 /A2 (mu-A1), eller G2C mutant bindende motiv for SF2 /ASF (mu-SF2) blev biotinyleret under anvendelse af Pierce RNA 3 ‘End biotinyleringskit (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL) ifølge producentens instruktioner. Gel shift-reaktionerne blev udført under anvendelse af LightShift Chemiluminescent EMSA Kit (Pierce) ifølge producentens beskrivelse. Kort fortalt blev 20 fmol af biotinylerede vildtype eller mutant RNA-prober inkuberet med 50 ng oprenset GST-fusionsproteiner i 20 minutter ved stuetemperatur i en 20-pi bindingsreaktion indeholdende 2 ug tRNA. EMSA reaktionerne blev elektroforeret på en 6% nativ PAGE, overført til en positivt ladet nylonmembran (Amersham), og derefter tværbindes under anvendelse af en GS-genet Linker UV kammer (BioRad, Hercules, CA). Påvisning af biotinyleret RNA blev udført under anvendelse stabiliseret streptavidin /peberrodsperoxidase-konjugat (Pierce) ifølge producentens instruktioner. For at demonstrere specificiteten af ​​protein-RNA kompleksdannelse, blev renset GST proteinet anvendt til EMSA reaktion og fungerede som negativ kontrol.

IRF-3 minigen Byggeri og transfektion

En vildtype minigen, der indeholder relevante IRF-3 genomisk region fra exon 1 til exon 4, og flankerende regioner blev klonet i pcDNA3.0 vektor (Invitrogen) ved hjælp af

Kpnl

i og

Eco

RI skærende sites. Den intron 1 af wt-IRF-3 minigenet indeholder de formodede bindingssteder for hnRNP A1 /A2 (wt-A1) og SF2 /ASF (wt-SF2). Minigener med G3C mutant bindingssted for hnRNP A1 /A2 (mu-A1) eller G2C mutant bindingssted for SF2 /ASF (mu-SF2) blev dannet gennem en totrins-PCR overlap extension [40] med wt-IRF -3 minigenet konstruere som skabelon. Alle ekspressionskassetter er under kontrol af CMV-promotoren og et polyA signal. Alle konstruktionerne blev verificeret ved sekventering. Vildtype og muterede minigen vektorer blev transficeret i A549-celler. Otteogfyrre timer efter transfektion blev celler opsamlet og de relative ekspressionsniveauer af IRF-3 isoformer blev analyseret under anvendelse af RT-PCR.

isolering og dyrkning af perifere mononucleære blodceller (PBMC) og Co-dyrkning med A549 Celler

undersøgelsen protokol og samtykke dokumenter blev godkendt af den etiske og Akademisk udvalg i Peking University First Hospital. Perifer vene blodprøver blev opnået fra raske donorer med informeret samtykke. Isolering og dyrkning af PBMC blev udført som tidligere beskrevet [41]. Kort fortalt blev PBMC isoleret fra perifert blod under anvendelse af Histopaque®-1077 (Sigma) ved at følge producentens instruktioner. Til dyrkning af PBMC, blev celler resuspenderet i RPMI 1640 suppleret med 5% varmeinaktiveret FBS (Invitrogen), 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 5 ug /ml Phytohæmagglutinin (PHA) (Sigma) og 10 mM HEPES og podes ved 2 × 10

5 celler /brønd i plader med 6 brønde.

til efterfølgende samdyrkning med PBMC, A549-celler ved 60-80% konfluens blev transficeret med specifikke siRNA’er som beskrevet ovenfor. Ved 48 timer efter transfektion blev cellerne yderligere transficeret med Poly (I: C). Fire timer senere blev mediet ændret til PBMC co-dyrkningsmedium [RPMI 1640 suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 1 pg /ml PHA og 10 mM HEPES]. PBMC (5 x 10

6 celler) blev podet i Transwell-Clear skær (0,4 um porestørrelse, Costar Group, Washington, DC) og anbragt oven på A549 kulturer. Samdyrkning udførtes i 72 timer og dyrkningsmedium blev derefter opsamlet til yderligere analyse.

Påvisning af IFNp, CXCL10 /IP-10, TNF-α og IL-10 ved enzymkoblet immunsorbentassay (ELISA )

Koncentrationer af IFNp (Pierce), CXCL10 /IP-10 (SABiosciences, Frederick, MD), tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α) (SABiosciences) og interleukin-10 (IL-10) (SABiosciences) i cellekultursupernatanter blev bestemt ved ELISA i overensstemmelse med producentens anvisninger. Dataene blev målt ved 450 nm med en BioRad mikropladelæser.

immunhistokemisk farvning

Til immunhistokemi analyse af ekspressionen af ​​hnRNP A1, hnRNP A2, SF2 /ASF, og IRF-3, 63 paraffinindstøbte humane NSCLC tumorvæv, 39 tilstødende ikke-tumor kontrol væv og 26 bronchiectasis væv blev opnået fra Peking University First Hospital, Beijing, Kina. Denne undersøgelse blev godkendt af både den etiske og Akademisk udvalg i Peking University First Hospital, og informeret samtykke blev opnået fra hver emne.

Alle væv blev paraffinindlejrede og blev farvet ved hjælp af S-P immunhistokemisk metode. Kort fortalt blev objektglassene deparaffinised i xylen, rehydreret i graduerede ethanol, og behandles derefter med PBS indeholdende 3% hydrogen dioxid at blokere endogen peroxidase. Efter præinkubering i 10% gedeserum for ikke-specifik binding blok blev objektglassene derefter inkuberet med specifikke primære antistoffer: anti-hnRNP A1 (Proteintech), anti-hnRNP A2B1 (Proteintech), anti-SF2 /ASF (Santa Cruz), eller anti-IRF-3 (Proteintech) ved 4 ° C natten over. Efter skylning blev snit efterfølgende inkuberet med biotinylerede immunoglobuliner i 15 minutter og derefter med streptavidin-peroxidasekonjugat i 15 min. Signalerne blev udviklet med DAB-H

2O

2 løsning. Objektglassene blev modfarvet med 5% hematoxylin, og derefter undersøgt ved lysmikroskopi. Sektioner uden primært antistof behandling blev anvendt som negativ kontrol. Farvningen blev scoret på en skala fra 0 til IV som følger: 0, blev mindre end 5% celler farves; Jeg blev 5-25% celler farves; II, 25-50% celler blev farvet; III, 50-75% celler blev farvet; og IV, blev mere end 75% celler farves. Scores II-IV blev klassificeret som positive, mens scores 0 og jeg var negative.

Statistisk analyse

SPSS 15,0 software (SPSS Inc., Chicago, IL) blev anvendt til at bestemme statistisk signifikans. De kontinuerlige variabler fra forskellige grupper blev vist som middelværdi ± S.D. og blev sammenlignet med

t

test. Chi-square test blev anvendt til at analysere betydning for hnRNP A1, hnRNP A2, SF2 /ASF, og IRF-3-ekspression mellem ondartede og godartede lunge vævstyper undersøgt. Værdier på

P

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Knockdown af hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF i Human NSCLC Celler Øger Udelukkelse af Exon 2 og 3 af IRF-3 Gene

for at undersøge den mulige virkning af hnRNP A1 /A2 og SF2 /ASF om splejsning regulering af IRF-3-genet, vi udførte siRNA-medieret nedbrydning af hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF i NSCLC celler A549 og Calu-6. Efter siRNA transfektion og efterfølgende Poly (I: C) stimulering af IRF-3-signalvejen, totalt cellulært RNA og protein blev isoleret og overflod af hnRNP A1 /A2 og SF2 /ASF mRNA’er og proteiner blev vurderet ved semikvantitativ RT-PCR og Western blot-analyse, hhv. Sammenlignet med mock-transficeret kontrol ekstrakter, ekstrakterne fra både A549 og Calu-6 celler transficeret med specifikke siRNA’er viste en markant reduktion i ekspressionsniveauerne af målgener (fig. 1B og 1C). Som forventet havde den SF2 /ASF siRNA transfektion ikke påvirke niveauerne af hnRNP A1 /A2, og vice versa.

(A) Skematisk diagram, der viser tre splejsningsvarianter FL-IRF-3 (fuld længde IRF -3), type I (kun E2 udelukkelse) og Type II (både E2 og E3 udstødelse) isoformer. E, exon. IRF-3 exons fra 1 til 4 er nummereret. Den sorte fuldt optrukne linie repræsenterer introns. Pilene over transkripterne vise placeringen af ​​specifikke primersæt designet til RT-PCR-analyse af IRF-3 splejsningsvarianter. (B) Splejsning faktorer hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF blev udtømt ved specifikke siRNA transfektion i humane NSCLC celler A549 og Calu-6, hhv. A1, hnRNP A1; A2, hnRNP A2. Uoverensstemmende kontrol siRNA blev anvendt til mock-transficeret kontrol. Efter siRNA transfektion og efterfølgende Poly (I: C) stimulering blev cellerne høstet og semikvantitativ RT-PCR blev udført for at fastslå virkningen af ​​RNA-interferens på ekspression af målgener og IRF-3 splejsningsvarianter. Produkter svarende til FL-IRF-3 og de to slags splejsningsvariant (type I og type II) er angivet med pile. For alle reaktioner blev totalt RNA ekstraheret fra A549-celler uden revers transkription anvendt som negativ kontrol. PCR-produkter af FL-IRF-3, type I- og type II-isoformer blev kvantificeret ved TotalLab Quant scanning. Grafen viser forholdet isoform FL /(FL + I + II), og værdierne er gennemsnit ± SD for n = 3 eksperimenter. (C) Western blot-analyse blev udført med antistoffer rettet mod proteinerne angivet til højre. Protein bånd af IRF-3 blev også kvantificeret og normaliseret til intern kontrol actin. Grafen viser forholdet IRF-3 /Actin og værdierne er gennemsnit ± SD for n = 3 eksperimenter.

#

P

##

P

. 0,05 sammenlignet med mock-transficeret A549 og Calu-6 celler, henholdsvis

de IRF-3 splejsningsvarianter, IRF-3b, 3C, -3D, og ​​-3f mister exon 2 eller begge exon 2 og exon 3 [37]. For at analysere ændring af alternativ splejsning af IRF-3 i siRNA-transficerede celler, blev RT-PCR-amplifikation af IRF-3 udført under anvendelse af specifikke primersæt med fremadrettet primer placeret i exon 1 og revers primer i exon 4. Som vist i fig. 1A og 1B, fuld længde IRF-3 (FL-IRF-3) og to slags splejsningsvariant (type I: kun exon 2 udstødelse og Type II: både exon 2 og exon 3 udstødelse) genererede tre bånd: 500 bp (E1 + 2 + 3 + 4), 327 bp (E1 + 3 + 4), og 155 bp (E1 + 4) i længden hhv. Som for A549-celler, kombineret depletion af hnRNP A1 og hnRNP A2 og enkelt udtømning af SF2 /ASF både medført indlysende fald i FL-IRF-3-mRNA, fra 67% til 9% eller 11%, og ledsagende stigning i mRNA’er af type I og II isoformer (fig. 1B). Lignende resultater blev opnået under anvendelse af Calu-6-celler, med knockdown af hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF resulterer i fald fra 91% til 13% eller 15% FL-IRF-3-mRNA (fig. 1B). Enkelt hnRNP A1 eller hnRNP A2 depletering blev også udført i NSCLC-celler og viste ingen virkning på IRF-3 splejsningsmønster (data ikke vist). I overensstemmelse med RT-PCR-resultater, hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF udtømning medførte indlysende fald i ekspressionsniveauer af IRF-3 protein i både A549 og Calu-6 celler (Fig. 1C).

For at undersøge mere direkte specificitet hnRNP A1 /2 eller SF2 /ASF udtømning og exon skipping af IRF-3 præ-mRNA, brugte vi siRNA at nedbryder PTB, en anden rigelige negativ regulator af alternativ splejsning. PTB udtømning viste ingen virkning på splejsningsmønster af IRF-3 (fig. 2A og 2B).

Splejsning faktor PTB blev udtømt ved specifik siRNA transfektion i humane NSCLC-celler A549 og Calu-6. Uoverensstemmende kontrol siRNA blev anvendt som mock-transficeret kontrol. Efter siRNA transfektion og efterfølgende Poly (I: C) stimulation, totalt cellulært RNA og protein blev opsamlet og testet ved semikvantitativ RT-PCR (A) og Western blot-analyse (B) for at undersøge ekspressionsniveauerne af målgener og IRF- 3 splejsningsvarianter angivet til højre. For RT-PCR-reaktioner, blev totalt RNA ekstraheret fra A549-celler uden revers transkription anvendt som negativ kontrol. For alle RT-PCR og Western blot analyse blev Actin anvendt som intern kontrol.

hnRNP A1 /A2 og SF2 /ASF binde specifikt til Sekvenser i IRF-3 Intron 1

på grund af den identifikation af hnRNP A1 /A2 og SF2 /ASF bindingsmotiver umiddelbart opstrøms for IRF-3 exon 2 5′-splejsningssted (fig. 3A), vi yderligere undersøgt muligheden at hnRNP A1 /A2 og SF2 /ASF binder specifikt til disse bindende motiver. Fusion proteiner GST-hnRNP A1 og GST-SF2 /ASF blev udtrykt af IPTG induktion og renset med Glutathione Sepharose 4B (fig. 3B). GST-fusionsproteiner blev inkuberet med biotinyleret RNA-prober indeholdende UAGGGA eller GGAAGGA sekvenser af IRF-3 intron 1 og EMSA analyse blev udført. Som vist i fig. 3C, klart skift bånd blev fundet med GST-hnRNP A1 og GST-SF2 /ASF proteiner. Yderligere G3C mutation af UAGGGA motiv og G2C mutation af GGAAGGA motiv medførte store fald i hnRNP A1 og SF2 /ASF binding. Disse data bekræftede tilstedeværelsen af ​​hnRNP A1 /A2 og SF2 /ASF bindingssteder opstrøms for exon 2 5′-splejsningssted af IRF-3-præ-mRNA.

(A) Sekvenser af intron 1 (439-462) og intron 1 (558-600) af IRF-3. De formodede bindingssteder for hnRNP A1 /A2 (wt-A1) eller SF2 /ASF (vægt-SF2) er angivet med fed kursiv. Den G3C mutant bindingssted for hnRNP A1 /A2 (mu-A1) og G2C mutant bindende site for SF2 /ASF (mu-SF2) er understreget. (B) Fusion proteiner GST-hnRNP A1 (GST-A1) og GST-SF2 /ASF (GST-SF2) blev udtrykt af IPTG induktion og renset med Glutathione Sepharose 4B. (C) Tyve nanogram af hvert GST, GST-A1, og GST-SF2 protein blev anvendt til elektroforetisk mobilitet shift assay med biotinylerede RNA-prober WT-A1 eller wt-SF2 og deres mutant derivater.

IRF-3 minigener med muterede hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF Binding motiver Forøg Udelukkelse af Exon 2 og 3

for yderligere at udforske de roller hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF bindende motiver i splejsning regulering af IRF -3-genet, IRF-3 minigener indeholder vildtype eller mutante hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF bindende motiver blev konstrueret og transficeret ind i A549-celler (fig. 4A og 4B). De relative ekspressionsniveauer af IRF-3 isoformer blev målt ved RT-PCR-analyse. Sammenlignet med vildtype minigen transfektion mutationen af ​​hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF bindingssteder medførte indlysende fald i forholdet isoformen FL /(FL + I + II), fra 79% til 23% eller 28% (begge

P

0,05), henholdsvis som vist i fig. 4B og 4C.

(A) Vildtype (wt) og mutante (mu) versioner af IRF-3 minigen er vist. PCMV, promotoren af ​​pcDNA3.0-vektoren. pA, polyA signal. IRF-3 exons fra 1 til 4 er nummereret. Den sorte fuldt optrukne linie repræsenterer introns. (B) Forbigående transfektion af vildtype-IRF-3 eller mu-IRF-3 minigener blev udført i A549-celler og de relative ekspressionsniveauer af IRF-3 isoformer blev målt ved RT-PCR-analyse. (C) Grafen viser forholdet isoform FL /(FL + I + II), og værdierne er gennemsnit ± SD for n = 3 eksperimenter.

#

P

##

P

. 0,05 sammenlignet med wt-IRF-3 minigen transfektion

SiRNA-medieret Nedbrydning af hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF Reducerer Ekspression af IRF-3 Downstream Effector Molekyler IFNp og IP-10

for at undersøge virkningen af ​​IRF-3 alternativ splejsning reguleret af knockdown af hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF på ekspression af IRF-3-inducerbare gener, isolerede vi totalt RNA fra A549 og Calu-6 celler efter specifik siRNA transfektion og efterfølgende Poly (i: C) stimulation og udførte semikvantitativ RT-PCR for at analysere ekspressionsniveauerne af IFNp og IP-10 gener. Endvidere blev supernatanten af ​​cellekultur også opsamlet og IFNp og IP-10-proteiner blev undersøgt ved ELISA-assay under anvendelse af anti-IFNp eller anti-IP-10-antistoffer, henholdsvis. Som vist i fig. 5A og 5B, A549 og Calu-6 celler uden Poly (I: C) stimulering viste meget lave ekspressionsniveauer af IFNp og IP-10, sammenlignet med celler med Poly (I: C) stimulation. Som forventet blev nedregulering af IFNp og IP-10 gener i både mRNA og proteinniveauer parallelt med signifikant nedsat ekspressionsniveauer af IRF-3-protein i både A549 og Calu-6 celler transficeret med hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF siRNA (fig. 1C, 5A, og 5B).

A549 og Calu-6-celler blev udført specifikke siRNA-medieret knockdown af hnRNP A1 /A2 eller SF2 /ASF. Mock, celler transficeret med uoverensstemmende kontrol siRNA. Kontrol, celler uden specifik eller mock siRNA transfektion og Poly (I: C) stimulation. (A) Efter siRNA transfektion og efterfølgende Poly (I: C) stimulation, mRNA ekspression af IFNp og IP-10 gener blev analyseret ved semikvantitativ RT-PCR. Totalt RNA isoleret fra A549-celler uden revers transkription blev anvendt som negativ kontrol. (B) Sekretion af IFNp (øverst) og IP-10 (nederst) proteiner blev undersøgt ved ELISA-assay. Værdien for hver analyse præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse Som vist i fig.