PLoS ONE: Betydningen af ​​DNMT3b i Oral Cancer

Abstrakte

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge specifikke molekylære markører, der kan føre til nye indsigter i identifikationen af ​​innovative behandlinger. Rolle DNMT3b og dets forudsigelseskraft i prognosen af ​​oral cancer, blev identificeret. Humane orale cancer cellelinjer, herunder SCC4 og SCC25 blev udvalgt til cellulære eksperimenter. Ændringer i tumorvækst, aggressivitet og den ansvarlige signalvej blev undersøgt

in vitro

in vivo

. Desuden blev 125 mundtlige kræft vævsprøver analyseret ved hjælp af immunhistokemisk farvning på væv microarray dias, og korrelationer beregnes mellem niveauet for DNMT3b og det kliniske resultat af patienterne. Vores data viste, at hæmning af DNMT3b resulterede i langsommere tumorvækst, svækket tumor invasion evne og epitelial mesenkymale overgang, som bestemt af

in vitro

og

in vivo

eksperimenter. Aktiveret IL-6-signalering kan være ansvarlig for induktion af DNMT3b overekspression på kræft i mundhulen. Vedrørende kliniske data, forekomsten af ​​DNMT3b immunreaktivitet i orale cancer prøver var signifikant højere end i ikke-malignt epitel, og positivt forbundet med ekspression af IL-6. Endvidere ekspression af DNMT3b blev signifikant forbundet med risiko for lymfeknuder, recidiv og kortere overlevelse hos patienter med patologisk stadium III-IV oral cancer. Konkluderende kan IL-6 -DNMT3b akse anvendes til at forudsige prognosen for oral cancer i klinikker, og målretning DNMT3b kunne repræsentere en lovende behandlingsstrategi

Henvisning:. Chen WC, Chen MF, Lin PY (2014 ) Betydningen af ​​DNMT3b i Oral Cancer. PLoS ONE 9 (3): e89956. doi: 10,1371 /journal.pone.0089956

Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan

Modtaget: 30 oktober, 2013; Accepteret: 24 Jan 2014; Udgivet: 13 marts 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet var støtte fra Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan, giver CMRPG6A0222-3. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

de hyppigst oral kræftformer er mundtlige planocellulært karcinom (OSCC), som er de mest ondartede tumorer i hoved og hals. Denne aggressive epitelial neoplasme er forbundet med alvorlig sygelighed. Postoperative strålebehandling (CCRT) resulterer i bedre loco-regional kontrol og overlevelse for lokalt avancerede patienter med hoved- og halscancer med høj risikofaktorer [1]. Trods betydelige fremskridt i behandling, 40-50% af patienter med lokalt fremskreden sygdom tilbagefald med lokal eller fjern sygdomsprogression [2]. Undersøgelse specifikke molekylære markører relateret til ubalance mellem celledød og spredning, evnen til væv invasion og behandling følsomhed, kunne give ny indsigt til identifikation af innovative behandlinger.

OSCC er en multifaktoriel sygdom, hvilket primært forbundet med kronisk tobak, alkohol og betelnød bruge [3]. Genetisk disposition har også været impliceret i oral tumorgenese, og multiple genetiske og epigenetiske vekslen er involveret i væksten af ​​cancer [4]. Aberrant DNA-methylering spiller en central rolle i carcinogenese, hvilket fører til epigenetisk inaktivering af tumor-suppressor gener involveret i cellecyklusregulering, apoptose og DNA-reparation [5], [6]. DNA hypermethylering forekommer hyppigt hos præcancerøse og cancer væv [7]. I OSCC, P14, P16, MGMT, DAP-kinase og E-cadherin var ofte og udførligt studerer denatureret gener [8] – [12]. DNA methylering typisk medieret af DNA methyltransferaser (DNMT) og i mammale genomer der er tre DNMT gener; DNMT3a og DNMT3b er ansvarlige for de novo methylering og ændre umethyleret DNA, og DNMT1 menes at være ansvarlig for at opretholde methylering mønstre [13] – [15]. DNMT3b er blevet rapporteret til at deltage i carcinogenese af flere kræftformer, herunder esophageal, mave- og lungekræft [16] – [18], men den rolle DNMT3b i OSCC kræver yderligere undersøgelser. Vi har tidligere rapporteret, at aktiverede IL-6-signalering var forbundet med aggressiv tumor adfærd i oral cancer [19]. I orale cancerceller, blev IL-6 rapporteret at fremme tumorigenese ved alterinig DNA-methylering [20]. Derfor undersøgte vi ekspressionen af ​​DNMT3b i OSCC og dens forbindelse med IL-6-signalering i nærværende undersøgelse. Rolle DNMT3b i OSCC

in vitro

in vivo

, og korrelationen med de kliniske resultater hos patienter med OSCC hjælp immunkemisk farvning analyse blev også undersøgt.

Materialer og metoder

Vævsprøver og karakteristika for patienter

Institutional Review Board (IRB) i Chang Gung Memorial Hospital godkendt nærværende undersøgelse (Permit nummer: 98-3546B). De skriftlige samtykke blev underskrevet af patienterne for deres modellen og oplysninger, der skal lagres i hospitalet og anvendes til forskning. Proceduren for godkendelse blev godkendt af IRB. Prøver blev retrospektivt indsamlet fra patienter diagnosticeret med lokalt fremskreden OSCC der fik helbredende behandling, og bygget ind i væv microarrays (TMA) blokke til immunkemiske analyse. I undersøgelsen blev TMA blokke bestod af 125 OSCC tilfælde med patologisk stadium III-IV (bukkai, n = 48; gingival, n = 24; læbe, n = 10; tungen, n = 35; ganen, n = 8) ved AutoTiss 1000 (Ever bioteknologi, Canada). Når blokkene var til rådighed, hæmatoxylin og eosin-farvede objektglas blev revurderet af en patolog til at vurdere kvaliteten af ​​TMA lysbilleder. Data om den første diagnose, iscenesættelse, patologiske faktorer, tilbagefald og overlevelse blev indsamlet (tabel 1). Overlevelsessandsynligheden analyser blev udført ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden. Betydning mellem gruppeforskelle blev vurderet ved hjælp af Sperman-rank test. Multivariate analyser blev udført ved hjælp af en Cox regressionsmodel for samlet overlevelse. Alle statistiske tests var tosidet, med signifikans defineret som p. 0,05

immunhistokemisk farvning (IHC)

Vævssnit fra TMA blokke og formalinfikserede, paraffinindlejrede væv var skåret i 4-um snit, monteret på objektglas, afparaffiniseret med xylen og dehydratiseret ved anvendelse af en gradueret ethanol serie. Antigen-genvinding, med anvendelse af citronsyre (pH 6,0) i 30 minutter blev efterfulgt af behandling with3% hydrogenperoxid. Objektglassene blev inkuberet natten over ved 4 ° C med antistoffer mod specifikke proteiner. Antistoffer specifikke for p-H2AX, MMP-9, vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF), og CD31 blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA), Chemicon (Temecula, CA), Research Diagnostics Systems, Inc. (Minneapolis, MN USA), og DNMT1 og DNMT3b blev indkøbt fra Abcam (Cambridge, MA), hhv. De blev anvendt ved 1:100 fortyndinger. Efter tre vaske i phosphatbufret saltvand (PBS), blev sektionerne inkuberet med biotinyleret sekundært antistof for10 min og farvet med peroxidase-avidin og vasket igen i PBS; derefter 3-amino-9-ethylcarbazol opløsning blev tilsat. Snittene blev modfarvet med hæmatoxylin. IHC data blev analyseret under anvendelse Image Pro Plus 6.3 (IPP). Mikrovaskulære densitet (MVD) målinger blev under anvendelse CD31-farvning Hver immunreaktive endotelcelle klynge i kontakt med det valgte felt blev talt. Dataene i IHC blev undersøgt ved god hastighed scanning diasscanning platform, og analyseret ved Image Pro Plus 6.3 (IPP). Denne analyse viste, at antistofferne målrettede proteiner, var stærkt udtrykt i tumorceller epitelceller (fig. 1) sammenlignet med tilstødende ikke-kræftvæv. Til histologisk evaluering af DNMT1 og DNMT3b farvning, foruden IPP-analyse, objektglas blev igen kontrolleret af en enkelt patolog. DNMT1 og DNMT3b immunoreaktiviteten af ​​en vævsprøve blev talt for cellerne udviste positive nukleær farvning, uanset cytoplasmatiske staining.The prøver blev vurderet ved anvendelse af semikvantitativ immunreaktive score (IRS). IRS blev beregnet ved at multiplicere farvningsintensitet (gradueret som: 0 = nej, 1 = svag, 2 = moderat og 3 = stærk farvning), og procentdelen af ​​positivt farvede celler (0 = mindre end 10% af farvede celler, 1 = 11-50% af farvede celler, 2 = 51-80% af farvede celler og 3 = mere end 81% af farvede celler). Kriteriet for positiv farvning er en model med en IRS scoring klasse 2.

A. Niveauer af DNMT1 og DNMT3b blev undersøgt i cancer (CA) og ikke-malignt væv (NT) ved Western blotting-analyse. B. Niveauer af DNMT1 og DNMT3b blev undersøgt i seks prøver (parret cancer (CA) og tilstødende ikke-malignt væv (NT). Ved RT-PCR Y-aksen viser forholdet mellem målprotein i kræftvæv divideret med det i . ikke-maligne eksemplar Kolonner, gennemsnit af tre separate forsøg, barer, standardafvigelse (SD) *, P. 0,05 C. Repræsentative lysbilleder af IHC positiv farvning med DNMT1 og DNMT3b antistoffer er vist ved billeder ved hjælp af IPP (NT, tilstødende ikke ondartet epitel,. CA, oral cancer væv) Billeder af repræsentative dias er vist ved forstørrelser af × 100 (øverste række) og × 200 (nederste række) * (+) betyder positiv farvning i kræft .. tilstødende NT

Cell kultur og reagenser

De humane orale cancer cellelinjer, SCC4 og SCC25, blev opnået fra Bioresource Indsamling og Research center (BCRC). Humant rekombinant IL-6-antistof blev opnået fra R .. D (Minneapolis, MN) The DNMT inhibitor 5-aza-2′-deoxycytidin blev opnået fra Sigma (St. Louis, MO) The DNMT3b-GFP silencing vektor (psiRNA-h7SK vektor, der udtrykker siRNA targeting human DNMT3B fra det menneskelige 7SK RNA-polymerase III-promotor, og GFP:Zeo fusion genet, som giver både reporter og antibiotikaresistens aktiviteter) og GFP-kontrol vektor (Ikke-effektiv scrambled siRNA i GFP vektor) blev købt fra InvivoGen. Stabile DNMT3b-lyddæmpet cancerceller blev genereret ved transfektion af SCC4 og SCC25 celler med DNMT3b silencing vektor og selekteres ved dyrkning i medium indeholdende Zeomycin i 4 uger.

Cellevækst og klongenicitetsassayet

Virkningerne af DNMT3b om cellevæksthastigheden blev vurderet under anvendelse af celler transficeret med en DNMT3b silencing vektor eller kontrolvektor. For at måle cellevækst, 1 x 10

4 celler per brønd blev udpladet i 6-brønds skåle. Ved de angivne tidspunkter blev celler trypsiniseret, opsamlet og overlevende celler talt under anvendelse af Trypan blå eksklusion, hvorfra overlevelseskurverne for SCC transfektanter blev etableret. Desuden blev klongenicitetsassayet anvendes. Eksponentielt voksende celler blev inkuberet ved 37 ° C i 10 dage, og pladerne blev farvet med krystalviolet (Sigma) støtte kolonitælling. Kolonier, der indeholder . 50 celler blev scoret at bestemme plating effektivitet og overlevende fraktioner for hver cellelinje

Immunoblotting

For western blotting af hele celler og orale vævsekstrakter, prøver var homogeniseret og /eller behandlet med lysepuffer (Calbiochem, La Jolla, CA). De orale vævsprøver omfattede seks kræft vævsprøver og seks ikke-maligne epitel prøver. En NE-PER kit (Pierce, Rockford, IL) blev anvendt til at adskille nukleare og cytoplasmiske proteiner. For at bestemme

in vitro Salg virkninger af IL-6 Ab, og en DNMT inhibitor blev proteiner ekstraheret fra celler i nærvær eller fravær 5 ug /ml IL-6 neutraliserende antistoffer i 24 timer eller 5 um 5- aza-2′-deoxycytidin i 36 t. Den samme mængde protein blev lagt i en 4-20% gradient SDS-PAGE-gel blev proteinet overført til nitrocellulosefiltre efter separeret i gelen. Blots blev blokeret i 2% BSA i TBST i 1 time, blev membranerne inkuberet natten over (4 ° C) med antistoffer mod DNMT1, DNMT3b, VEGF, E-cadherin, STAT3, pSTAT3

Tyr705, og MMP-9. Membranerne blev inkuberet med HRP-konjugeret sekundært anti-ged, anti-mus eller anti-kanin-antistoffer (fortynding 1:1,000-1:2,000) henholdsvis i 1 time ved stuetemperatur. Proteiner blev visualiseret ved forøget kemiluminescens. Membranerne blev testet igen med et antistof mod r-tubulin eller nuklear lamin at normalisere protein loading.

Real-time reverse transcription polymerase kædereaktion (RT-PCR)

Real-time RT-PCR blev udført på RNA ekstraheret fra celler og vævsprøver (seks kræft vævsprøver og seks ikke-maligne orale væv, to prøver kører i hver bane). RNA (2 ug) blev revers-transkriberet med en tilfældig primer for at opnå den første cDNA streng. Sekvenserne af primere for DNMT3b var 5’GACTCGAAGACGCACAGCTG -3 ‘/5′- CTCGGTCTTTGCCGTTGTTATAG’. For at kontrollere for lastning forskelle blev en β-actin primer anvendt som kontrol. Den optimerede PCR blev udført på en iCycler Iq flerfarvet real-time PCR detection system. Væsentlige fluorescerende PCR signaler fra carcinom væv var normaliseret til middelværdien af ​​de signaler, der er opnået fra de ikke-maligne væv og celler under kontrol betingelser.

Immunofluorescens-farvning (IF)

Celler viser eksponentiel vækst podedes på dækglas til immunfluorescensfarvning med eller uden behandling. På de angivne tidspunkter efter behandling blev celler fikseret, permeabiliseret med 2% paraformaldehyd i 5 minutter og vasket med PBST. Objektglassene blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med antistoffer mod E-cadherin, DNMT3b, VEGF og MMP-9 i 1 time med en Texas Red-konjugeret sekundært antistof. Objektglassene blev modfarvet med DAPI at visualisere cellekerner. Efter to gange vask med PBST blev specifikke målproteiner visualiseres ved hjælp af en fluorescens mikroskop.

Cell migration og celleinvasion assay

Kapacitet til celle invasion blev bestemt ved hjælp af en Cell Invasion Assay (Trevigen, Gaithersburg, MD). Efter inkubation i 24 timer blev antallet af celler i bundkammeret bestemt ved måling af fluorescerende anion calcein, der frigives fra intracellulære calcein acetoxymethylester. For at validere eksperimenter vedrørende celle migration, blev scratch analyser udført. En 2 mm bred ridse blev trukket tværs over hver celle lag under anvendelse af en pipettespids. Pladerne blev fotograferet på de angivne tidspunkter.

Tumor xenograftmodel

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr, som bekendtgjort af Institutes of Laboratory Animal Resources, National Research Council, USA protokollen blev godkendt af udvalget for den etiske af dyreforsøg i Chang Gung Memorial Hospital (Permit nummer: 2012080902). Otte uger gamle hun athymiske nøgne mus blev anvendt som xenotransplantat tumorimplantation model. I ektopisk tumorimplantation model, celler (blev 1 × 10

6 tumorceller injiceret subkutant pr implantation, fem dyr pr gruppe) blev implanteret i den bilaterale dorsale glutealregionen. Tumorstørrelse blev målt hver tredje dag efter implantation (dag 0). Tumoren volumen blev beregnet under forudsætning af en ellipsoide form.

Resultater

Niveauer DNMT3b i orale kræft væv

Udtrykket af DNMT3b i vævsprøverne (maligne versus tilstødende ikke-maligne ) undersøgt ved Western blotting, mens mRNA blev påvist ved real-time RT-PCR (fig. 1A-B). Af data, kræft viste et markant højere DNMT3b end ikke-maligne eksemplar. De IHC data TMA slides bekræftede denne konstatering, at DNMT3b blev overudtrykt i tumorvæv end de tilstødende ikke-maligne epitelvæv (Fig. 1C). Af de 125 orale cancervæv analyseret for DNMT3b og DNMT1 hjælp IHC-analyse, 76 (61%) gav DNMT3b positiv immunreaktivitet men kun 36% (45/125) med DNMT1 positiv farvning. Endvidere blev rolle DNMT3b i det kliniske resultat af menneskelig OSCC evalueres yderligere hjælp IHC farvning. Patienterne blev yderligere klassificeret som DNMT3b (+) eller DNMT3b (-) på grundlag af de ICH resultater. Der var en positiv korrelation mellem forekomsten af ​​lymfeknudemetastase, recidiv og DNMT3b positiv farvning (tabel 1). Firs-tre procent (40/46) af patienterne med sygdom tilbagefald (herunder lokal-regional fiasko og fjernmetastaser) demonstrerede positiv farvning for DNMT3b. I modsætning hertil 46% (36/79) af patienterne klassificeret som havende status som sygdomsfri udtrykt DNMT3b. Resultaterne tyder på, at DNMT3b farvning kan have den prædiktive værdi i prognosen for oral cancer.

Rolle DNMT3b i tumorvækst

For at undersøge om alternerende DNMT3b udtryk spillet en rolle i aggressiv tumor vækst, orale cancerceller blev transficeret med en DNMT3b-GFP silencing vektor. Som vist i figur 2A DNMT3b silencing vektor signifikant inhiberede DNMT3b ekspression i cancerceller ved Western blotting og immunokemisk farvning analyse. Virkningen af ​​DNMT3b på tumorcellevækst blev bestemt ved levedygtig celletælling over seks dage og kolonidannelse. Dataene fra cellulære forsøg viste DNMT3b tavshed vektorer signifikant hæmmede tumorcelleproliferation

in vitro

(Fig. 2B). Ændringen i fordelingen cellecyklen blev yderligere målt. Den DNMT3b silencing vektor resulterede i cellecyklusstop (fig. 2C). Som vist i figur 2D ved observation af xenotransplantattumorer, inhibering af DNMT3b hjælp dæmpende vektorer signifikant nedsat tumorvæksthastighed.

A. Effekter af DNMT3b dæmpende vektor på niveauet af DNMT3b i SCC4 og SCC25 demonstreret ved Western blotting og immunkemiske farvning

in vitro

. Billeder af repræsentative lysbilleder vises, og pilen indikerer positiv farvning af DNMT3b i celler. (C-V, celler med kontrol vektor, DNMT3b-SV, celler stabilt transficeret med DNMT3b lyddæmpende vektor; DNMT-I, celler behandlet med DNMT inhibitor). B. Virkning af DNMT3b på proliferationen af ​​orale cancerceller som bestemt ved levedygtig celletælling og kolonidannelse. Det samme antal celler (10

4) blev udpladet i hver plade på dag 0 og lades vokse i deres respektive kulturer. Vi tælles antallet af levedygtige celler efter inkubation i 2, 4 og 6 dage. Y-aksen repræsenterer antallet af levedygtige celler. Punkt, betyder tre separate forsøg; barer, SD. *,

s

0,05. C. Celler blev analyseret ved FACS for DNA-indhold under kontrolbetingelser eller med DNMT3b inhibering. Dataene blev demonstreret ved repræsenteret billeder. D. Virkninger af DBMT3b silencing vektor på niveauerne af DNMT1 og DNMT3b evalueret af IHC og xenograft tumorvækst. Hvert punkt repræsenterer middelværdien af ​​tre separate forsøg; barer, SD; *,

P

0,05. Repræsentative billeder vises.

Rolle DNMT3b i tumor invasion

Der var en positiv sammenhæng mellem DNMT3b farvning og LN metastaser og fiasko sygdom hos patienter med kræft i mundhulen (tabel 1). Som påvist ved hjælp af migration scratch og invasion assays, DNMT3b dæmpende vektorer svækkede invasionen kapacitet af orale kræftceller

in vitro

(fig. 3A-B). Epiteliale mesenkymale overgang (EMT) er en central begivenhed i invasivitet af en tumor [21]. Derfor blev det bestemt, om det var den mekanisme der ligger bag effekten af ​​DNMT3b på oral cancer invasiv. Den DNMT3b silencing vektor inducerede orale cancerceller til at øge deres epiteliale egenskaber som bestemt ved ændringer i ekspression af E-cadherin, et kendetegn for EMT [22] og vimentin (Fig. 3C-D). EMT er rapporteret at være forbundet med en række invasion-relaterede faktorer, herunder VEGF og MMP-9. Vores data viste, at inhibering af DNMT3b af silencing vektor resulterede i lavere ekspression af VEGF og MMP-9. Angiogenese er en af ​​de mekanismer, der fremmer tumorprogression, og CD31-medieret endotheliale celle-celle-interaktioner er involveret i angiogenese [23]. Derfor blev det vaskulære netværk i tumoren målt ved VEGF-farvning og mikrovaskulære densitet (MVD) analyse efter CD31-farvning. Når orale cancerceller med styrevektorer og dem med DNMT3b dæmpende vektorer blev subkutant implanteret i mus, fandt vi, at væksthæmmende virkning induceret af DNMT3b silencing vektor forbundet med lavere ekspressionsniveauer af EMT- og angiogenese-relateret faktor (fig. 3E). Derfor foreslog vi at DNMT3b overekspression spiller en rolle i tumorpromotion, og induktion af angiogenese og EMT kan være de slave mekanismer.

A. Den invasive kapacitet af orale cancerceller med eller uden DNMT3b lyddæmpende vektoren blev evalueret ved migration scratch assays. Resultaterne fra repræsentative lysbilleder vises. Kolonne, gennemsnit af tre separate forsøg. Barer, SD. *, P 0,05. B. invasive kapacitet orale kræftceller med eller uden regulering DNMT3b blev evalueret ved invasion assay i SCC4 og SCC25 kræft oral celler. Resultaterne er vist ved repræsentative dias og kvantitative data. *,

P

0,05. C. Ændringerne af E-cadherin i celler evalueres, og resultaterne er vist ved repræsentative objektglas (øvre række, immunfluorescerende billede farvet med Ab for DNMT3b og DAPI for kernen; nederste række, immunfluorescerende billede farvet med Ab for E-cadherin og DAPI for nucleus); (Blå: DAPI; Green: GFP-vektor, Rød: target protein). D. Ændringerne i EMT-associerede proteiner i celler med regulering DNMT3b blev evalueret ved Western blot analyse (C-V, celler med kontrolvektor; DNMT3b-SV, celler med DNMT3b silencing vektor). E. IHC under anvendelse MMP-9, CD31, og VEGF-farvning i formalinfikserede, paraffinindlejrede væv fra xenotransplantattumorer. DNMT3b dæmpende vektorer blev væsentligt reduceret af angiogenese og EMT-relaterede ændringer i forhold til kontrol vektor.

DNMT3b og IL-6 er forbundet med det kliniske resultat af OSCC

Tidligere, vi rapporteret, at aktivering af IL-6 /STAT3 signalering inducerede aggressive tumorer adfærd og EMT ændringer i oral cancer [19]. Derfor blev sammenhængen mellem DNMT3b og IL-6 i det kliniske resultat af fase III-IV human OSCC yderligere estimeres ved hjælp IHC på TMA’er bestående af 125 prøver. Af de 125 vævsprøver analyseret for DNMT3b og IL-6, begge 59 (61%) positive. Som vist i figur 4A, blev en signifikant positiv sammenhæng observeret i kræft prøven, der farves positivt for DNMT3b og IL-6. Under anvendelse univariat analyse, recidiv og positiv farvning for DNMT3b og IL-6 blev alle signifikant forbundet med kortere overlevelse (tabel 2 og figur 4B). Ved hjælp af multivariat analyse, udtryk for DNMT3b og sygdom tilbagefald var betydelige prædiktorer for samlet overlevelse i de 125 mundtlige kræftpatienter (tabel 3). Resultaterne fremhæver bidrag DNMT3b farvning til dårlig prognose i kræft i mundhulen. Ved protein-analyse, inhibering af IL-6-signalering resulterede i nedsat DNMT3b og EMT-relaterede faktorer ekspression, der er forbundet med svækket STAT3 og Akt aktivering (fig. 5A-B). Desuden figur 5C viste, at faldet DNMT3b af IL-6-antistof øget DNA skader og celledød. Det foreslås derfor, at aktivering af IL-6-signalering kan være ansvarlig for den øgede DNMT3b i oral cancer.

A. DNMT3b niveau var positivt korreleret med IL-6-ekspression i humane orale cancer prøver (P 0,0001). Repræsentative lysbilleder af en udvalgt tumorprøve positivt farvning for både IL-6 og DNMT3b er vist ved x 100 og 400 forstørrelse. B. Survival end den på sygdomsudvikling fejl eller ej, positiv farvning af DNMT3b og positiv farvning for både DNMT3b og IL-6. De Kaplan Meier samlede overlevelse kurver viser, at de positive grupper blev forbundet med kortere overlevelse sammenlignet med respektive negative gruppe.

A. Effekt af IL-6 på niveauerne af DNMT3b og EMT-relaterede proteiner vurderes af immunofluorescens analyse

in vitro

og resultaterne er vist ved repræsentative dias. B. Indflydelse af blokerende IL-6 på niveauet for DNMT3b, er STAT3 /AKT aktivering og EMT-relaterede proteiner evalueret ved Western blotting-analyse. C. Virkninger af IL-6 på niveauet af DNMT3b og celledød proteiner i SCC4 og SCC25 demonstreret ved immunkemisk farvning

in vitro

. Vejviser

Diskussion

Det er blevet rapporteret, at et skifte til at akkumulere DNA hypermethylering kunne være forårsaget af overekspression af DNA methyltransferaser [15]. Epigenetisk gene silencing, fremmes af DNMTs, er blevet observeret i forskellige maligniteter, understøtter den påstand, at DNMT gener er overudtrykt i humane cancere og i cellulær transformation [24] – [26]. I den foreliggende undersøgelse, IHC of TMA objektglas viste, at niveauet af DNMT3b ekspression var højere i 76 (61%) cancer prøver end i tilstødende ikke-malign oralt epitel. Vi evalueres yderligere, hvis DNMT1 blev overudtrykt i OSCC hjælp IHC af TMA lysbilleder. Dataene viste, at kun 45 (36%) cancer prøve havde højere DNMT1 sammenlignet med tilstødende ikke-maligne epitelvæv. Identifikation, udvikling og udvælgelse af molekylære mål er vigtige i cancerterapi. De prædiktive beføjelser DNMT3b blev yderligere undersøgt med hensyn til det kliniske resultat af oral cancer. Under anvendelse univariat analyse blev forbedrede udtryk for DNMT3b signifikant associeret med en højere forekomst af lymfeknudemetastase, en højere recidiv efter behandling og kortere overlevelse. Ved hjælp af multivariat analyse, svigt sygdom og fremme ekspressionen af ​​de DNMT3b var signifikant associeret med kortere samlet overlevelse. For yderligere at undersøge, om DNMT3b var ansvarlig for aggressiv tumor vækst i OSCC, vi undertrykte DNMT3b i orale kræftceller ved hjælp af en lyddæmpning vektor. Data opnået fra cellulære eksperimenter og xenograft tumorvækst eksperimenter viste, at inhibering af DNMT3b resulterede i langsommere tumorvækst. Endvidere blev inhiberingen af ​​DNMT3b forbundet med svækket invasivitet. De molekylære og fænotypiske ændringer, der er involveret i omdannelsen af ​​en epitelcelle til en mesenchymal celletype synes at være funktionelt relevant for de invasive egenskaber ved epiteliale tumorer [21]. Det er blevet rapporteret, at EMT er associeret med OSCC progression [27], [28]. På molekylært markør niveau, er EMT kendetegnet ved et tab af E-cadherin og forøget ekspression af vimentin og invasion-relaterede faktorer. De DNMT3b dæmpende vektorer inducerede en forøgelse af E-cadherin og fald i VEGF og MMP-9 i orale cancerceller. Derudover angiogenese er en af ​​de mekanismer, der fremmer tumorprogression, og CD31-medieret endotheliale celle-celle-interaktioner er involveret i angiogenese. Ved vores data, at inhibering af DNMT3b svækket tumorvækst, ledsaget af nedsat CD31 og VEGF udtryk i tumorer. Disse resultater viste, at DNMT3b kunne mægle den aggressive tumorvækst i kræft i mundhulen, og fremme af EMT og angiogenese er en af ​​de underliggende mekanismer.

OSCC udvikling er delvist lettet af kroniske epitel irritationer og denne tumor er mere hyppige i ryger eller der forbruger overdreven alkohol beløb. IL-6, er et proinflammatorisk cytokin, som medierer kronisk inflammation og er blevet rapporteret at spille en vigtig rolle i inflammation-drevet oral carcinogenese [29], [30]. Vi har tidligere rapporteret, at aktiverede IL-6 veje kunne være ansvarlig for mere aggressiv tumorvækst bemærket i oral cancer, og høj aktiveret STAT3 og p-AKT niveau blev induceret ved IL-6 og forbinder IL-6 til tumorigenese [19]. Det er rapporteret, at IL-6-niveauer er forhøjede i denne neoplasme og IL-6 betragtes som en dårlig prognostisk faktor i oral cancer. IL-6-sekretion i oral squamous cancer fremmes af mikromiljøet, især ved stromal afledt faktor-1 [29]. Desuden har mange projekter vist, at IL-6- induceret hypermethylering og gendæmpning kan medieres af DNMTs [18], [20], [31] – [33]. Tilsammen kan de foreslåede vi, at kronisk inflammation stress i mundhulen kan fremme tumorigenese medieret af forøget IL-6 til at inducere afvigende DNA-methylering via øget DNMT3b aktivitet. I den foreliggende undersøgelse IHC data fra kliniske prøver viste, at DNMT3b ekspression blev signifikant korreleret med IL-6-farvning. Tumoren aggressivitet bemærket i IL-6 positivt OSCC kan være delvist via overekspression af DNMT3b. For at teste hypotesen, blev forholdet mellem IL-6-signalering og DNMT3b i OSCC yderligere undersøgt i nærværende undersøgelse for at se, om regulering af IL-6 signalsystemer medfører ændringer i DNMT3b udtryk. Ved forsøgene, hvor IL-6-signalering blev undertrykt af IL-6-antistof, fandt vi, at aktiverede IL-6-signalering spiller en vigtig rolle i DNMT3b aktivering forbundet med aktiveret STAT3 og PI3K i orale cancerceller. De opnåede fra denne undersøgelse afslørede, at den øgede DNMT3b induceret af IL-6, som kan være medieret af aktiveringen af ​​STAT3 og PI3K-signalering, er kritisk i tumor aggressivitet og prognose af oral cancer. Vi skitserede derfor de vigtigste signalveje, der menes at linke IL-6 og DNMT3b til kræft i mundhulen (fig. 6).

Som konklusion, betændelse og methylering er begge menes at spille nøgleroller i mundtlig tumorigenese dog inflammation-drevne effekter på methylering brug for yderligere undersøgelser i denne sygdom. Dette projekt etableret IL-6-DNMT3b aksen vil sandsynligvis være vigtigt i prognosen for OSCC. Identifikation, udvikling og udvælgelse af molekylære mål er vigtige i cancerterapi. Dataene understøtter den spirende hypotese, at IL-6-DNMT3b aksen er en væsentlig prædiktor, og målretning DNMT3b kan repræsentere en lovende behandling mod OSCC.