PLoS ONE: Co-Levering af doxorubicin og SATB1 shRNA af varmefølsom Magnetisk kationiske liposomer for mavekræft Therapy

Abstrakt

I tidligere en undersøgelse, vi havde udviklet en ny varmefølsom magnetisk levering system baseret på liposomer. Denne undersøgelse havde til formål at vurdere effektiviteten af ​​dette system til co-levering af begge lægemidler og gener til den samme celle og dens anti-tumor effekt på mavekræft. Doxorubicin (DOX) og SATB1 shRNA vektor blev fyldt i co-delivery system, og in vitro DOX varmefølsom frigørende aktivitet, målrettet gen silencing effektivitet, målrettet celleoptagelse, in vitro cytotoksicitet, samt in vivo anti-tumor-aktivitet blev bestemt. Resultaterne viste, at denne co-delivery system havde ønskelig målrettet levering effektivitet, DOX varmefølsomt frigivelse og SATB1 gendæmpning. Desuden udviste den samtidig tilvejebringes den DOX og SATB1 shRNA forøget aktivitet til at inhibere gastrisk vækst cancercellen in vitro og in vivo, sammenlignet med enkelt levering. Afslutningsvis romanen varmefølsomme magnetiske stof og gen-co-delivery system har lovende ansøgning kombineret kemoterapi og genterapi for mavekræft

Henvisning:. Peng Z, Wang C, Fang E, Lu X, Wang G, tong Q (2014) Co-Levering af doxorubicin og SATB1 shRNA af varmefølsom Magnetisk kationiske liposomer for mavekræft Therapy. PLoS ONE 9 (3): e92924. doi: 10,1371 /journal.pone.0092924

Redaktør: Elena A. Rozhkova, Argonne National Laboratory, USA

Modtaget: December 4, 2013; Accepteret: 26 februar 2014; Udgivet: Marts 27, 2014

Copyright: © 2014 Peng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.172.186). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er den fjerde almindelige kræftform og den anden hyppigste årsag til kræft død på verdensplan [1]. I 2008 var der ca. 989 tusind nye tilfælde af mavekræft og 738.000 dødsfald i verden som primært fandt sted i Øst, Syd, og Centralasien; Central- og Østeuropa; og Sydamerika [2], [3]. I Kina, mavekræft er den tredje almindelige kræftform med anslået 380.000 nye tilfælde og en højeste dødelighed omkring 26,3 pr befolkning på 100.000 hvert år [4], [5]. Kirurgisk resektion er den fælles helbredende mulighed, men det er ikke egnet til de fleste patienter, der har sent stadium af mavekræft. Andre terapier, såsom strålebehandling og kemoterapi vise nogle virkningsfuldhed, men er ofte utilfredsstillende [4], [6]. Desuden systemisk administration af kemoterapi forårsager bivirkninger [7], [8].

På grund af udviklingen af ​​lægemiddelresistens til kemoterapi, traditionel kemoterapi har også udvist begrænset antitumoreffektivitet [9]. Derfor har multi-agent co-afgivelsessystem fået mere opmærksomhed for nylig, fordi det kunne levere forskellige typer af midler til de samme tumorceller, som derefter udviser synergistiske antitumorvirkninger. For eksempel kan to forskellige kemiske midler kombineres eller et kemisk middel kan kombineres med lille interfererende RNA (siRNA) mod et onkogen. Endvidere kan den målrettede levering og kontrolleret medikamentfrigivelse yderligere styrke antitumorvirkninger og reducere bivirkninger.

Special AT-rige bindingsprotein (SATB1) er en global kromatin organisator, der regulerer genekspression og er involveret i modulering af maligne biologiske opførsler af cancer [10]. Afvigende ekspression af SATB1 har vist sig at fremme brystcancer, lungecancer og lymfom [11] – [13]. Vores tidligere undersøgelser har vist, at SATB1 spiller en vigtig rolle i gastrisk cancer og kan være en uafhængig prognose markør for mavekræft [14], [15]. Undertrykkelse udtryk for SATB1 ved at levere siRNA eller plasmid, der koder specifik forstyrrende kort harpin RNA (shRNA) mod SATB1 kunne hæmme proliferation og invasion, og fremme apoptose af tumorceller [16], [17]. Disse resultater tyder på, at SATB1 er et potentielt terapeutisk mål for mavekræft.

Vi spekulere, at kombinationen af ​​genterapi og kemoterapi i væsentlig grad kan forbedre terapeutisk effekt mod mavekræft. I vores tidligere undersøgelse, udviklede vi en målrettet varmefølsom co-delivery system baseret på varmefølsomme magnetiske kationiske liposomer (TSMCL). Ved calceinfrigivelse assay, havde vi optimeret den varmefølsomme liposomal formulering, og derefter målt magnetiske egenskaber og gen-levering effektivitet TSMCL. I denne undersøgelse anbragte vi doxorubicin og SATB1-shRNA vektor i dette system for kombinationen af ​​genterapi og kemoterapi, og vurderede deres synergistiske antitumorvirkning mod mavekræft in vitro og in vivo.

Materialer og metoder

Materialer

Kolesterol, 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC), og 3β- [N- (N ‘, N’-dimethylaminoethan) carbamoyl] cholesterol (DC-Chol) blev købt hos Avanti Polar Lipids (USA). Dimethyldioctadecylammoniumbromid (DOAB) blev opnået fra Sigma-Aldrich (USA). Magnetisk Fluid Fe

3 O

4 blev syntetiseret af Galaxy Nanotech (Kina). FAM mærket siRNA og plasmid pGFP-SATB1 shRNA blev leveret af GenePharma (Shanghai, Kina). Doxorubicin blev købt fra Hisun Pharmaceutical (Zhejiang Kina). Føtalt bovint serum (FBS), dyrkningsmedier, penicillin /streptomycin (PEST) og trypsin blev leveret fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). SATB1 kanin monoklonalt antistof var fra Epitomics (Abcam, UK). Alle andre kemikalier var af kommerciel analytisk kvalitet og anvendes uden yderligere rensning.

Udarbejdelse af co-delivery system

Dette samarbejde delivery system var baseret på varmefølsomme kationiske liposomer, der blev fremstillet med et varmefølsomt kationisk formulering af DPPC, DC-kolesterol, DOAB og Kolesterol i et molært forhold på 80:5:5:10 optimeres i vore indledende forsøg. Liposomer (TsCI) blev fremstillet ved den tynde film hydrering metode efterfulgt af ekstrudering [18]. Gradienten Fremgangsmåde ammoniumsulfat blev anvendt til at indlæse DOX i TsCI (TsCI-DOX). For at forberede magnetiske liposomer (TSMCL), magnetisk væske Fe

3 O blev brugt

4 som kernen og co-indkapslet med ammoniumsulfat buffer ind i liposomer. Efter dannelsen af ​​tynde film i den rundbundede kolbe, blev en milliliter af suspensionen af ​​jern og ammoniumsulfat tilsat til hydratisering af filmen, og derefter ekstruderet gennem polycarbonatfiltre og belastet med DOX (TSMCL-DOX) af ammoniumsulfat gradient metode . Endelig blev produkterne fra gelfiltrering centrifugeret ved 1.000 g i 15 minutter til fjernelse af ikke-indkapslet Fe

3O

4.

pGFP-SATB1-shRNA (shSATB1) vektoren blev inkuberet med forskellige liposomer i serum frie medier ved stuetemperatur i 30 minutter, for at forberede TsCI-shSATB1, TsCI-DOX-shSATB1, TSMCL-shSATB1 og TSMCL-DOX-shSATB1 henholdsvis.

Bestemmelse af zeta potentiale, partikelstørrelse og polydispersitet

den gennemsnitlige partikelstørrelse og polydispersiteten af ​​partikelstørrelsesfordelingen af ​​liposomerne blev bestemt ved 25 ° C ved dynamisk lysspredning ved anvendelse af en ZetaPALS partikel dimensionering instrument (Brookhaven Instruments Corporation, USA). Zetapotentialet af de liposomale dispersioner blev målt under anvendelse af samme instrument ved 25 ° C ved den elektroforetiske mobilitet.

Bestemmelse af doxorubicin loaded effektivitet

koncentration DOX i liposomerne blev målt med et fluorimeter ( Perkin Elmer, USA) med 485 nm excitation og 590 nm emission filtre med en fortyndingsrække af fri DOX som standard. DOX indlæst blev beregnet baseret på DOX koncentration.

differentialscanningskalometri (DSC)

DSC blev udført for at evaluere thermosensitivity af liposomer ved at bestemme faseovergangstemperaturen (Tm). Tm blev evalueret under anvendelse af en nano DSC (TA Instruments, USA) ved en opvarmningshastighed på 20 ° C /time med 20 mg /ml phospholipid.

In vitro varmefølsom DOX frigivelsesassay Salg

20 pi DOX fyldte liposomer blev inkuberet i 1 ml PBS og PBS med 50% føtalt bovint serum (FBS), som efterligner in vivo miljø separat i Eppendorf-rør. Prøverne blev opvarmet i vandbad ved 37 ° C og 42 ° C i 1 t. Derefter fluorescensintensiteten af ​​DOX blev målt i et fluorimeter (Perkin Elmer, USA) under anvendelse 485 nm excitation og 590 nm emission filtre. For 100% frigivelse blev prøver inkuberet i 1 ml PBS med 1% Triton X-100 i 1 min. procenter De DOX release blev beregnet som følger: hvor F

s var fluorescensen af ​​prøver efter opvarmning, F

0 blev den indledende fluorescens af prøver før opvarmning, og F

100 blev fluorescensen af ​​prøver behandlet med Triton X-100.

Cellekultur

Humant gastrisk adenocarcinom MKN-28 cellelinien blev fremskaffet fra keygen Biotech (Nanjing, Kina) og dyrket i høj-glucose DMEM suppleret med 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i en befugtet atmosfære af 5% CO

2 ved 37 ° C.

In vitro celle-transfektion

MKN-28-celler blev podet i 12-brønds plader ved en densitet på 4 x 10

5 celler /brønd og dyrket natten over til ca. 80% konfluens. Næste dag blev cellerne vasket to gange med forvarmet PBS, derefter TsCI-shSATB1 og TSMCL-shSATB1 blev tilsat til hver brønd og inkuberet i 6 timer. Celler inkuberet med TSMCL-shSATB1 blev placeret på 12-brønds magnetiske plade i løbet af de første 30 min for at tilbyde et magnetfelt. Dernæst blev inkubationsmediet erstattet med DMEM suppleret med 10% FBS, og cellerne blev inkuberet i 24 timer. GFP-ekspressionsniveauet blev evalueret under fluorescensmikroskop (Nikon 80i) og flowcytometer (BD FACS Canto II).

Real-time kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR)

Totalt RNA blev ekstraheret fra MKN-28 celler ved hjælp TRIzol regent (Invitrogen, Carlsbad, CA) efter fabrikantens anvisninger, blev og cDNA syntetiseret ved hjælp PrimeScript RT Master MIX (Takara, Dalian). PCR blev udført under anvendelse af SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Dalian) på en StepOne Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA). Sekvenserne for primerne var som følger: SATB1 sense 5′-ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 ‘, og antisense 5′-GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3′ GADPH sense 5’-ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 ‘, og antisense 5′-GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3’. SATB1 mRNA-niveau blev normaliseret til den for GAPDH.

Western blot-analyse

MKN-28 celler blev høstet og lyseret i RIPA buffer. Supernatanterne blev opsamlet efter centrifugering ved 10.000 g i 10 minutter. Proteinkoncentrationen af ​​supernatanten blev bestemt ved anvendelse af et BCA Protein Assay Kit. Derefter 40 ug prøver blev kørt på en 15% SDS-PAGE og proteiner blev overført til PVDF-membraner. Derefter blev membranerne inkuberet i 5% fedtfri mælk i 1 time for at blokere ikke-specifik binding og derefter inkuberet natten over ved 4 ° C med SATB1 eller β-actin-antistof (1:500 fortynding). Membranerne blev derefter probet med HRP-konjugeret gede anti-kanin sekundært antistof i 30 min. Endelig blev membranerne visualiseret med et forøget kemiluminescens-system (ECL, Pierce) og eksponeres for røntgenfilm.

In vitro evaluering af cellulær optagelse

At evaluere den intracellulære placering af leveret DOX og pGFP-SATB1 shRNA og den forøgede penetration af liposomer i mavens cancerceller ved magnetisk målrettet, en FAM-mærket siRNA (grøn fluorescens) blev anvendt til at efterligne pGFP-SATB1 shRNA, og DOX i sig selv besidder en instinkt rød fluorescens til at overvåge cellulær optagelse . MKN-28-celler blev podet i 12-brønds plade ved 4 × 10

5 celler /brønd og dyrket natten over. Derefter blev cellerne inkuberet med fri siRNA, TsCI-siRNA, TSMCL-siRNA, TsCI-DOX, TSMCL-DOX, TsCI-DOX-siRNA eller TSMCL-DOX-siRNA i 6 timer. For magnetiske liposomer blev pladerne anbragt på en 12-brønds magnetiske plade i den første time af inkubation. Cellerne blev visualiseret under fluorescensmikroskop at lokalisere de fluorescerende mærker af DOX og siRNA. Kernerne blev farvet med DAPI (blå fluorescens).

MTT assay

MKN-28-celler blev podet ved en densitet på 2 x 10

4 celler /brønd i plader med 96 brønde og dyrket natten over. Cellerne blev derefter inkuberet med forskellige liposomer ved 37 ° C i 2 timer i CO

2 incubator. For magnetiske liposomer blev pladerne anbragt under en 96-brønds magnetiske plade i de første 1 h inkubation. Næste cellerne blev vasket to gange med PBS og inkuberet i 46 timer i frisk medium. Efterfølgende blev cellelevedygtigheden målt ved MTT-assayet. Mediet i hver brønd blev erstattet af 20 pi MTT-opløsning (Sigma-Aldrich, USA) og inkuberet i 4 timer ved 37 ° C, hvorefter supernatanterne blev bortkastet, og formazankrystaller blev opløst med 200 pi DMSO. Pladerne blev målt ved 490 nm i en mikropladelæser, og cellelevedygtigheden blev beregnet efter følgende formel:

Flowcytometri

Apoptose blev detekteret ved anvendelse af et Annexin V-FITC Apoptose Detektion Kit (eBioscience, USA). MKN-28-celler blev podet i 12-brønds plader og behandles som beskrevet ovenfor. Efter 24 timer blev cellerne opsamlet, vasket to gange med PBS og suspenderet i 500 pi bindingsbuffer. Næste cellerne blev dobbelt farvet med Annexin V-FITC og propidiumiodid (PI). Celler i tidligt stadium af apoptose farvet med Annexin V-FITC, men ikke farvet med PI blev kvantificeret ved flow cytometery. Salg

xenotransplantat musemodel Salg

Fem til seks uger gamle Balb /c nøgne mus blev leveres af center for dyreforsøg i Tongji Medical College. Hver mus blev podet subkutant i den højre flanke med 5 × 10

6 MKN-28-celler. Flere uger efter tumor podning blev 36 tumorbærende mus tilfældigt opdelt i seks grupper (n = 6). Musene blev injiceret via halevenen med gratis DOX, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1, TsCI-DOX-shSATB1, TSMCL-DOX-shSATB1 eller normalt saltvand som kontrol. Dosen af ​​DOX var 2,5 mg /kg og af pGFP-SATB1 shRNA var 10 ug pr mus. Behandlingen blev givet én gang hver 3 dage og tumorstørrelse blev målt via en calipering og derefter tumor volumen kan beregnes efter følgende formel: volumen = (D

Min)

2 × D

Max /2, hvor D

Max var den længste tumor diameter og D

Min var den korteste. For TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1 og TSMCL-DOX-shSATB1, blev det magnetiske målretning opnås ved anvendelse af en fortsat ydre magnetfelt på 5000 Gauss i 30 minutter med fokus på tumoren efter lægemiddelindgivelse. Alle forsøg blev godkendt af Etisk Komité Tongji Medical College og alle dyr blev behandlet humant i overensstemmelse med Institutional Animal Care og brug Udvalg retningslinjer.

Statistik analyse

Data blev udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Den statistiske signifikans mellem forskellige grupper blev evalueret med t-test og et-faktor variansanalyse (ANOVA). For overlevelsestiden for dyrene, blev Kaplan-Meier-kurver fra hver gruppe etableret og log rank test blev udført for at sammenligne overlevelsesraten. p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater Salg

Karakterisering af liposomer

Som vist i tabel 1, er diameteren af ​​TsCI var 83,6 ± 5,7 nm, medens den af ​​TsCI. -DOX blev øget til 118,5 ± 7,9 nm på grund af indkapsling af DOX. I mellemtiden blev diametrene af TsCI-shSATB1 og TsCI-DOX-shSATB1 steg betydeligt til 161,1 ± 11,8 nm og 238,1 ± 20,6 nm, på grund af adhæsion og sammensmeltning af plasmid-DNA til liposomer. For magnetiske liposomer, de kornstørrelser på TSMCL, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1 og TSMCL-DOX-shSATB1 var 135,0 ± 11,6 nm, 157,2 ± 14,3 nm, 221,3 ± 15,7 nm og 319,4 ± 20,1 nm, betydeligt større end det af TsCI, TsCI-DOX, TsCI-shSATB1 og TsCI-DOX-shSATB1 grund af indfangning af de magnetiske nanopartikler. Endvidere størrelsen af ​​TSMCL-shSATB1 og TSMCL-DOX-shSATB1 var signifikant større end af TSMCL og TSMCL-DOX (p 0,05). Alle liposomer havde smal størrelsesfordeling, fordi deres polydispersiteter var ikke mere end 0,3.

Zeta potentialer TsCI, TsCI-DOX, TsCI-shSATB1 og TsCI-DOX-shSATB1 var 52,0 ± 7,3 mV, 50,1 ± 7,7 mV, 31,3 ± 5,2 mV og 26,7 ± 4,5 mV hhv. Efter inkubation med pGFP-SATB1- shRNA, overfladeladningerne faldt betydeligt (p 0,05), på grund af den elektrostatiske vekselvirkning mellem de kationiske lipider og plasmid-DNA. Men indfangning af magnetiske nanopartikler ikke medføre en væsentlig reduktion af Zeta potentiale i magnetiske liposomer.

For DOX indlæst effektivitet, den DOX indkapsle sats var 89 ± 3% og 78 ± 8% (n = 3) for TsCI-DOX og TSMCL-DOX, henholdsvis, og var 85 ± 7% og 73 ± 9% (n = 3) for TsCI-DOX-shSATB1 og TSMCL-DOX-shSATB1 hhv. Disse data indikerer, at interaktionen mellem liposomer og plasmid ikke resulterede i DOX lækage.

The thermosensitivity af liposomer

differentialscanningskalometri blev udført for at bestemme faseovergangstemperatur TsCI. Som vist i fig. 1, TsCI sammensat af DPPC, DC-kolesterol, DOAB og Kolesterol i et molært forhold på 80:5:5:10 havde en Tm på 40,8 ° C med en relativt bredere overgang top, som kan være fusion overgang toppen af ​​DPPC og DOAB .

In vitro varmefølsom DOX frigivelse fra liposomer

Som vist i fig. 2, DOX frigivelseshastighed fra TsCI-DOX og TSMCL-DOX var kun 12% og 16% efter inkubation med PBS ved 37 ° C, og steg til 20% og 19% efter inkubation med 50% FBS, hhv. For TsCI-DOX-shSATB1 og TSMCL-DOX-shSATB1, DOX frigivelse sats var 12% og 15% efter inkubation med PBS ved 37 ° C, og var begge 16% efter inkubation med 50% FBS, hvilket indikerer, at indarbejdelsen af ​​plasmid havde ingen signifikant virkning på stabiliteten af ​​liposomer (p 0,05).

frigivelsen af ​​DOX fra forskellige liposomer ved 37 ° C (A) og 42 ° C (B) efter inkubation med PBS eller 50% FBS. Værdierne blev udtrykt som middelværdi ± SD (n = 3).

DOX frigivelseshastighed fra TsCI-DOX og TSMCL-DOX blev øget til 37% efter inkubation med PBS ved 42 ° C, og forøget til 45% og 49% efter inkubation med 50% FBS, henholdsvis. For TsCI-DOX-shSATB1 og TSMCL-DOX-shSATB1, DOX frigivelseshastigheden var 35% og 43% efter inkubation med PBS og FBS ved 42 ° C, begge signifikant højere end den ved 37 ° C (p 0,05). Disse resultater indikerer, at TsCI-DOX, TSMCL-DOX, TsCI-DOX-shSATB1 og TSMCL-DOX-shSATB1 har ønskelig thermosensitivity, og kunne anvendes til hypertermi udløst kontrol frigivelse af DOX.

Silencing af SATB1 udtryk i MKN-28 celler transficeret med liposomer

Næste vi evaluerede effektiviteten af ​​liposomer til at levere shSATB1 vektor i MNK-28 celler. Typiske fluorescensbilleder af celler transficeret med TsCI-shSATB1 og TSMCL-shSATB1 blev vist i fig. 3A. Flowcytometri analyse viste, at transfektionseffektiviteten af ​​TsCI-shSATB1 var kun 15,4 ± 0,15%. Men efter anvendelse af magnetfeltet vejledning, transfektionseffektiviteten af ​​TSMCL-shSATB1 var 34,3 ± 0,93%, hvilket er betydeligt højere end den for TsCI-shSATB1 (fig. 3B).

(A) Fluorescerende billeddannelse af MKN -28 celler transficeret med TsCI-shSATB1 og TSMCL-shSATB1. (B) Kvantitativ analyse af transfektionseffektiviteten af ​​TsCI-shSATB1 og TSMCL-shSATB1 ved FACS. (C) Western blot-analyse af SATB1 proteinniveauet i MKN-28 celler transficeret med TsCI-shSATB1 og TSMCL-shSATB1. (D) Real-time PCR-analyse af SATB1 mRNA niveau i MKN-28 celler transficeret af TsCI-shSATB1 og TSMCL-shSATB1. Værdierne blev udtrykt som middelværdi ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. * P 0,05 sammenlignet med mock kontrol; # P. 0,05 sammenlignet med TsCI-shSATB1

For at afgøre, om den leverede shSATB1 vektor kunne mediere lyddæmpning af SATB1 udtryk i MKN-28 celler, vi udførte Real-time kvantitativ PCR og Western blot-analyse. Resultaterne viste, at både SATB1 mRNA og protein niveauer faldt i celler transficeret med TsCI-shSATB1 og TSMCL-shSATB1, sammenlignet med kontrolceller. Desuden TSMCL-shSATB1 med hjælp af magnetfeltet var mere potent end TsCI-shSATB1 at inhibere SATB1 ekspression i MKN-28-celler (fig. 3C, D).

Magnetisk målrettet in vitro cellulær optagelse

for at sammenligne de gennemføringer i cellerne mellem ikke-magnetiske og magnetiske liposomer med anvendelsen af ​​magnetiske målrettet vejledning, samt den intracellulære placering af leverede DOX og shSATB1, en FAM-mærket siRNA blev anvendt som indikator. Fraværet af grøn fluorescens i celler behandlet med gratis siRNA angivet, at den ikke kunne trænge ind i cellerne (data ikke vist). Vi observerede, at flere celler behandlet med TSMCL-siRNA udviste grøn fluorescens end celler behandlet med TsCI-siRNA (fig. 4A). Endvidere flere celler behandlet med TSMCL-DOX viste rød fluorescens end celler behandlet med TsCI-DOX (fig. 4B). I celler behandlet med TSMCL-DOX-siRNA, blev høj fluorescensintensiteten observeret, og cellerne syntes pink grund af sammenlægning af blå, rød og grøn farve (fig. 4C). Disse observationer antyder, at TSMCL er mere potent i at levere siRNA og DOX i cellerne end TsCI, efter anvendelse af magnetfeltet.

(A) Billeddannelse af celler efter behandling med TsCI-siRNA og TSMCL-siRNA. (B) afbildning af celler efter behandling med TsCI-DOX og TSMCL-DOX. (C) Imaging af celler efter behandling med TsCI-DOX-siRNA og TSMCL-DOX-siRNA. (D) Typisk detaljeret afbildning af placeringen af ​​DOX og siRNA i celler efter behandling med TSMCL-DOX-siRNA.

Derudover undersøgte vi den intracellulære placering af leverede DOX og siRNA. Rød fluorescens blev observeret i både kerner og cytoplasma, hvilket indikerer, at der leveres DOX var placeret i både kerner og cytoplasma. I modsætning hertil grøn fluorescens optrådte primært i cytoplasmaet, hvilket antyder, at siRNA’er blev leveret i cytoplasmaet (fig. 4D). Sammensmeltningen af ​​rødt og grønt optrådte gul i cytoplasmaet, og sammenlægning af blå og røde dukkede lavendel i kerner. Taget sammen indikerer disse data, at både TsCI og TSMCL kan trænge ind gastriske cancerceller og levere deres indhold ind i cytoplasmaet (DOX og siRNA) og kernerne (DOX).

In vitro antitumorvirkninger af liposomer

Vi evalueret in vitro anti-tumor virkningerne af denne co-leveringssystem ved cytotoksicitet og apoptoseinduktion aktivitet. Cytotoksiciteten af ​​liposomerne blev vurderet ved MTT-assayet. At bestemme virkningerne af DOX og plasmidkoncentrationer om cytotoksicitet af liposomer, undersøgte vi liposomer ladet med forskellige koncentrationer af DOX og forskellige mængder af SATB1 shRNA. Med forhøjelsen af ​​DOX koncentration blev cytotoksicitet af liposomer øget (fig. 5A). Men tilføjelsen af ​​SATB1 shRNA fusion ikke medføre øget cytotoksicitet, og der blev kun lidt stige af cytotoksicitet, når SATB1 shRNA koncentrationen var omkring 4 pg (fig. 5B). brugte vi således 25 uM DOX og 4 pg SATB1 shRNA at sammenligne cytotoksicitet blandt Free DOX, Gratis shRNA, TsCI, TSMCL, TsCI-DOX, TSMCL-DOX, TsCI-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TsCI-DOX-shSATB1 og TSMCL- DOX-shSATB1.

(A) cellernes levedygtighed efter behandling med liposomer ladet med forskellige koncentrationer af DOX. (B) Cellernes levedygtighed efter behandling med liposomer ladet med forskellige koncentrationer af shSATB1. (C) Cellernes levedygtighed efter behandling med liposomer som angivet. Værdierne blev udtrykt som middelværdi ± SD (n = 3). (D) Den apoptose af celler efter behandling med liposomer som angivet.

Som vist i fig. 5C, fri shRNA, TsCI og TSMCL havde ringe cytotoksicitet. Cellernes levedygtighed var 40,3 ± 3,4%, 73,6 ± 3,5% og 51,3 ± 4,5% til fri DOX, TsCI-DOX og TSMCL-DOX, henholdsvis, hvilket antyder, cytotoksicitet TSMCL-DOX var højere end TsCI-DOX, men lavere end fri DOX . Cellernes levedygtighed var 79,2 ± 6,9% og 71,6 ± 4,7% for TsCI-shSATB1 og TSMCL-shSATB1 henholdsvis viser nogen statistisk signifikans (p 0,05). For narkotika og gen-co-levering, celle levedygtighed var kun 35,0 ± 3,2% og 22,3 ± 3,4% for TsCI-DOX-shRNA og TSMCL-DOX-shRNA henholdsvis betydeligt lavere end for Free DOX, TsCI-DOX, TSMCL- DOX og SATB1shRNA fyldte liposomer (p 0,05). Desuden celle levedygtighed TSMCL-DOX-shRNA var signifikant lavere end for TsCI-DOX-shRNA (p 0,05). Disse resultater antyder, at en synergistisk cytotoksicitet virkning opnås ved samtidig tilførsel DOX og SATB1 shRNA. Desuden med anvendelsen af ​​magnetiske målrettet, kan der opnås en yderligere forbedret cytotoksicitet.

For at bestemme yderligere anti-tumor mekanisme foruden cytotoksicitet af co-delivery system, undersøgte vi apoptose på MKN-28 celler behandlet med gratis DOX, TsCI-DOX, TSMCL-DOX, TsCI-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TsCI-DOX-shSATB1 og TSMCL-DOX-shSATB1 ved flowcytometri. Som vist i fig. 5D, apoptose sats var 22,3% i celler behandlet med gratis DOX, var 8,9% i celler behandlet med TsCI-DOX, men steg til 13,4% i celler behandlet med TSMCL-DOX og magnetfelt. Tilsvarende apoptose sats var 9,4% i celler behandlet med TsCI-shSATB1, men steg til 17,4% i celler behandlet med TSMCL-shSATB1 og magnetfelt. I modsætning hertil apoptose sats var 27,7% i celler behandlet med TsCI-DOX-shSATB1, højere end i celler behandlet med TsCI lastet med DOX eller shSATB1 alene. Den apoptose sats var 32,4% i celler behandlet med TSMCL-DOX-shSATB1, den højeste blandt alle grupper. Disse resultater viser, at samtidig tilførsel DOX og SATB1 shRNA fører til kombinerede virkninger af apoptose induktion. I et ord, dette samarbejde delivery system udviser stærke anti-tumor effekt in vitro.

In vivo anti-tumor aktivitet liposomernes

For at bestemme in vivo anti-tumor aktivitet af co-delivery system, vi etableret MKN-28 murine xenograftmodeller og injiceres Gratis DOX, TSMCL-DOX, TSCML-shSATB1, TsCI-DOX-shSATB1 eller TSMCL-DOX-shSATB1 i musene gennem halevenen. Behandlingen blev givet en gang hver 3. dag, og tumorerne blev dissekeret (fig. 6A). På dag 15, tumor volumen var 0,44 ± 0,05 cm

3 i mus behandlet med TSMCL-DOX-shSATB1, betydeligt lavere end i saltvand gruppe (2,14 ± 0,23 cm

3), Gratis DOX gruppe (1,08 ± 0,13 cm

3), TSMCL-DOX-gruppen (0,68 ± 0,10 cm

3), TSCML-shSATB1 gruppe (1,43 ± 0,21 cm

3), og TsCI-DOX-shSATB1 gruppe (0,77 ± 0,12 cm

3) (fig. 6B).

(A) Typisk billeddannelse af xenotransplanteret tumor. (B) Tumorstørrelse efter behandling med gratis DOX, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1, TsCI-DOX-shSATB1 eller TSMCL- DOX-shSATB1, behandling med normalt saltvand blev anvendt som kontrol. Data blev præsenteret som gennemsnit ± SD (n = 6). (C) Overlevelseskurver af tumorbærende mus behandlet med gratis DOX, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1, TsCI-DOX-shSATB1 eller TSMCL- DOX-shSATB1, behandling med normalt saltvand blev anvendt som kontrol.

som vist i fig. 6 (C) var den mediane tid til tumor volumen at nå 2 cm

3 var 30 dage i TSMCL-DOX-shSATB1 gruppe, længere end i saltvand gruppe, Fri DOX gruppe, TSMCL-DOX gruppe, TSCML-shSATB1 gruppe og TsCI-DOX-shSATB1 gruppe (fig. 6C). Tilsammen indikerer disse resultater, at co-leverer DOX og shSATB1 af TSMCL udviser synergistisk anti-tumor effekt in vivo.

Diskussion

På trods seneste udvikling i kirurgi, strålebehandling og målrette terapi, kemoterapi er stadig en af ​​de væsentlige tilgange til gastrisk cancerterapi. Imidlertid terapeutiske virkninger af kemoterapi er ofte utilfreds og kunne ikke signifikant forbedre prognosen for kræftpatienter [19]. En af hovedårsagerne er tumorigenese og progression af mavekræft involverer en række forskellige mekanismer; enhedslegemet anti tumor mekanisme af traditionel kemoterapi har begrænset deres terapeutiske virkninger, således kombinationen af ​​kemoterapi med genterapi kan forbedre antitumorvirkninger. En anden hindring for kemoterapi er, at systemisk lægemiddeladministration fører til koncentration begrænset lægemiddel i tumorsites mens forårsager mange bivirkninger [8]. Nøglen til at løse disse problemer er afhængig af nye måder til lægemiddelafgivelse derfor udvikle målrettede multi-agents leverer system, der direkte kan styres til tumorstedet med kontrolleret frigivelse kan overvinde disse problemer og forbedre terapeutiske virkninger [20] – [25] .

Blandt forskellige lægemiddeladministrationssystemer, liposomer er mest lovende for gode biocompatibilities der forårsager lidt eller ingen antigen, allergisk, og toksiske reaktioner, og let gennemgår bionedbrydning. Da både lægemiddel- og genbærere, kan liposomer ikke kun beskytte værten mod uønskede virkninger af det indkapslede lægemiddel, men også forhindre det indesluttede indhold fra tidlig inaktivering ved fysiologisk medium [26]. Endvidere liposom er en potentielt målrettet lægemiddelafgivelsessystem, hvad enten det sker ved forøget permeabilitet og tilbageholdelse (EPR) virkning (Passive målrettet), eller ved magnetisk felt vejledning og immun forbindelse (Active målrettet) [27]. Desuden er nogle liposomer besidder kontrolleret udløst narkotika release funktioner, såsom termo følsomhed, pH-følsomhed og mikroovn følsomhed.

For nylig havde vi udviklet en ny magnetisk målrettet varmefølsom lægemiddel og gen-co-delivery system (TSMCL). Baseret på en elektroneutrale varmefølsom formulering (DPPC:Cholesterol = 80:20), havde vi tilføjet forskellige kationiske komponenter og optimeret thermosensitivity af liposomer ved calcein release assay. Resultaterne havde tilkendegivet, at vi kunne få en ønskelig thermosensitivity ved at erstatte 10 mol dele Kolesterol af 5 mol dele DC-Kolesterol og 5 mol dele DOAB (DPPC:DC-Cholesterol:DOAB:Cholesterol = 80:5:5:10), og calceinfrigivelse fra liposomerne ville være lavere ved 37 ° C, men signifikant højere ved 42 ° C i denne formulering. Dernæst Magnetisk væske Fe

3 O

4 var blevet brugt som kernen og fungerede som magnetisk målretning og opvarmning kilde TSMCL. Vibrerende Sample magnetometer (VSM) måling havde oplyst, at magnetisk væske Fe

3 O havde været

4 superparamagnetiske, således TSMCL ville have gode magnetiske målrettede effekter. I mellemtiden, den tidsafhængige varmekurve havde også vist, at både magnetiske væske Fe

3 O

4 og TSMCL kunne opvarmes fra 25 ° C til 42 ° C inden for 20 min. Med hjælp fra Magnetic væske Fe

3 O

4, både magnetisk målretning og temperatur udløste narkotika frigivelse af TSMCL kunne realiseres. Endelig havde både TsCI og TSMCL udstillet typiske liposomale morfologier og gode distributioner under TEM.