PLoS ONE: Hele reproduktive system ikke-negative Matrix Faktorisering massespektrometri Imaging af en tidlige fase kræft i æggestokkene Mouse Model

Abstrakt

High-grade serøst carcinom (HGSC) er den mest almindelige og dødbringende form for æggestokkene kræft. Alligevel er det stort set asymptomatisk i sin indledende fase. Undersøgelse af oprindelse og tidlige udvikling af denne sygdom er derfor afgørende at identificere markører for tidlig opsporing og screening. Tissue-baserede massespektrometri billeddannelse (MSI) kan anvendes som en objektiv måde at undersøge lokaliserede metaboliske ændringer mellem sunde og cancervæv direkte, i begyndelsen af ​​sygdommen. I denne undersøgelse beskriver vi MSI resultater fra

Dicer-PTEN

dobbelt-knockout (DKO) mus, en musemodel trofast gengiver den kliniske karakteren af ​​menneskets HGSC. Ved at bruge ikke-negativ matrix faktorisering (NMF) til uovervåget analyse af desorption electrospray ionisering (Desi) datasæt, væv regioner er adskilt baseret på spektral komponenter i en fordomsfri måde, med ændringer relateret til HGSC fremhævet. Resultater opnået ved at kombinere NMF med DESI-MSI afslørede flere metaboliske arter forhøjede i tumorvævet og /eller omgivende blodfyldte cyste herunder ceramider, sphingomyeliner, bilirubin, cholesterolsulfat og forskellige lysophospholipider. Flere metabolitter identificeres inden den billeddannende undersøgelse blev også påvist ved ændrede niveauer inden serum i en tidligere metabolomiske undersøgelse af samme musemodel. Som et eksempel workflow, funktioner identificeret i denne undersøgelse blev brugt til at bygge en oPLS-DA-model er i stand til at skelne mellem DKO mus med debuterende tumorer og kontrol med op til 88% nøjagtighed

Henvisning:. Paine MRL, Kim J, Bennett RV, Parry RM, Gaul DA, Wang MD, et al. (2016) Hele reproduktive system ikke-negative Matrix Faktorisering massespektrometri Imaging af en tidlige fase kræft i æggestokkene Mouse Model. PLoS ONE 11 (5): e0154837. doi: 10,1371 /journal.pone.0154837

Redaktør: Shengtao Zhou, West China Second Hospital, Sichuan University, KINA

Modtaget: December 28, 2015; Accepteret: 20. april, 2016 Udgivet: 9. maj 2016

Copyright: © 2016 Paine et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle billedbehandling datafiler er tilgængelige fra figshare databasen (https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.3171715.v1)

Finansiering:. æggestokkene Cancer Research Fund (oCRF) Program Projektudvikling tilskud ( http: //http: //www.ocrf.org) og en Challenge Grant fra Marsha Rivkin Foundation (http: //http: //www.marsharivkin.org). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

High-grade serøst carcinom (HGSC), en undertype af kræft i æggestokkene også kendt som high-grade serøs kræft i æggestokkene, er ansvarlig for 70% af alle æggestokkene kræftdødsfald og alligevel oprindelse og tidlig progression af denne dødelige sygdom stadig dårligt forstået. [1-4] Pålidelige screeningstest i klinisk praksis er ikke tilgængelig i øjeblikket, og det asymptomatisk kurs gennem tidlige stadier af sygdommen gør tidlig påvisning af HGSC yderst vanskeligt. Derfor fleste HGSC tilfælde ( 95%), og i forlængelse størstedelen af ​​æggestokkene kræfttilfælde, er diagnosticeret ved fremskredne stadier, der fører til dårlige 5-års overlevelsesraten-ca 44,6% for alle tilfælde diagnosticeret i løbet af 2004-2010 [1. , 5-7] Men når kræften er diagnosticeret tidligt og er begrænset til det primære tumor site, de fem-års overlevelse stiger til over 90%. [8] det er derfor bydende nødvendigt, at tidlig påvisning metoder er udviklet til at bekæmpe æggestokkene kræft dødelighed.

identifikation af biokemiske forandringer i væv fra tidligt-til sene HGSC kunne give et middel til at vælge markører, der kan overvåges i blod eller urin for tidlig opsporing og diagnose. En stor udfordring er forbundet med denne fremgangsmåde, er imidlertid svært ved at finde patienter med tidlig-fase ovariecancer, som tidlige stadier er asymptomatiske. Nylige musemodeller af kræft i æggestokkene, med HGSC oprindelse i æggelederen eller æggestok, udgør en enestående mulighed for at overvinde denne udfordring. [9-11] Når to kritiske gener er betinget deaktiveret (

Dicer

flox /flox

PTEN

flox /flox

Amhr2

cre /+), disse dobbelt-knockout (DKO) mus udvikler fallopian rør-stammer HGSCs, som derefter spredes til æggestok før metastaserende hele bughulen, der forårsager ascites og fører til døden. [9] Alternativt dobbelt-mutant mus, der bærer mutant p53 og

PTEN

sletning producere ovarie-stammer HGSCs samt ikke-HGSCs i æggestokkene med normale æggeledere. [10] Desuden triple-mutant mus, (

p53

LSL-R172H /+

Dicer

flox /flox

PTEN

flox /flox

Amhr2

cre /+), der omfatter mutant p53, den hyppigst forekommende mutationer i humane HGSC (~ 97%), også udvikle æggeleder-stammer HGSC med identisk mønster af metastaser som DKO mus. Selvom både DKO og TKO modeller duplikere lige godt den kliniske karakter af human HGSC har DKO modellen også blevet karakteriseret på molekylært niveau, med DKO HGSC udviser molekylær lighed med human HGSC. Derfor i denne undersøgelse DKO mus blev udvalgt til yderligere undersøgelse under anvendelse af masse-spektrometri-baserede imaging analyser.

I massespektrometri billeddannelse (MSI), er massespektre optaget ved diskrete rumlige punkter hen over vævsprøven, hvilket fører til en datacube med et massespektrum for hver (x, y) pixel. To-dimensionelle falske farver, der kort den rumlige fordeling af specifikke analytter er skabt ud fra disse data. [12] To veletablerede MSI metoder der er blevet anvendt til kræft undersøgelser er matrix-assisteret laser desorption /ionisering (MALDI), [ ,,,0],13-18] og desorption elektrosprayionisering (DESI). [19-25] Specifikt for kræft i æggestokkene, flere MALDI MSI undersøgelser er blevet offentliggjort med fokus på både protein og peptid biomarkør identifikation. [26-29] Kun en rapport fra Liu et al har undersøgt den potentielle rolle af metabolitter ved hjælp MSI. [30] i denne undersøgelse blev MALDI eksperimenter instrueret af transkriptom analyse og fokuserede specifikt på påvisning af sulfatider, en underklasse af glycosphingolipider. DESI MSI, derimod, er kun blevet anvendt til studiet af ændringerne molekylær niveau observeres mellem præ- og post-ovulation, men ikke til tidlig cancer biomarkør opdagelse. [31]

I betragtning af den enorme mængde kemiske oplysninger genereres i MSI, udtrække de mest biologisk relevante oplysninger vedrørende en specifik faktor kan ikke være ligetil, kræver visuel inspektion og sammenligning af hundreder til selv tusindvis af billeder for hvert forsøg. For at forenkle MSI dataanalyse, sammenligning af spektre fra flere regioner eller flere prøver er muligt ved hjælp region af interesse (ROI) udvælgelse. [32] ROI sammenligninger er ligetil, gennemsnit spektre opnået ved hver pixel fra et udvalgt område, og er bedst velegnet til analyser, hvor histologiske grænser er veldefinerede. Men i de tilfælde, hvor histologiske grænser er mindre klar, eller når ny biologisk hypotese bliver genereret, kan manuelt definere ROI os være udfordrende. I undersøgelsen af ​​sygdomsprogression i store vævssnit, fx kemiske markører kan tyndt fordelt, og ved lave mængderne, hvilket gør deres opdagelse ved valg ROI vanskelig.

Semi-overvågede metoder anvender klyngedannelse algoritmer, automatisk tildele segmentering kort efter mønstre af co-lokaliserede molekyler kan anvendes i sådanne scenarier. Disse fremgangsmåder stadig opdele dataene i diskrete rumlige segmenter og kræver, at brugeren inspicere mange individuelle ion billeder for at bekræfte de matcher med den tilsvarende segment. [33] uden opsyn metoder baseret på statistiske algoritmer foretrækkes derfor for data mining af store, heterogene vævsprøver, der kræver minimal menneskelig indgriben. [34, 35] Sådanne algoritmer er blevet undersøgt til analyse af MSI datasæt, herunder Principal Component Analysis (PCA) [36], Maximum Autokorrelation Faktorisering [37], K-Midler [38] og Fuzzy C -Means [39] klyngedannelse, Probabilistic Latent Semantisk Analyse [40], og ikke-negative Matrix Faktorisering (NMF) [41]. Sammenligning af Pearson korrelation af output komponentbilleder mod ægte prøve billeder viste, at af alle disse metoder, NMF havde den højeste gennemsnitlige billedet korrelation. [35] Også på grund af den indbyggede ikke-negativitet begrænsninger, er NMF komponentbilleder let fortolket og bedre egnet til massespektrometriske data end andre multivariate statistiske metoder, såsom PSA. [42, 43]

Heri følger vi op på vores serum metabolomics undersøgelse af

Dicer-PTEN

DKO mus med en DESI MSI undersøgelse af det komplette reproduktive system af samme musemodel. [44] DESI MSI multivariat dataanalyse blev udført med en ny version af omniSpect [45], der nu kan håndtere større (~ TB) MSI datasæt. Ved at adskille MSI data i flere NMF komponenter via omniSpect blev funktioner repræsenterer metabolomiske ændringer mellem sund og kræft væv let visualiseres. Den tilsvarende NMF “komponent spektre” beskriver disse billeder blev derefter undersøgt, identificere kemiske stoffer ændret i HGSC tumor mikromiljø, hvoraf flere havde også været tidligere påvist ved serum-niveau. [44]

Materialer og metoder

Dicer-PTEN Dobbelt-Knockout (Dicer-PTEN DKO) Mus

Dicer-PTEN

DKO (

Dicer

flox /flox

PTEN

flox /flox

Amhr2

CRE /+) mus blev genereret ved parring hanner (

Dicer

flox /flox

PTEN

flox /flox

Amhr2

cre /+) med kvinder (

Dicer

flox /flox

PTEN

flox /FLOX). Female

Dicer

flox /flox

PTEN

flox /flox (en genotype ikke bærer

Amhr2

cre /+) mus blev anvendt som kontroller. Alle mus blev opnået fra in-house avl ved Baylor College of Medicine og blev huset i et vivarium med en kontrolleret temperatur på 21 ° C. De blev fodret 5053 bestrålet PicoLab gnaver Diet 20 og havde adgang til drikkevand leveres i flasker.

Dicer

flox /flox

PTEN

flox /flox

Amhr2

cre /+ DKO mus anvendt i denne undersøgelse udvikle ascites som tumorer metastaserer . Når mus begyndt at vise tegn på ascites, blev de overvåget dagligt. Mus blev anbefalet til eutanasi når ascites volumen op på 10% af dyrets legemsvægt. Alle mus anvendt i denne undersøgelse (10 i alt) blev ofret, før de når grænsen for eutanasi via en overdosis indånding af kuldioxid til at undgå unødig smerte og lidelse i overensstemmelse med dyret protokollen (AN716) godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved Baylor College of Medicine.

Prøveforberedelse

hele reproduktive system af DKO mus (herunder livmoder, æggeledere og æggestokke) blev skåret ud og flash nedfrosset ved -80 ° C. Det intakte udskårne væv blev indlejret i en vandig opløsning af gelatine (10% vægt /volumen) og carboxymethylcellulose (5% vægt /volumen) og frosset ved -80 ° C. Indlejrede vævsblokke blev anbragt i kammeret i en Cryostar NX70 kryostat (Thermo Scientific Inc., San Jose, CA, USA) i 30 minutter og derefter sektioneret ved 20 um tykkelse med både skæreblokken og prøveblok holdt ved -20 ° C . Vævssnit blev tø monteret på Superfrost Plus Micro Slides (VWR International LLC., Radnor, PA, USA) og holdt ved -80 ° C indtil analyse.

desorption elektrosprayionisering-massespektrometri Imaging

DESI-MS-billeder blev erhvervet ved hjælp af en specialbygget ion kilde bestående af en Omni Spray DESI sprøjte (Prosolia Inc., Indianapolis, IN) i stand til finjusteringer ved hjælp af manuelle trin og multi-akse platforme (Thorlabs, Inc., Newton, NJ). Følgende DESI-MS geometriske og eksperimentelle variabler blev optimeret til billeddannelse eksperiment: højde af sprøjten-tip ovenfor overflade (5 mm), indfaldsvinklen (55 °), sprøjte-tip afstand fra MS indløb (15 mm), indløb højde over overflade ( 1 mm), spray opløsningsmiddel (methanol), opløsningsmiddel strømningshastighed (5 pi min

-1), forstøvning gas (nitrogen), forstøvning gastryk (100 psi), og spray spænding (-5 kV) . Massespektrometret indløb anvendte var specielt designet til DESI-MS billedbehandling og stikker 18 cm fra forsiden af ​​instrumentet, som giver adgang til større prøve overflader.

Mens DESI sprøjte og MS indløb blev holdt stationær, prøven skal afbildes blev flyttet i en “kam” -formet pathway, hvilket tillader DESI sprøjten to raster hele prøven overfladen i 2 dimensioner under anvendelse af en OPTISCAN II motoriseret mikroskop etape (Prior Scientific Inc., Rockland, MA) kontrolleret af en LabVIEW VI program . tidligere beskrevet [19, 45] blev scenen hastighed sat til 160 um s

-1 i

x

-dimension med en linje trin på 200 um i

y

– dimension. Negativ-ion massespektre blev opnået på en Exactive Plus Orbitrap massespektrometer (Thermo Scientific, San Jose, CA) i intervallet

m /z

400-1000 i tyngdepunkt tilstand efter at optimere følgende eksperimentelle variabler: masse opløsning (17.500 på

m /z

200), automatisk target gain kontrol (1e

6 ioner), microscans pr scanning (2), s-linse spænding (75 V), maksimal injektion tid (100 ms), og kapillær temperatur (250 ° C).

data Processing

MS imaging datafil som en enkelt, kontinuerlig erhvervelse, sammen med Labview tid og output position filer blev uploadet til omniSpect webbaseret server (https://cs.appstate.edu/omnispect).[45] fra Labview-genererede fase position og timing information, omniSpect skaber et billede terning linje for linje ved hjælp massespektre indsamlet på den første passerer langs kam-formet bane. De oprindelige masse spektre er lineært interpoleret på en gitter med regelmæssige mellemrum langs x-aksen. [46]

For indsamlet spektre, omniSpect først estimerer en fuld profil med en fælles logaritmisk fordelte

m /z

skala for alle scanninger og anvende en lille Gauss vindue omkring hver top. Vi brugte en standardafvigelse på

m /z

0,001 og en bin-bredde

m /

z 0,0005 ved

m /z

850 for disse data. Generelt reducerer bin bredde gør det muligt for Gauss center for mere præcist at repræsentere tyngdepunkt peak datacenter (

jeg

.

e

., Den eksperimentelle

m /z

værdi) med omgivende placeringer bliver fyldt til at rumme masseskift løbet af eksperimentet. Standardafvigelsen svarer derfor til tolereret varians af denne masse skift og repræsenterer det forventede højdepunkt bredde, hvis data blev indsamlet i profil tilstand. Præcisionen for centroided data kan konfigureres i den nyeste version af omniSpect (https://cs.appstate.edu/omnispect/) med tre forudindstillede indstillinger:

m /z

± 0,1, 0,01, og 0,001. Ved den højeste præcision, denne tilgang skaber datakuber med meget store dimensioner, men meget sparsomme data. For eksempel, typisk mus MSI data produceret et billede terning af størrelse [805 × 59 × 2.556.741], som ville kræve 904 GB, hvis opbevaret som dobbelt præcision værdier. Fordi kun 0,06% af elementerne er nul ved hjælp af en sparsomme matrix repræsentation resultater i filer, der kræver mindre end 2 GB hukommelse.

I betragtning en MSI datakube, NMF modeller hver komponent spektrum som den ikke-negative linearkombination af kilden spektre og hver komponent ion billede som den ikke-negative linearkombination af kildebillederne. For eksempel kan kilde spektre i en given vævsprøve vedrører forskellige ioner, kombinationer eller “komponenter”, der produceres ved forskellige vævstyper, visible men eventuelt korrelerede rumlige distributioner. NMF genindvinder ikke-negative komponent spektre og rumlige distributioner ved at minimere forskellen mellem den modellerede og de observerede data.

Først 3-D datakube omdannes til en 2-D matrix ved vectorizing de pixelkoordinaterne i en enkelt dimension. Brugeren vælger antallet af komponenter til at udtrække og NMF anslår dem. Blandt de mange algoritmer til NMF bruger vi Alternating Least Squares (ALS) tilgang til minimering af Frobenius norm [47]: hvor V betegner datamatrixen, W betegner de komponentbilleder, og H betegner komponenten massespektre. Hver søjle af W og tilsvarende række af H repræsenterer den rumlige fordeling og massespektre fra en komponent, henholdsvis. Deres produkt, WH, repræsenterer den lineære kombination af komponenter, der tilnærmer dataene. Algoritmen begynder ved at initialisere H med positive værdier. Så det løser for W, der minimerer

D

til fast H ved hjælp af mindste kvadraters løsning: hvor # repræsenterer Moore-Penrose pseudoinverse. Negative værdier i W erstattes med nuller og processen gentages for H. Specifikt

D

minimeres til den nye værdi af W:

Igen negative værdier erstattes med nuller, og processen gentages, vekslende mellem W og H indtil konvergens. Efter estimering, er komponentbilleder repræsenteret som to-dimensionelle falsk-farve plots og den relative forekomst af ioner i spektre er normaliseret til basen-peak i sæt af NMF komponenter. [47]

Data Analysis

masse spektrale funktioner fra den fjerde NMF komponenten blev krydsreferencer med udtrukket og kurateret liste over spektrale egenskaber opnået efter UPLC-MS-analyse af serum fra 14 tidlige fase tumor (ET) DKO mus og 11 kontroller. [ ,,,0],44] UPLC-MS spektrale funktioner blev udvundet fra data ved hjælp MZmine 2.0 software [48] og involverede kromatogram tilpasning, peak identifikation og integration, peak område udvinding, og normalisering efter kuratering af de data matrix. Datasikring af data bestod af fjernelse af signaler, der var til stede i de blindprøver, opløsningsmidlet eller var til stede i mindst 50% af serumprøverne. Masse spektrale funktioner overlapper mellem den valgte NMF komponent og den kurateret UPLC-MS liste blev brugt til at bygge en model for prøve klasse diskrimination via ortogonale partielle mindste kvadrater diskriminant analyse (oPLS-DA) ved hjælp af MATLAB (MATLAB-version 7.13.0, The MathWorks, Natick, MA med PLS_Toolbox v.6.71, egenvektor Research, Wenatchee, WA).

Resultater

Fire

Dicer-PTEN

DKO mus i en alder af 8 måneder blev aflivet og intakte kønsorganer blev opsamlet. En mus viste en stor primær tumor med en blodfyldt cyste i slutningen af ​​en uterin horn og en sund æggestok med en præ- eller ikke-kræft cyste ved den anden uterine horn (fig 1A). Denne prøve blev udvalgt til MSI-analyse, som det blev hypotese, at ved billeddannelse sund æggestok, før eller ikke-kræft cyste, og moden tumor sammen, kunne direkte spektrale der foretages sammenligninger mellem de forskellige væv regioner. Afvigende spektralkomponenter detekteret, især dem lokaliseret i tumoren /cyste region, kan derefter karakteriseres og vurderes for deres biologiske rolle eller som potentielle markører for sygdommen.

(a) Fotografi af en tynd vævssnit af en DKO mus reproduktive system tø-monteret på en glasplade. (B) Et enkelt komponent NMF billede repræsenterer tilstand data DESI-MS negativ-ion for DKO musen reproduktive system og (c) den tilsvarende NMF spektrum. (D) Det samlede ionstrøm (TIC) billede for data de DESI-MS negativ-ion-mode og (e) den tilsvarende TIC spektrum.

En negativ-ion-mode DESI-MS billede blev taget fra en 20 um tyk sektion af den samlede reproduktive system udskåret fra den førnævnte DKO musen. Figur 1 viser et optisk billede af vævsprøve sammen med falske farver og tilsvarende spektre for både den samlede ion chronogram (TIC) og single-komponent NMF resultat. Sammenligning af både billeder og spektre illustrerer, hvor tæt ALS algoritme kan tilnærme data terning faktorer, og derfor hvor godt NMF resultater repræsenterer de sande data. Billederne vist i fig 1B og 1D ligner hinanden, men ikke er identiske, da NMF tilnærmer hver spektrum i billedet som en skaleret version af en komponent spektrum. Regioner i NMF Komponentbillederne, der ikke passer til TIC billede indikerer disse regioner har spektre, der adskiller sig fra TIC spektret. For eksempel, tumor /cyste region til højre viser en højere intensitet på falske farver skala i TIC billedet, men den gennemsnitlige spektrum for denne region er ikke modelleret godt af den “gennemsnitlige” frekvenser til hele billedet. Derfor, ved sammenligning, er tumor /cyste region repræsenteret med lavere relativ intensitet på falske farver skala i single-komponent NMF billede. Imidlertid spektrene i fig 1C og 1E er næsten identiske med peak lister og relative mængder konserverede. Gradvis segmentering data i to eller flere komponenter, der bruger NMF kunne derfor give meningsfulde resultater med hensyn biologiske forskelle relateret til sygdomsprogression ved at afsløre disse spektrale forskelle. Bestemmelse af optimale antal NMF komponenter for at modellere ægte biologisk varians mens afvise uønsket støj, teknisk variation, og artefakter er således central for forståelsen af ​​niveauet af nyttige oplysninger i disse data.

Fig 2A og 2C show resultaterne fra opdele dataterningen i to NMF komponenter. Billedet i figur 2A ligner den i fig 1B med basen top ved

m /z

885,5436 dominerer tilsvarende spektre for begge billeder. Den nøjagtige masse af denne top tyder det svarer til [MH]

– ion af en phosphatidylinositol (PI) med 38 i alt kul og 4 af total dobbeltbindinger i acylkæderne (Theo [MH]

-;.

m /z

885,5499). Denne lipid art er en af ​​de mest udbredte sure lipidtyper stede i mammale cellemembraner og rutinemæssigt detekteret ved udførelse MSI af mammale væv. [49] Den mest bemærkelsesværdige forskel mellem fig 2A og 1B er den reducerede signalintensitet i fig 2A i tumor /cyste region. Fig 2C viser den anden NMF komponent og afslører en stærk kontrast til den første NMF komponent, med forøgede signalintensiteter i tumoren /cyste region og faldt intensiteter i det sunde æggestok region. Fig 2D repræsenterer den tilsvarende spektrum for billedet i fig 2C, afslører de arter, der bidrager til den forøgede signalintensitet i tumoren /cyste region. Tre store arter blev observeret i figur 2D på

m /z

572,483, 682,589 og 684,595. For de arter på

m /z

572,483 og 684,595, blev en M + 2 top observeret ved en relativ forekomst forhold på 3: 1, hvilket tyder på tilstedeværelse af et chloratom inden for hver art. For

m /z

682,589, M + 2-signalet overlapper de arter på

m /z

684,595. De arter på

m /z

684,595 har en relativ overflod meget højere end forventet for

37Cl isotop af

m /z

682,589. Derfor er ioner ved

m /z

684,595 tilskrives en separat kemiske arter med mulige bidrag fra en

37Cl isotop. Interessant nok blev disse tre ioner også påvist i en undersøgelse, der undersøgte cellulære lipidekstrakter fra murine tumorcellelinier af ESI-MS og blev identificeret som den [M + Cl]

– ioner af C16, C24: 1 og C24: 0 ceramider (Theo.

m /z

572,4815,

m /z

682,5911, og

m /z

684,6067, henholdsvis). [50] Elevation af disse tre metabolitter er blevet rapporteret at være involveret i tumor-induceret dendritiske celle apoptose ved at nedregulere phosphoinositid-3-kinase (PI3K) pathway. [50] ved frigørelse disse immunsuppressive signaling forbindelser, tumoren skaber et gunstigt mikromiljø hvorved det kan unddrage værtens immunrespons og formere sig. [51]

de resulterende NMF komponentbilleder (a) og (c), og tilsvarende spektre (b) og (d) fra opdele DESI-MS negativ-ion dataopsamling i to NMF komponenter. (E) TIC billede fra samme datasæt viser regionen af ​​interesse (ROI) manuelt udvalgt til tidlige fase tumor og blodfyldte cyster områder (rød oval) og (f) den tilsvarende gennemsnit spektret fra investeringsafkast. (G) Den TIC billede, der viser området af interesse (ROI) udvalgt til tidlige fase tumor websted kun (rød oval) og (f) den tilsvarende gennemsnit spektret fra ROI.

region af interesse (ROI) spektre fra den kombinerede tidlige fase tumor og blod-fyldte cyste region (fig 2E) og den tidlige tumor af sig selv (fig 2G), blev udvundet fra de data, terning ved hjælp af en Matlab script til sammenligning til den tilsvarende NMF Komponentbillederne. Ved manuelt at vælge et ROI for et specifikt væv region, er en midlet spektrum genereres fra spektre for hver pixel i den valgte region. Den anden NMF komponent spektrum (fig 2D) og ROI-spektrum (fig 2F) deler en høj grad af lighed, med alle de store ioner detekteres i ROI-spektret også til stede i NMF komponent spektrum, omend med små forskelle i relative mængder . De store forskelle observeret mellem figur 2D og 2F opstå på grund af NMF lægge større vægt på kombinationer af arter påvist med højere grader af variation fra andre områder af billedet. For at bekræfte, at de store toppe identificeret i figur 2D og 2F faktisk er til stede i tumoren region og er ikke blot forbundet med de biologiske forskelle mellem blod og fast væv, en ROI spektrum af den tidlige fase tumor uden blod-fyldte cyste er vist i fig 2H. Den tilsvarende ROI spektret indeholder alle tilstedeværende toppe over 5% relativ overflod i fig 2D. Men i fig 2H de samme toppe er til stede ved meget lavere relative mængder på grund af de meget rigelige membran lipider,

jeg

e

, PI.. (38: 4) ved

m /z

885,54. Metoden ROI giver en mere nøjagtig gengivelse af de alle arter i det valgte område; dog kan NMF isolere arter, der skelner mellem regioner, potentielt medvirken i opdagelsen af ​​arter med relativt lave forekomster, der måtte blive ændret. Denne egenskab er afgørende i forsøget på at identificere sygdomsprogression gennem væv uden overvåget bruger indgreb for at definere grænserne mellem sygt og sundt væv.

Opdeling af datasættet i tre, fire og fem NMF komponenter (S1 og S2 Figner, og fig 3, henholdsvis) gradvis udskiller de signaler, der tydeligt forbundet med tumoren /cyste region fra resten af ​​det sunde væv. Der viser sig her et billede primært repræsenterer sund æggestok, et eller flere billeder (afhængigt af antallet af komponenter valgt) udviser forskellige ion distributioner hele livmoderen og sund æggestok, og et billede, der viser forhøjede arter i tumoren /cyste region. Spektrene svarer til den sunde æggestok komponent billede (fig 3C), der fungerer som vores pseudo-kontrolprøve til dette eksperiment er domineret af ion ved

m /z

885,5436 med alle andre ioner iagttaget ved en relativ overflod af 5% eller mindre. Den gradvise NMF faktorisering af signalerne, der bidrager til livmoderen (Fig 3A, 3E og 3I) viser en lavere relativ overflod af ion ved

m /z

885,5436 end fig 3C. Desuden er en større relative bidrag fra andre ioner i disse spektre observeret, især i lipid region mellem

m /z

600-1000 fra potentielle phosphatidylethanolaminer (PE;

m /z

716.5247, 722,5070, 746,5053, 766,5324, og 794.5395), phosphatidylseriner (PS;

m /z

788,5369, 810,5229, 834,5229), phosphatidylglyceroler (PG;

m /z

747,5108) og phosphatidylinositoler (PI;

m /z

833,5120, 857,5111, 909,5489). [49]

af de fem NMF komponentbilleder, fig 3A udviser den højeste intensitet i tumoren region. Men Fig 3A viser, også en forholdsvis høj korrelation til NMF komponent spektre (Fig 3B) i hele flertallet af vævssnittet. Selv toppene i Fig 3B er forhøjede i tumoren regionen, er de ikke nødvendigvis ideel biomarkører til at skelne mellem tumor og sundt væv. Dette understøttes af de fleste toppe identificeret i fig 3B er fælles mammale celle membranlipider, som vides at være forhøjet på grund af en forøget lipidsyntese i cancervæv. [52] Tværtimod Fig 3G viser en langt større relativ forskellen mellem tumor /cyste region og resten af ​​vævssnittet. Det er korrekt, at de højeste intensiteter og de fleste af de mest intense pixels observeres i cyste men der er stadig et betydeligt antal pixels med forhøjede intensiteter i tumoren region. Som komponenten billede i figur 3G næsten udelukkende viser tumor /cyste region med minimale bidrag fra andre væv områder, bør denne komponent være meget repræsentativ for metaboliske ændringer inden for tumor mikromiljø. De tre resterende NMF komponenter beskriver formentlig ikke-kræft områder af væv (

jeg

.

e

., Sund æggestok og størstedelen af ​​livmoderen). Derfor forventes komponenten billede i fig 3G til at indeholde minimale bidrag fra kemiske arter ikke specifikke for cancerbiologi, med den tilsvarende spektrum er vist i fig 3H.

Udførelsen af ​​NMF som en ikke-overvåget segmentering algoritme anvendt på MSI data blev vurderet ved sammenligning med en mere typisk clustering algoritme, såsom K-Means clustering. K-Midler resultater fra segmentere MSI datasæt i

k

= 5 klynger er vist i S3 Fig. Fire af de fem k-middelværdier klynger var rumligt og spektralt meget lig de NMF resultater observeret i figur 3, med blodfyldte cyste, sund æggestok, og resterende væv alle segmenteret i adskilte klynger. For K-Midler analyse, en af ​​klyngerne indeholdt store bidrag fra den kemiske baggrundssignalet og derfor klynge korreleret rumligt med regionen uden for den biologiske væv. Segmentering af denne baggrund region blev ikke observeret inden for de NMF resultater, i stedet livmoderen blev separeret i tre segmenter (sammenlignet med to med K-means gruppering). Det er indlysende, NMF er mere egnet til MSI dataanalyse som NMF giver graden af ​​korrelation af hver pixel til den spektrale tilnærmelse fastsat for hver komponent, hvorimod K-Midler kun giver en binær indikation for hver pixel optagelse til den specifikke klynge. Således NMF billeder giver et mere informativt deskriptor for MSI data end K-Midler klyngedannelse.

For at illustrere den selektive magt NMF, ioner detekteres i tumor spektrum ved en overflod af ≥ 5% i forhold til basen peak er