PLoS ONE: Fatty Acid amid hydrolase i prostatakræft: Forening med Disease Severity og Outcome, CB1 receptor Expression og forordning ved IL-4

Abstrakt

Baggrund

De seneste data har vist, at der kan være en dysregulering af endocannabinoide metabolisme i kræft. Her har vi undersøgt ekspressionen af ​​endocannabinoide metaboliserende enzym fedtsyreamid hydrolase (FAAH) i en velkarakteriseret væv microarray fra patienter diagnosticeret med prostatacancer ved transuretral resektion for at tømme problemer.

Metodologi /vigtigste resultater

FAAH immunreaktivitet (FAAH-IR) blev vurderet i formalin-fikserede paraffin-indlejrede ikke-maligne og tumor kerner fra 412 patienter med prostatakræft. CB

1 receptor immunoreaktivitet (CB

1IR) scoringer var tilgængelige for dette datasæt. FAAH-IR blev set i epitelceller og blodkarvæggene men ikke i stroma. Tumor epitel FAAH-IR var positivt korreleret med sygdommens sværhedsgrad ved diagnose (Gleason score, tumor stadie,% af prøven, der indeholdt tumor) for tilfælde med mellemklassen CB

1IR scoringer, men ikke for dem med høj CB

1IR scoringer. For de 281 tilfælde, der kun modtog palliativ terapi ved slutningen stadier af sygdommen, blev en høj tumor epithelial FAAH-IR forbundet med en dårlig sygdomsspecifik overlevelse. Multivariate Cox proportionel-farer regressionsanalyser viste, at FAAH-IR gav yderligere prognostisk information, der ydes af CB

1IR når en midrange, men ikke en høj CB

1IR cutoff værdi blev anvendt. Interleukin-4 (IL-4) receptor IR blev fundet på tumor epitelceller og inkubering af prostatakræft PC-3 og R3327 AT1 celler med IL-4 øget deres FAAH aktivitet.

Konklusioner /Betydning

Tumor epitel FAAH-IR er forbundet med prostatakræft sværhedsgrad og resultat på mid-range, men ikke høj, CB

1IR scoringer. Korrelationen med CB

1IR i tumorvævet kan være relateret til en fælles lokal dysregulering af en komponent i tumormikromiljøet

Henvisning:. Thors L, Bergh A, Persson E, Hammarsten P, Stattin P , Egevad L, et al. (2010) Fatty Acid amid hydrolase i prostatakræft: Forening med Disease Severity og Outcome, CB

1 receptor ekspression og forordning ved IL-4. PLoS ONE 5 (8): e12275. doi: 10,1371 /journal.pone.0012275

Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, USA

Modtaget: April 26, 2010; Accepteret: 27 Jul 2010; Udgivet: 19 August, 2010

Copyright: © 2010 Thors et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne takke det svenske Science Council (Grant nr 12158, medicin, CJ Fowler.); den svenske Cancer Society (Grant ingen CAN 2007/712, Anders Bergh.); Lions Fund Cancer Research ved Umeå Universitet /Cancer Research Fund Norrland og forskningsmidler i det medicinske fakultet, Umeå Universitet (C.J. Fowler) om økonomisk støtte. Finansieringen kilde til antistoffet (til Dr. Mackie) var bevilge NIH DA11322. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den hyppigste kræftform hos mænd. Ifølge det amerikanske National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/cancertopics/types/prostate), at antallet af nye tilfælde af prostatakræft i USA i 2009 var 192.280, og antallet af dødsfald som følge af den sygdom var 27.360. Behandlingsmuligheder spænder fra den forventede til prostatektomi, hormonbehandling og stråling afhængigt af naturen af ​​canceren.

I de senere år har beviser akkumuleret for, at den endocannabinoide system, der omfatter cannabinoid CB

1 og CB

2-receptorer, deres endogene ligander anandamid og 2-arachidonoylglycerol, og deres syntetiske og nedbrydende enzymer, spiller en rolle i patogenesen og eventuel behandling af cancertyper, herunder prostatacancer (for nylige oversigter, se [1] – [3 ]). Således kan for eksempel, cannabinoider producere en CB-receptor-medieret apoptose i gliomceller som følge af en vedvarende produktion af ceramid [4] og flere papirer har rapporteret både CB receptor-afhængige og -uafhængige virkninger af cannabinoider upon levedygtighed, mobilitet og invasivitet af både androgen-følsomme og ufølsomme prostatakræft-cellelinier [5] – [11]

In vitro

, en lokal endocannabinoide tone er en vigtig faktor at styre malignitet af prostata kræftceller. . Således modulering af niveauerne af endocannabinoids, ved anvendelse af inhibitorer af endocannabinoide syntese eller metabolisme, resulterer i en ændring i de invasive egenskaber af prostatacancerceller i overensstemmelse med en beskyttende effekt af endocannabinoids [8], [12]. Endocannabinoid anandamid metaboliseres af enzymet fedtsyreamid hydrolase (FAAH) og overekspression af enzymet i PC-3-celler resulterer i en fænotype med en forøget invasiv adfærd

in vitro

[12]. Disse forfattere konkluderede, at “inhibering af FAAH-aktivitet med specifikke inhibitorer kan være en terapeutisk mål til behandling af prostatacancer” [12]. FAAH hæmmere, der ikke fremstiller den slags centrale adfærdsmæssige effekter forbundet med cannabinoider som Δ

9-tetrahydrocannabinol [13], er i øjeblikket i udvikling af lægemidler, primært med smerte som et terapeutisk mål, og den førende forbindelsen er i fase II af sin udvikling.

Mindre viden om endocannabinoide system i prostata tumorvæv, men i et studie med et stort antal patienter med en lang opfølgning, vi for nylig rapporteret, at ekspressionen af ​​CB

1-receptorer i tumorvæv opnået ved diagnose var forbundet med sygdommens sværhedsgrad og resultatet [14]. Således personer med en CB

1 receptor immunoreaktivitet (CB

1IR) over eller lig med medianen score for datasættet havde en højere forekomst af metastaser på diagnosetidspunktet, og en større andel af sager med en høj Gleason score (en indikator for sygdommens sværhedsgrad baseret på morfologi af de to mest almindelige tumortyper i prøven [15]) end de personer med en CB

1IR under medianen for datasættet. Desuden er der for de personer, der var blevet fulgt af den forventede indtil fremkomsten af ​​metastaser, en høj CB

1IR point er forbundet med en lavere sygdomsspecifik overlevelse [14]. Med hensyn til FAAH, er det blevet rapporteret, at i en kommercielt tilgængelig væv microarray, kerner af prostatacancer væv havde en højere ekspression af enzymet end det ses i normalt væv [12]. Imidlertid blev ingen data om forholdet mellem FAAH immunoreaktivitet (FAAH-IR) og resultatet sygdom præsenteres. Desuden blev mulige årsager til det høje FAAH-IR i tumorvævet ikke undersøgt af disse forfattere. Følgelig i den foreliggende undersøgelse har vi undersøgt FAAH-IR i vævet microarray tidligere blev anvendt af os til at karakterisere CB

1IR i tumorvævet [14], og der gennemføres undersøgelser under anvendelse af dyrkede celler for at se om en kendt komponent af tumormikromiljøet kan påvirke FAAH-aktivitet. Vi har endvidere undersøgt om FAAH-IR er korreleret med andre patogenetiske og prognostiske variabler, såsom den lokale tumor fase nummer og det immunoreaktive score for phosphoryleret epidermal vækstfaktor receptor (pEGFR).

Metoder

Etik Statement

forskningen etiske komité på Umeå universitetshospital (Regional etisk Review Board i Umeå, Sverige), der er godkendt af undersøgelsen og frafaldes behovet for informeret samtykke.

Patienter

de formalinfikserede, paraffinindlejrede prøver, der anvendes i den foreliggende undersøgelse blev indsamlet på Central Hospital, Västerås, Sverige, mellem 1975 og 1991 fra i alt 412 patienter diagnosticeret med prostatakræft ved transuretral resektion for vandladningsforstyrrelser vanskeligheder [16 ]. Tilstedeværelsen af ​​metastaser blev bestemt ved anvendelse af en knoglescanning kort efter transuretral resektion. Patienterne blev fulgt indtil 2003. I de 388 tilfælde, hvor tumor FAAH-IR kunne scoret (se nedenfor), 281 blev fulgt af vågent venter, indtil forekomsten af ​​metastaser (standard behandling tilgang på det tidspunkt). De andre patienter fik hormonbehandling, strålebehandling eller radikal prostatektomi. Gleason scorer og procentdelen af ​​prøven, der indeholdt tumor blev vurderet i hver prøve. Dødsårsag blev vurderet ved evaluering af medicinske journaler. Tissue microarrays (kerner med en diameter på 0,6 mm) blev konstrueret ved anvendelse af en Beecher Instrument (Sun Prairie, WI, USA). Hvert væv microarray slide (56 i alt, som regel med kernerne fra 8 tilfælde pr slide) indeholdt op til otte (sædvanligvis fem) prøver af tumorvæv (både primære og sekundære Gleason karakteren områder blev inkluderet) og op til fire (som regel fire) prøver af ikke-malignt væv fra hver patient [16].

Immunhistokemi

Snit blev afparaffiniseret, rehydreret og anbragt i citratpuffer pH 6,0. Efter kogning i en trykkoger i 60 min, blev prøver anbringes i vand og derefter i Ventana buffer, hvorefter de blev anbragt i et Ventana automatiseret analysator (Ventana Medical Systems Inc., Tucson, AZ), som FAAH antistof (fortynding 1 /2000) og det sekundære system (iView DAB Detection Kit, Ventana Medical Systems Inc.) blev tilsat. Det anvendte antistof, et kanin-anti-FAAH dannet mod de sidste 102 aminosyrer af rotte-FAAH, er blevet karakteriseret i detaljer [17] og viste sig at frembringe den passende farvningsmønster (somatodendritisk farvning af primære celler) i formalin-fikseret væv fra human hippocampus (data ikke vist), i overensstemmelse med de rotte hippocampus [18], [19]. CB

1 receptor immunoreaktivitet (CB

1IR) scoringer var tilgængelige i databasen, og er blevet rapporteret andetsteds [14].

De enkelte kerner blev scoret under mikroskopet for FAAH-IR med en investigator (LT), der var blind for de kliniske data for patienter. Pointsystemet anvendt var i det væsentlige den samme som tidligere anvendt til CB

1IR [14]. Kort fortalt, for epitelvævet, kernerne blev bedømt for immunoreaktiv intensitet (0-3, hvor 0 er fraværende, og 3 er høj) og fordeling i epitelvævet (0, 10, 25, 33, 50, 67 eller 100% af den samlede fordeling for hver intensitet). Fordelingen for de mest almindelige intensitet var sat til 100 minus summen af ​​de øvrige intensiteter. Den fraktionelle fordeling på hvert intensitet blev ganget med intensiteten score og værdierne summeres at give en endelig score for kernen. Således kan for eksempel, ville en kerne med intensiteter af 1 (10%), 2 (10%) og 3 (resten) (fordeling i parentes) modtager en sammensat score på 1 × 0,1 + 2 × 0,1 + 3 × 0,8 = 2,7 . Når identificerbare i kernen, var den basale og luminale epitelvæv scoret separat. Blodkarrenes vægge blev bedømt på samme måde, men med en enklere distribution (0, 50 og 100%). Gennem hele scoring, eksempler på kerner scorede som 1, 2 og 3 var på hånden til sammenligning som en “intern standard”. Kerner hvor strukturen eller kvaliteten af ​​vævet var ikke tilstrækkeligt godt, eller hvor farvningen var uklar, blev udelukket fra undersøgelsen. For hver foranstaltning blev median værdier for de sammensatte score for hver patient beregnet og indtastet i databasen af ​​en anden investigator (CF). Som et mål for pålideligheden af ​​tumor epitel scoringer, blev 67 kerner (16 patienter) scoret på to separate lejligheder med samme investigator. Den Spearman Korrelationskoefficienten for de enkelte centrale score mellem denne pilot og hovedundersøgelsen var 0,76 (n = 67, p 0,0001, 95% konfidensinterval 0,63-0,85). Den intraclass korrelationskoefficient for enkelte foranstaltninger (ICC (2,1), et mål for reproducerbarhed scoring metoden) var 0,67 (95% konfidensinterval 0,51-0,78, p 0,001).

Interleukin-4 (IL-4) receptor-immunoreaktivitet blev undersøgt i formalin-fikserede, paraffinindlejrede vævssnit under anvendelse af et monoklonalt antistof mod det ekstracellulære domæne af rekombinant human IL-4-receptor (MAB230, R Applied Biosystems, Foster city, CA, USA). For semi-kvantitativ PCR, blev prøver fra samme behandlingsgruppe poolet (n = 6).

Semi-kvantitativ PCR

mRNA niveauer for menneskelig CB

1, FAAH og GAPDH blev analyseret ved anvendelse af en Taq PCR Core (Qiagen, Hilden, Tyskland), en Biometra TProfessional thermocycler (Biometra, Gottingen, Tyskland) og de følgende primere: hFAAH (197 bp), fremadrettet 5′-TGGAAGTCCTCCAAAAGCCCAG-3 ‘, reverse 5’ – TGTCCATAGACACAGCCCTTCAG-3 ‘, HCB

1 (165 bp), frem 5’AAGGTGACATGGCATCCAAAT-3′, omvendt 5′-AGGACGAGAGAGACTTGTTGTAA-3 ‘, og hGAPDH (180 bp), frem 5’CAACTACATGGTTTACATGTTC-3’, reverse 5’GCCAGTGGACTCCACGAC-3 ‘. Betingelserne for PCR var: denaturering ved 94 ° C i 2 min, annealing i 40 sek ved 57 ° C (GAPDH) eller 60 ° C (FAAH, CB

1) efterfulgt af forlængelse ved 72 ° C i 60 s; i efterfølgende cyklusser denaturering blev udført ved 94 ° C i 40 s. For FAAH og CB

1, analyserne omfattede 35 cyklusser, mens 25 cykler blev brugt til GAPDH.

Kvantitativ real-time PCR

Ud over semi-kvantitativ PCR på puljede prøver , analyse af individuelle prøver blev udført ved anvendelse kvantitativ real-time PCR. Både SYBR Green (FAAH, CB

1, GAPDH) og TaqMan (ß-actin) kinetik blev brugt. For FAAH, CB

1 og GAPDH, de ovenfor beskrevne primere blev anvendt sammen med Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), hvorimod human ß-actin blev detekteret under anvendelse af en foruddefineret primer -probe mix (Hs00357333_g1, Applied Biosystems) sammen med TaqMan Universal PCR Master mix (Applied Biosystems). De amplifikationer blev udført på en ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System og software (Applied Biosystems), og prøverne blev analyseret i triplikater. Både GAPDH og ß-actin blev anvendt som husholdningsgener, med lignende resultater (data for ß-actin ikke vist). Den relative udtryk for FAAH og CB

1was beregnet ud fra

Ct

værdier ved hjælp af standardkurven metoden.

Western Blot

For Western blotting, protein prøver elektroforese på 10% SDS – polyacrylamidgeler under reducerende betingelser og fraktionerede proteiner blev elektroforetisk overført til Immobilon-P membran (Millipore, Bedford, MA, USA). Membraner blev blokeret natten over ved 4 ° C på en orbitalryster i 5% fedtfri mælkepulver, 0,05% Tween-20 i PBS (PBS T) før inkubering med primært polyklonalt kanin-antistof mod FAAH (1:1000-1 :5000; det samme antistof som anvendt i den immunhistokemiske del af undersøgelsen) eller primær kanin polyklonalt antistof mod actin (1:8000; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Primære antistoffer blev fortyndet i PBS-T 3% (FAAH) eller PBS-T 5% (actin) fedtfrit mælkepulver. Efter inkubation med peroxidase-konjugeret sekundære antistoffer (Amersham Biosciences) blev proteiner detekteret under anvendelse af forøget kemiluminescens påvisningssystem (Amersham Biosciences). Molekylære størrelser af proteinbånd blev bestemt ved parallelle elektroforese af molekylvægtmarkører (Bio-Rad Laboratories AB, Sundbyberg, Sverige). Proteinkoncentrationer blev bestemt ved BSA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA)

Forbindelser

Anandamide (ethanolamin-1-

3H, specifik aktivitet:. 2.2 TBqmmol

-1) blev opnået fra American Radiolabeled Chemicals Inc. (St. Louis, MO, USA). Umærket anandamid og URB597 blev opnået fra Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, MI, USA). Interleukin-4 blev opnået fra Sigma-Aldrich.

Statistik

Med undtagelse af Cox proportional-farer regression og intraclass korrelationskoefficient analyser, der blev gennemført ved hjælp af SPSS software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) blev alle statistiske beregninger foretaget ved hjælp af den statistiske pakke indbygget i GraphPad Prism 5 computerprogram til Macintosh (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). For overlevelse analyser, blev en begivenhed defineret som dødsfald som følge af prostatakræft og trådte i databasen som “event = 1”. Døden fra andre årsager blev censureret, som var de tilfælde, hvor patienten var stadig i live på tidspunktet for sidste opfølgning. Disse blev grupperet som “event = 0”. Cases (n = 3), hvor resultatet sygdommen var ukendt, blev udelukket fra overlevelse analyser. Varigheden af ​​begivenhed overlevelse er defineret som den tid fra diagnose til datoen for prostatakræft død, død andre årsager, eller hvis der ikke døden indtraf, indtil datoen for den sidste opfølgning.

Modtager drift karakteristik (ROC) kurver blev anvendt til at definere cut-offs for FAAH-IR, som derefter blev anvendt til at konstruere overlevelseskurver hjælp af Kaplan-Meier-metoden. Forskelle i resultat mellem grupper blev testet med log-rank test. Cox proportional-risiko regressions analyser blev foretaget for at vurdere indflydelsen af ​​FAAH score på resultatet på forskellige CB

1IR cutoffs. Forskelle i fordelingen af ​​variabler mellem grupper af patienter blev analyseret ved hjælp af chi-square test.

For læsere, der ikke kender de statistiske metoder, der anvendes til at vurdere indflydelsen af ​​FAAH-IR på resultatet sygdom, en kort forklaring af deres anvendelighed er berettiget, især med hensyn til valg af cutoff-værdier for FAAH-IR. ROC test blev oprindeligt udviklet til at hjælpe fortolkning af radar-signaler, og plotter antallet af sande negativer (1- den falske positive fraktion, betegnet 1 – specificitet)

vs

sande positive (følsomhed) ved en given cutoff. værdi (dvs. for tilfælde med en score lig med eller højere end, den valgte værdi). Arealet under ROC-kurven kan derefter beregnes. For en test med absolut ingen diagnostisk værdi, vil kurven være en lige linie med et areal på 0,5. En perfekt test ville give en værdi på 1,0, så jo længere væk fra 0,5 værdi, jo bedre testen. For prøve med et areal under kurven signifikant større end 0,5, et vigtigt spørgsmål er valget af cutoff, der er valgt som et signal om, at patienten kan have den pågældende sygdom værdi. Hvis cutoff-værdien er sat lavt, så følsomheden vil være høj, men der vil være et stort antal falske positive. Hvis cutoff-værdien er indstillet højt, så antallet af falske positive vil være lavere, men et stort antal ægte positive vil blive savnet. Valget af cutoff er således en afvejning mellem maksimering af antallet af ægte positive fundet og minimere antallet af falske positiver. Valg af cutoff er afhængig af den relative betydning af manglende sande positive

vs.

Misdiagnosing sande negativer for den pågældende sygdom, men en nyttig måde at identificere en optimal cutoff er at bestemme cutoff point med den maksimale lodrette afstand mellem den observerede værdi og den tilsvarende værdi for en test uden diagnostisk værdi, beregnet som maksimal følsomhed + specificitet -1. Denne værdi betegnes Youden indekset, J, og vi har brugt denne værdi her for FAAH-IR (betegnet J

FAAH). For nyttige anmeldelser på ROC kurver og valg af optimale cutoff værdier, se [22] – [24]

Med hensyn til de statistiske analyser af overlevelseskurver, Kaplan-Meier-metoden, hvor forskelle i resultat mellem. grupper er testet med log-rank test, giver en nyttig (og visuelt) metode til at vurdere forskelle i overlevelse kurver. Cox proportional-farer regressionsanalyser faren “som en funktion af de forklarende variable og ukendte regressionskoefficienter multipliceret med en vilkårlig og ukendt funktion af tid” (citat fra den originale papir af Cox [25]), dvs. vurderer bidrag forskellige potentielle risikofaktorer på end-point målt (i dette tilfælde, død som følge af prostatakræft) uden at lave antagelser om de grundlæggende overlevelse kurven selv.

Resultater

Fordeling af FAAH immunoreaktivitet i ikke- maligne og tumorvæv

FAAH-IR blev scoret i kerner fra alt 412 patienter. Af disse blev poster for seks patienter, som ikke findes i databasen, og så data for disse patienter blev ikke inkluderet i analyserne.

Et eksempel på FAAH-IR for den ikke-malignt væv er vist i fig. 1A. FAAH-IR blev set i de epitelceller, og i blodkar, såvel som i celler (eventuelt lymfocytter, som udtrykker FAAH [26]) infiltrere stroma i nogle kerner. I alt blev 1247 kerner fra 377 patienter scorede for ikke-maligne epitelial FAAH. Af disse 733 kerner fra 307 sager havde definerbar basal: luminale morfologi og FAAH-IR for disse sager blev scoret separat og anvendes i analyserne. Desuden blev 993 kerner fra 369 sager scorede for FAAH-IR i blodkarrenes vægge. Den kumulative fordeling af scorerne i de basale og luminale epitelceller er vist i fig. 1B, hvor det er klart, at den mediane FAAH-IR er højere i de basale epitelceller end i de luminale celler. Faktisk af de 733 kerner scorede, den basale FAAH-IR score var højere end den tilsvarende luminale score i 724 kerner, og de to scoringer var ens i 9 kerner. Den luminale score var aldrig højere end den basale score. Blodkarret FAAH-IR blev scoret lidt forskelligt, så en direkte sammenligning af værdierne er ikke relevant. Men der var en signifikant korrelation mellem basal FAAH-IR og blodkar FAAH-IR, men ikke mellem den luminale og blodkar FAAH-IR (tabel 1).

Panel A. Eksempel på FAAH-IR i en kerne af ikke-malign prostata væv opnået ved transuretral resektion fra en 75-årig patient. Stjernerne viser blodkar, og symbolet # indikerer FAAH-positive celler, formentlig infiltrerende lymfocytter. I Panel C, FAAH-IR i en kerne af tumorvæv fra en 64-årig patient vist. Linjerne øverst til højre over kernerne indikerer 100 um. Panel B viser de kumulative frekvenser af FAAH-IR score på de basale og luminale ikke-malign (N) epitelvæv (n = 307 i begge tilfælde) og for tumor (T) epitelvæv (n = 388). De medianværdier (med interkvartile område i parentes) var: basal (N), 2,625 (2,125 til 2,9); luminale (N), 1,25 (1-1,75); epitel (T), 2,05 (1,8-2,3). Medianværdier var signifikant forskellige fra hinanden (p 0,001, Dunns multiple sammenligningstest efter betydelig Kruskal-Wallis test). Felt D viser forholdet mellem den epitheliale tumor FAAH-IR til Gleason score (GS) på diagnosetidspunktet. De FAAH-IR scoringer blev opdelt i kvadranter, hvor jeg refererer til score mellem 1,8 (n = 96), II mellem 1,8 og 2 (n = 94), III mellem 2,05 og 2,25 (n = 99) og IV mellem 2,3 og 3 (n = 99). Fordelingen af ​​GS grupperne var signifikant forskellig i de kvadranter (χ

2 = 27,03, df = 9, s 0,0005).

I alt 1851 kerner fra 388 sager blev bedømt for FAAH-IR i tumoren epitelceller. For blodkarrene, blev 1201 kerner fra 360 patienter scoret. Et eksempel på farvning for en tumor kerne er vist i fig. 1C og den kumulative fordeling af de epiteliale scorer er vist i fig. 1B, hvor det kan ses, at den mediane score var signifikant højere end den ikke-maligne luminale score, men lavere end den basale score.

Prøverne anvendt her er tidligere blevet undersøgt af os med respekt ekspressionen af epitel CB

1-receptorer [14]. For de ikke-maligne prøver, var der ingen signifikant korrelation mellem CB

1IR scoringer og enten basal, luminale eller blodkar FAAH-IR. I modsætning hertil FAAH-IR en signifikant sammenhæng mellem tumor CB

1IR, og tumoren epitel- og blodkar blev set (tabel 1).

FAAH-aktivitet i prostata cancercellelinier påvirkes af interleukin-4

en forklaring på den konstatering, at tumor epitelial FAAH-IR er højere end FAAH-IR i normal prostata epitelvæv [12], er, at en bestanddel af tumor mikromiljø påvirker dets aktivitet. T

H2 cytokin interleukin-4 (IL-4), som er blevet rapporteret at regulere FAAH og CB

1-receptorer i lymfocytter og Jurkat-celler [26] – [28], er involveret i patogenesen af ​​flere kræft typer, herunder prostatacancer (se [29] – [35]). IL-4-receptorer er blevet rapporteret i begge tumor epitelceller og i dyrkede prostatacancer-cellelinier [29], [36]. Vi bekræftede tilstedeværelsen af ​​IL-4 IR i prostatacancer epitelvæv (fig. 2A), og fandt, at inkubationen af ​​både humane androgen-ufølsom PC-3-celler og rotte Dunning R3327 AT-1 prostatacancerceller med IL-4 i 24 h frembragte en signifikant stigning i FAAH-aktivitet af cellerne (fig. 2B og C). Et lignende resultat blev set med human prostatacancer LNCaP-celler (data ikke vist). Denne virkning af IL-4 er ikke enestående for prostatacancerceller, da det også blev set muse P19 teratocarcinomceller (fig. 2D).

Felt A, IL-4-receptor-immunoreaktivitet i en prostata tumor vævsprøve ( Gleason score 8). Linjen nederst til venstre i billedet repræsenterer 100 um. Paneler B-D, virkningen af ​​IL-4 på FAAH aktivitet af humane PC-3 prostatacancerceller (B); rotte R3327 AT-1 prostatacancerceller (C) og muse P19 teratocarcinomceller (D). Cellelinierne blev inkuberet i 24 timer med 5 ng /ml IL-4 og FAAH-aktivitet i celle homogenater blev bestemt ved anvendelse 2 uM [

3H] anandamid som substrat. Enzymaktiviteten i alle tilfælde blev totalt blokeret ved den selektive FAAH-inhibitor URB597. Dataene er midler og standardafvigelse, n = 4-5; * P 0,05, ** p 0,01, parret t-test. I paneler (E) og (F) PC-3 og LNCaP-celler blev inkuberet med IL-4 (5 ng /ml) i 24 timer. Ekstraktion af RNA, cDNA-syntese og PCR-analyse blev udført som beskrevet i ‘Methods’ sektionen. Panel E. Semi-kvantitativ PCR-analyse af FAAH mRNA-ekspression i PC-3 og LNCaP-celler. MRNA ekspression af FAAH blev normaliseret mod GAPDH. Den semi-kvantitativ PCR-analyse blev udført ved anvendelse poolede prøver (n = 6). Panel F. Kvantitativ realtids-PCR-analyse af FAAH-mRNA-ekspression, normaliseret mod GAPDH. Kvantitative PCR-data visualiseres som middel (n = 6) og SEM, hvor den ubehandlede kontrolgruppe middelværdi er defineret som 100%.

I efterfølgende eksperimenter, virkningerne af IL-4 behandling upon FAAH-protein og mRNA blev vurderet. Behandling af PC-3 og LNCaP-celler med IL-4 i 24 timer ikke regulere mRNA-ekspression af FAAH, som bedømt ved både semi-kvantitativ PCR og kvantitativ realtids-PCR (fig 2E, 2F). I et yderligere eksperiment blev PC-3-celler behandlet med IL-4 (5 ng /ml) i 3 timer, undersøge mulige tidlig regulering af FAAH ekspression. Svarende til 24 timer eksperiment, behandling af PC-3-celler med IL-4 i 3 timer ikke regulere mRNA-ekspression af FAAH (data ikke vist). I modsætning til situationen for Jurkat-celler og T-lymfocytter, ekspressionen af ​​CB

1 i LNCaP-celler blev ikke reguleret af IL-4: den relative ekspression af CB

1 /GAPDH (% af ubehandlede kontroller, middel ± sem, n = 6) efter 24 timer af behandlingen med enten vehikel eller IL-4 var 100 ± 33 og 109 ± 20 hhv. PC-3 celler, der anvendes i vores laboratorium ikke udtrykker påviselige niveauer af CB

1 mRNA (data ikke vist).

Foreløbige Western blots analyser blev også gennemført ved hjælp af lysater fra PC3 celler behandlet i 24 timer med enten bærer eller 5 ng /ml IL-4.