Kvantitative proteomics afslører PARKIN translocation

En asymmetrisk celledeling producerer to datterceller med forskellige cellulære skæbner. Denne proces er meget vigtig for dannelsen og udviklingen af ​​cancer og har betydelig terapeutisk potentiale. Her identificerer vi lang levetid proteiner i delende celler under aldring ved hjælp af spirende gær, Saccharomyces cerevisiae. Gær mor celler undergår et begrænset antal asymmetriske divisioner, der definerer replikation levetid.

For det første? Vi opbygge et system til at identificere de langlivede proteiner. Vi brugte stabil-isotop puls-chase og total proteomanalyse massespektrometri til at identificere proteiner, der var både lang levetid og bibeholdt i aldrende mor celler efter? 18 celler divisioner. Vi identificerede? 135 proteiner, som vi udpeger som længe levede asymmetrisk tilbageholdte proteiner (LARPs).

Dernæst tager vi et andet system til at teste og kontrollere de langlivede proteiner. Tagging et protein af interesse med RITE opretter systemet et fusionsprotein, som oprindeligt udtrykker protein-GFP, derefter gennem en estradiol-inducerbar rekombinationsbegivenhed, udtrykker protein-RFP. Det oprindelige protein er mærket grøn og efterfølgende proteiner er mærket rødt.

Endelig kan akkumulering af nogle LARPs med successive celledelinger resultere i en effektiv forøgelse af dosis af protein i ældre celler. Plasma membraner LARPs kan både ændres og stigning i niveauer med efterfølgende celledeling

langlivede proteiner bidrager til alder-associerede fænotyper og sandsynligvis findes i andre organismer.

PARKIN E3 UB ligase er muteret i Parkinsons sygdom (PD) og styrer mitokondrie autofagi. Parkin funktioner via en såkaldt RING-HECT hybrid mekanisme hvor en katalytisk Cys-rest i RING2 domæne modtager UB fra et E2 og overfører den til substratet. Her bruger vi kvantitative proteomics og live-cell imaging at dissekere de enkelte trin i Pink1 kinase-PARKIN UB ligase mitokondrie kontrol pathway unormal i Parkinsons sygdom.

PARKIN aktivering med Pink1 producerer UB kæder på mitokondrier, og PARKIN-afhængige kæde samling er nødvendig for ophobning af poly-phospho-UB på mitokondrier. En ti-plex tandem mass tagging kvantitativ proteom eksperiment afslørede en stigning på 3 gange i p-S65 UB 30 min efter depolarisering i Pink1 + /+ mus embryonale? Broblasts (MEF’er).

Pink1 fremmer PARKIN association med poly-UB Chains af phosphorylering både PARKIN og poly-UB.

UB kan undergå kædeforlængelse på syv lysiner og N-terminale methionin, med forskellige skæbner for forskellige linkage typer. PARKIN fremmer syntesen af ​​kanoniske og ikke-kanoniske poly-UB kæder på depolariserede mitokondrier på en måde, der afhænger af dens katalytiske Cys rest og S65 i sit UBL domæne.

Til resumé, vi tager magt proteomics til analyse enkelte trin i komplekse phosphoryleringsafhængige drevet UB kaskader. Det vil være nyttigt for forståelsen signalering-ubiquitylering veje i fremtiden.