PLoS ONE: CDC25AQ110del: A Novel celledeling Cycle 25A Isoform udtrykkes afvigende i ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Målsætning

Lungekræft er stadig nummer et årsag til kræftrelaterede dødsfald på verdensplan. Celle cyklus deregulering spiller en stor rolle i patogenesen af ​​ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Cdc25A repræsenterer en kritisk cellecyklus regulator, der forbedrer cellecyklusprogression. I denne undersøgelse sigter vi for at undersøge den rolle, som en roman Cdc25A transkriptionel variant, Cdc25A

Q110del, om regulering af den Cdc25A protein, og dens indvirkning på prognosen af ​​NSCLC patienter.

Metode /vigtigste resultater

Her rapporterer vi en ny Cdc25A udskrift variant med codon 110 (glutamin) sletning, at vi betegnes Cdc25A

Q110del i NSCLC celler. I 9 (75%) af de 12 NSCLC cellelinjer, Cdc25A

Q110del udtryk tegnede sig for mere end 20% af de Cdc25A udskrifter. Biologiske effekter af Cdc25A

Q110del blev undersøgt i H1299 og HEK-293F celler ved hjælp af UV-stråling, flowcytometri, cyclohexamid behandling, og konfokal mikroskopi. Sammenlignet med Cdc25A

vægt, Cdc25A

Q110del protein havde længere halveringstid; celler, der udtrykker Cdc25A

Q110del var mere resistente over for UV-bestråling og viste mere mitotisk aktivitet. Taqman-PCR blev anvendt til at kvantificere Cdc25A

Q110del ekspressionsniveauer i 88 primære NSCLC tumorvæv /normalt væv par. Hos patienter med NSCLC viste Kaplan Meier kurver tumorer, der udtrykker højere niveauer af Cdc25A

Q110del forhold til de tilstødende lungevæv til at have betydeligt ringere samlet overlevelse (

P

= 0,0018).

betydning

Her identificerede vi Cdc25A

Q110del som en ny transkriptionel variant af Cdc25A i NSCLC. Sekvensen-specifikke karakter af abnormitet kunne være en prognostisk indikator i NSCLC patienter samt en kandidat mål for fremtidige terapeutiske strategier

Henvisning:. Younis RH, Cao W, Lin R, Xia R, Liu Z, Edelman MJ, et al. (2012) Cdc25A

Q110del: A Novel celledeling Cycle 25A Isoform udtrykkes afvigende i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 7 (10): e46464. doi: 10,1371 /journal.pone.0046464

Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: Juni 11, 2012; Accepteret: August 30, 2012; Udgivet: Oktober 5, 2012 |

Copyright: © Younis DDS, MDS, ph.d., et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev delvist understøttet af NIH tilskud R01 CA126818 og R01 CA136635. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er stadig den hyppigste årsag til malignitet. -relaterede dødsfald på verdensplan på trods af de fremskridt inden for terapeutiske modaliteter [1]. Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er den mest almindelige form for lungekræft og er et resultat af akkumulerede molekylære forandringer, der fører til deregulering af flere cellulære processer, herunder cellecyklus kontrol [2]. I NSCLC er flere celle-cyklus regulatorer, der spiller en kritisk rolle i celle cyklus check point kontrol ændret, hvilket giver kræftcellerne omgå forskellige checkpoints, især ved G1 /S og G2 /M med efterfølgende ukontrolleret celleproliferation [3] – [ ,,,0],7].

celledelingscyklussen 25A (Cdc25A) er et medlem af Cdc25 familien af ​​dobbeltspecifikke phosphataser og spiller en kritisk rolle i cellecyklusprogression [8], [9]. Cdc25A funktioner til at fjerne de inhiberende phosphater fra threonin- og tyrosinrester i ATP-bindingssteder af CDK’er, fremme cellecyklusprogression [10], [11]. Cdc25A er også en nedstrøms mål for Chk1-medieret checkpoint pathway: aktivering af Chk1 ved DNA skadelige betingelser mål Cdc25A for proteasom nedbrydning, hvilket forhindrer cellerne med kromosomafvigelser fra fremad gennem cellecyklussen [10], [12], [13]. Mens CDK1 spiller en kritisk rolle for Cdc25A stabilisering under mitose [8], [10], [11]. Cdc25A ofte overudtrykt i kræft, herunder NSCLC. Denne overekspression er associeret med en mere aggressiv klinisk adfærd og ringere overlevelse [7], [8], [12] – [19]. Selvom Cdc25A er blevet grundigt undersøgt for sin rolle i tumorudvikling og som potentielt mål til kræftbehandling, mekanismerne i Cdc25A overekspression i cancer stadig at blive undersøgt [12]. Nogle undersøgelser har vist, at overekspression af Cdc25A i cancere kunne være resultatet af post-transkriptionelle deregulering [20] såsom overekspression af DUB3 ubiquitin hydrolase [21], inaktivering af glycogensyntasekinase-3p (GSK-3beta), der phosphorylerer Cdc25A at fremme proteolyse i tidlige celle-cyklus faser [22], aktivering af LIN28A der regulerer Cdc25A udtryk ved at hæmme biogenese af lad-7 miRNA [23], og microRNA-21 som negativt regulerer Cdc25A, så dens under-ekspression resulterer i Cdc25A overekspression i tyktarmskræft [24].

Her er vi rapporterer identifikation af en roman, alternativt splejset Cdc25A isoform, der resulterede i sletning af codon 110 betegnes Cdc25A

Q110del. Vi viser, at Cdc25A

Q110del udtrykkes ved høje niveauer i 75% af NSCLC cellelinjer. Cdc25A

Q110del protein havde højere stabilitet og mere nukleare fordeling. Celler, der udtrykker højt niveau af Cdc25A

Q110del var mere resistente over for UV-bestråling. Hos patienter med NSCLC, blev højere Cdc25A

Q110del niveauer i tumorer forbundet med dårlig klinisk resultat. Vore data viser, at Cdc25A

Q110del ekspression er almindelig i NSCLC og kan spille en rolle i lunge tumorigenese og cancer progression.

Materialer og metoder

Cellelinjer

HEK293 og NSCLC-celler blev opnået fra ATCC (Manassas, VA), og opretholdt i DMEM – 5% føtalt bovint serum. Immortaliserede humane bronchieepithelceller cellelinjer (HBEC), HBEC2, HBEC3, HBEC4 og HBEC5 (gave fra Drs. John Minna og Jerry Shay fra University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas) [25], blev opretholdt i keratinocyt serum- fri (KSF) medier med rekombinant human epidermal vækstfaktor (rEGF) og ekstrakt fra bovin hypofyse (Invitrogen, Carlsbad, CA). Plasmidtransfektion blev udført under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Western blotting

Celler blev høstet i RIPA buffer med proteasehæmmer (Roche Bioscience), og separeret ved SDS-PAGE. Primære antistoffer mod Cdc25A (kloner 144 og F-6), cdc2 P34 (H-297), Chk1, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, CA), phospho-Chk1 (Ser345) (Cell Signaling Biotechnology, Danvers, MA), phospho- CDK1 (Tyr15) (Calbiochem EMD Chemicals Inc, Gibbstown, NJ) blev anvendt. NE-PER proteinekstraktion kit (Pierce Biotech, Rockford, IL) blev anvendt til at fraktionere cytosol og kerneproteiner. Cyclohexamid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) blev rekonstitueret i DMSO.

RNA-ekstraktion, revers transkription, og real-time PCR

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol-reagens, og konverteres til cDNA under anvendelse SuperScript III First-Strand Synthesis kit (Invitrogen). Fuld længde Cdc25A cDNA blev amplificeret under anvendelse iProof High-Fidelity DNA-polymerase (Bio-Rad, Hercules, CA), og klonet i pEF6 /V5 His (Invitrogen, Carlsbad, CA) eller pEGFP-N1 (Clontech Laboratories, CA) i standardisering real time PCR reaktioner, UV stråling, CHX behandlinger, sekvensanalyse og restriktionsenzymfordøjelse, pEGFP-N1 fusioneret til EGFP eller m-Cherry blev anvendt til billeddannelse og flowcytometri-analyse, eller hvor angivet Alle DNA manipulationer blev udført i biosikkerhed niveau 1 eller 2 laboratorier.

for at kvantificere den samlede Cdc25A afskrift, real-time PCR-analyse blev samlet ved hjælp af den fremadrettede primer 5′-GCTCCTCCGAGTCAACAGAT -3 “, revers primer 5’TGGACTACATCCCAACAGCTT-3 ‘, og FAM ™ farvestof-mærket probe 5 ‘-ATTCTCCTGGGCCATTGGACA-3’; at kvantificere vildtype Cdc25A transkript blev assayet samlet under anvendelse af fremadrettet primer 5 ‘-GCTCCTCCGAGTCAACAGAT 3′, revers primer 5’- ACTACATCCCAACAGCTTCTG- 3 ‘og FAM ™ dye-mærket probe 5′-ATTCTCCTGGGCCATTGGACA-3’. Assayet blev kørt tredobbelt med TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (Applied Biosystem, Carlsbad, CA) i Applied Biosystem 7900HT Hurtig Real Time PCR-system. I alle reaktioner, blev GAPDH Fast TaqMan assay VIC dye-mærket probe tilsat som RNA lastning kontrol.

Når den samlede udtryk for Cdc25A er udpeget som den endogene henvisning gen, den overflod af Cdc25A

Q110del kan være beregnet som ACt = Ct

wt-Ct

tot. Derfor er den relative forekomst af Cdc25

vægt i parret tumor versus normalt væv beregnes ved 2

-ΔΔCt metode, hvor ΔΔCt = ΔctTumor- ΔctNormal (User Bulletin # 2 Applied Biosystem). Hvis ekspressionsniveauerne af Cdc25A

Q110del og Cdc25

wt er lige i den tilsvarende tumor og det tilstødende normale lungevæv, den beregnede relative forekomst værdi vil være 1. En værdi 1 angiver, at tumoren udtrykker et højere niveau af Cdc25A

Q110del end den parrede normale lungevæv. Omvendt er en værdi . 1 angiver, at den normale lungevæv udtrykker et højere niveau af Cdc25A

Q110del end den parrede tumor

Sekvensanalyse og restriktionsenzymfordøjelse

DNA-kloner blev sekventeret ved University of Maryland Baltimore sekventeringsfaciliteten eller Genewiz Inc., (South Plainfield, NJ). Tilpasningen blev udført mod Cdc25A henvisning NM_001789. CDNA-klonerne anvendt til de funktionelle assays blev amplificeret fra NSCLC cellelinier (Tabel S1). For enzymatisk fordøjelse analyse blev et 292 bp fragment af Cdc25A cDNA amplificeret ved anvendelse af primerne: fremadrettet 5′-CACTGGAGGTGAAGAACAACAG-3 ‘og revers 5′-CAGCCACGAGATACAGGTCTTA-3’, spaltet med restriktionsendonukleasen Bpu10I (New England Biolabs, Ipswich, MA) derefter separeret på agarosegel.

UV-bestråling

til UV behandling af dyrkede celler blev medierne fjernet, cellerne blev vasket to gange med phosphatbufret saltvand og derefter bestrålet i udækkede vævskulturskåle med 254 nm UV-lys (UV-C) i Stratalinker UV tværbinder (Stratagene, La Jolla, CA). Frisk dyrkningsmedium blev tilsat tilbage, og cellerne blev yderligere inkuberet i de beskrevne tidspunkter.

Cellecyklusanalyse

Celler blev høstet, fikseret i 70% ethanol, suspenderet i PI /RNase-farvning Buffer (BD Pharmingen ™, San Jose, CA) indeholdende 0,1% natriumcitrat og 0,1% Triton X-100. Dataanalyse blev udført i University of Maryland Baltimore Medical Center, flowcytometri Core og analyseret med FlowJo software.

Imaging analyse

Celler, der udtrykker Cdc25A

wt eller Cdc25A

Q110del- fusioneres med mCherry eller EGFP blev fikseret i 2% paraformaldehyd, permeabiliseret med 0,5% Triton X-100, farvet med DAPI. De billeder blev taget med et Zeiss LSM 510 Meta Laser konfokalt med DAPI, FITC og rhodamin Fiters. Histogrammet repræsentant FITC og rhodamin udtryk blev fremstillet ved hjælp af

billede J

software.

Cell levedygtighed assay

Cell levedygtighed blev målt ved hjælp af Cell Proliferation Reagent WST-1 ( Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN).

Patienter og væv

primære NSCLC tumorer og deres tilsvarende ikke-maligne tilstødende lungevæv fra 88 personer med patologisk stadium i-IIIa NSCLC blev evalueret. Alle patienterne blev behandlet med kirurgi alene undtagen dem med stadium IIIa sygdom, der måske også havde modtaget postoperativ strålebehandling og adjuverende kemoterapi, ved University of Texas MD Anderson Cancer Center (MDACC) fra 1995 til 2000. Prøverne blev straks frosset og opbevaret ved -80 ° C. Udvælgelsen af ​​disse patienter var baseret på tilgængeligheden af ​​arkiverede frisk tumor og tilsvarende normale lungevæv for efterforskerne. Klinisk information og opfølgning oplysninger til undersøgelsen var baseret på diagrammet anmeldelse og danne rapporter fra MDACC tumor registreringsdatabasen service. Informeret samtykke til brug af resterende resektion væv til forskning blev opnået fra alle patienter i undersøgelsen.

Etik erklæring

Skriftligt informeret samtykke til brug resterende resektion væv til forskning blev opnået fra alle patienter i undersøgelsen. Proceduren for godkendelse og anvendelse af disse materialer og kliniske oplysninger blev gennemgået og godkendt af University of Texas MDACC overvågning udvalg.

Statistisk analyse

Studerende

t

-test blev anvendt til statistisk analyse af de funktionelle assays. Overlevelsesanalyse Kaplan Meier-kurver blev genereret med log rank analyse under anvendelse Proc Lifetest i SAS 9.2. Alle tests er tosidede og P-værdier 0,05 anses statistisk signifikant

Resultater

Identifikation af Cdc25A

Q110del i NSCLC

For at undersøge potentielle ændringer af. Cdc25A på mRNA-niveau, vi sekventeret Cdc25A cDNA-kloner afledt fra et panel af 10 NSCLC cellelinier. Blandt alt 16 cDNA-kloner fra de 10 cellelinier, observerede vi en specifik trinukleotid deletion i 7 af de 16 kloner fra 5 af de 10 cellelinier (fig. 1A) (tabel S1). Sletningen lokaliserer på positionerne 328-330 i henvisning til NM_001789.2, Cdc25A udskrift 1, der forudsiger en glutamin sletning i codon 110 (fig. 1B). Denne aminosyrerest er beliggende inden for regulatoriske domæne af Cdc25A, og er konserveret blandt flere hvirveldyr (fig. 1C og D). Vi kalder romanen Cdc25A isoformen med codon 110 sletning som Cdc25A

Q110del. Denne deletion er sandsynligvis et resultat af alternativ RNA-splejsning, da ingen ændring af genomisk DNA-sekvens blev fundet i NSCLC-cellelinier (data ikke vist) (fig. 1E) for at bekræfte tilstedeværelsen af ​​Cdc25A

Q110del i NSCLC-cellelinier og primære NSCLC tumorvæv, undersøgte vi cDNA’er fra 4 NSCLC cellelinjer og 5 primære NSCLC tumorvæv under anvendelse restriktionsendonukleasefordøjelse af Bpu10I, som kan spalte sekvensen 5′-CCTNAGC, et unikt sted i Cdc25A

Q110del sekvens, for at fremstille en kortere spaltede DNA-bånd. Alle prøver viste den kortere spaltede DNA-bånd ved forskellige tætheder (fig. S1).

A. Nukleinsyresekvens af tredobbelte deletion Cdc25A-CAG (328-30) i NSCLC-cellelinier. B. Cdc25A-CAG (328-30) oversættes til Q110 sletning (Cdc25A

Q110del). C. Amino acid Q110 af Cdc25A er evolutionær bevaret i andre organismer. D. Q110 ligger i den regulatoriske domæne, nærmest CDK1 mitotisk stabilisering phosphoryleringssite (S116) og Chk1 nedbrydning phosphoryleringssite (S124). Rød: CAG (328-30) nukleinsyre sletning og tilsvarende aminosyre Q110, skygge: serin phosphoryleringssites (S116 og S124). E. Skematisk illustration af foreslået alternativ splejsning site. Alternativ donor site: en 5’splejsningsforbindelsen (donor site), ændre 3’grænse af opstrøms exon, ville producere Cdc25A

wt transskript, medens en alternativ acceptor site: en 3 splejsningsforbindelsesstedet (acceptor site), ændre 5’grænse af downstream exon, ville producere Cdc25A

Q110del transkript.

Vi næste udtænkt en real-time PCR assay (fig. 2A) for at vurdere den mængde Cdc25A

Q110del blandt de samlede Cdc25A udskrifter i NSCLC cellelinjer og vævsprøver, at vise, at analysen kvantitativt kan måle den relative forekomst af Cdc25A isoformer, vi konstrueret en Ct-kurve ved hjælp oprensede plasmid-DNA indeholdende enten Cdc25A

wt eller Cdc25A

Q110del cDNA indsætte. Resultatet viste en næsten lineær sammenhæng med forskellig vildtype og Q110del forholdet (Fig. 2B) .Dette metode blev derefter anvendt til æsler Cdc25A

Q110del ekspression i cellelinjer og væv. I 4 HBEC cellelinjer, Cdc25A

Q110del ekspression var påviselig, men på generelt mindre end 20% af de samlede Cdc25A transkripter (fig. 2C). Det skal bemærkes, at disse cellelinjer blev afledt fra immortaliserede humane bronkiale epitelceller fra patienter med lungecancer. Til sammenligning 9 (75%) af de 12 NSCLC cellelinier udtrykte Cdc25A

Q110del større end 20% af de samlede Cdc25A transkripter, herunder 3 (20%) af cellelinierne udtrykt Cdc25A

Q110del på næsten 50% niveau (fig. 2C). Forskellen på Cdc25A

Q110del ekspressionsniveauer mellem HBEC cellelinier og de NSCLC cellelinier var statistisk signifikant (

P

= .003). Interessant, H596 og H549 cellelinier, der viser Cdc25A

Q110del på 50% af det samlede Cdc25A, har en høj modal kromosomal nummer ved en høj procentdel, NCI-H596 modaltallet = 71; interval = 65 til 75.This er en nær triploid human cellelinie. Mens A549 er en hypotriploid human cellelinie med kromosomtal af 66, der forekommer i 24% af cellerne (ifølge “American Type Culture Collection”). Dette tyder Cdc25A

Q110del at spille en rolle i genomisk ustabilitet og kumulative maligne forandringer [26]. En korrelation mellem Cdc25A

Q110deland ophobning af hyperploid celler er beskrevet nedenfor i cellecyklus distribution.

A. Real-time PCR-analyse til at vurdere mængden af ​​Cdc25A

Q110del forhold til de samlede Cdc25A udskrifter i NSCLC cellelinjer og vævsprøver, den “Total” tidstro-PCR-analysen bestemmer total Cdc25A skabelon i reaktion (Ct

tot ) mens “wt” real time-PCR-analysen bestemmer målgenet som er Cdc25A

wt skabelon (Ct

vægt), derefter beregne Cdc25A

Q110del = ACt = (Ct

vægt- ct

tot). B. Standard kurve illustrerer Ct-værdier svarende til forskellige forhold mellem Cdc25A

vægt: Cdc25A

Q110del, pEF6-V5-His-Cdc25A

wt og pEF6-V5-His-Cdc25A

Q110del blev indarbejdet sammen på flere nøgletal som skabelon i hver Uniplex real time PCR reaktion, køre i tre eksemplarer, så Cdc25A

Q110del beregnet (Cdc25A

Q110del = ACt = Ct

wt-Ct

tot). C. 50% af NSCLC viser Cdc25A

Q110del værdier, der svarer til 30-50% af de samlede Cdc25A skabeloner i forhold til standardkurven (B), mens de HBEC cellelinier udtrykker -20% af de samlede Cdc25A skabeloner (

P

= 0,003).

Cdc25A

Q110del protein stabilitet og Cell overlevelse

Cdc25A er et labilt protein, stramt reguleret gennem flere phosphoryleringsbegivenheder i sin regulatorisk domæne [8]. For at undersøge effekten af ​​Q110 sletning på skæbne Cdc25A protein regulering, vi testede nedbrydningshastigheden af ​​Cdc25A

Q110del hjælp cyclohexamid (CHX) behandling. I H1299 celler behandlet med CHX, vi observeret, at Cdc25A

Q110del har en længere halveringstid sammenlignet med Cdc25A

wt (fig. 3A). Når endvidere Cdc25A

wt og Cdc25A

Q110del blev cotransficeret, mere Cdc25A

Q110del blev akkumuleret end Cdc25A

wt ved 72 timer efter transfektion (Fig. S2) i både H1299 og 293F celler.

A. Tidsforløb cyclohexamid (50 ug /ml) behandling af H1299 celler transficeret med pEGFPN1-Cdc25A

wt eller pEGFPN1-Cdc25A

Qdel under uforstyrrede forhold viste øget halveringstid for Cdc25A

Q110 (-15 minutter) versus Cdc25A

vægt. B. UV-stråling, efterfulgt af 30 minutters inkubation af 293F celler i 37 ° C, Cdc25A

Q110del viste mere stabilitet sammenlignet med Cdc25A

vægt. C. 293F celler udpladet på lige celletæthed og transficeret med samme mængde EGFP mærket Cdc25A

Q110del eller Cdc25A

vægt. Efter 72 timers transfektion, flowcytometri analyse gating lige stort antal EGFP-udtrykkende celler for hver isoform. Histogram viser intensiteten af ​​ekspressionen af ​​Cdc25A

Q110del-EGFP (gennemsnit 59,2) versus Cdc25A

wt-EGFP (gennemsnit 40,5) (t-test

P

= 0,05). D. samme population af celler, gated for EGFP-Cdc25A ekspression blev undersøgt for cellecyklus distribution. Den Cdc25A

wt-EGFP viste at arrestere i post G2 fase ( G2 /M) sammenlignet med kontrol (p = 0,055). De EGFP-Cdc25A

Q110del udtrykkende celler viste mindre ophobning af hyperploid cellepopulation på G2 /M-fasen og fremskyndet cellerne mere gennem mitose sammenlignet med EGFP-Cdc25A

wt udtrykkende celler (p = 0,0047). E. Cellernes levedygtighed assay af H1299 udtrykker Cdc25A

vægt versus Cdc25A

Q110del efter 24 timer af flere doser af UV-stråling. Cdc25A

Q110del udtryk reddet H1299 følsomhed over for UV-stråling i forhold til kontrolgruppen.

I 293F celler transficeret med enten Cdc25A

wt eller Cdc25A

Q110del og behandlet med 10 og 20 j /m

2 UV-stråling, celler transficeret med Cdc25A

Q110del viste en forøget proteinstabilitet 30 minutter efter UV-bestråling men ikke cellerne transficeret med Cdc25A

wt (fig. 3B).

for at få en mere kvantitativ måling af Cdc25A

Q110del og Cdc25A

vægt niveauer, vi målte den fluorescerende intensitet Cdc25A-EGFP fusionsproteiner gating lige antal 293F celler, der udtrykker Cdc25A

wt-EGFP eller Cdc25A

Q110del-EGFP og observerede et betydeligt højere niveau af fluorescerende intensitet i Cdc25A

Q110del-EGFP transfekterede celler (fig. 3C). Cellecyklus-analyse af den samme gatede population af celler, viste forøget stolpe G2 population (hyperploid celler) i Cdc25A

wt-EGFP-udtrykkende celler sammenlignet med Cdc25A

Q110del-EGFP, mens Cdc25A

Q110del -EGFP fremskyndet cellerne mere med posten G2 fase (mitose) sammenlignet med Cdc25A

wt (p = 0,0047) (fig. 3D). Dette antyder, at Cdc25A

Q110del kan ophæve G2 /M check point i forhold til den Cdc25A

vægt, kørsel cellerne mere gennem mitose [26], [27].

For at undersøge, om Cdc25A

Q110del kan påvirke overlevelsen af ​​NSCLC celler under forstyrrede tilstande, H1299-celler transficeret med Cdc25A

Q110del blev behandlet med UV-stråling i forskellige doser, H1299, der udtrykker Cdc25A

Q110del var mere resistente over for UV-induceret celledød sammenlignet til cellerne transficeret med kontrolvektoren eller Cdc25A

vægt, især ved høje UV doser (fig. 3E).

Cellulær lokalisering og mitotisk aktivitet af Cdc25A

Q110del

H1299 celler, viste Cdc25A

Q110del betydelig stigning i nukleare lokalisering end Cdc25A

vægt (fig. 4A). 24 timer efter UV-bestråling, cellerne transficeret med Cdc25A

Q110del viste højere proteinstabilitet omend den forøgede phosphorylering af den opstrøms DNA-skade respons (DDR) markering pChk1-ser345 (fig. 4B). Som ny peger Cdc25A som Cdc25 familiemedlem kræves for fuld aktivering af nukleare CDK1 [11], [28], [29], og siden Q110del er tættest på S116 – den CDK1 phosphoryleringssite kritisk til stabilisering Cdc25A i en feedback-sløjfe under mitose – [11], udover vores resultater, der viste Cdc25A

Q110del at drive cellerne mere gennem mitose i forhold til Cdc25A

wt (. figur 3D), vi perused at undersøge virkningen af ​​Cdc25A

Q110del på mitotisk aktivitet og på CDK1 aktivering. Efter transfektion 293F celler med Cdc25A

Q110del-EGFP, observerede vi en stigning i andelen af ​​celler i mitose fase, et fænomen, der ikke var set i de celler transficeret med Cdc25A

wt-EGFP (fig. 4C). Sammenlignet med celler transficeret med Cdc25A

wt-EGFP, cellerne transficeret med Cdc25A

Q110del-EGFP viste et lavere phosphorylering på CDK1- Tyr15, 24 timer efter transfektion (fig. 4D), som er konsistent med tilstedeværelsen af ​​mere aktive CDK1 at fremme G2 /M faseovergangen (fig. 3D). Faldet i den samlede CDK1 i Cdc25A

wt og Cdc25A

Q110del transficerede celler-sammenlignet forventes kontrol-, eftersom standsning på cellecyklussen G2 /M-fase (fig. 3D), kan forårsage undertrykkelse af CDK1 udtryk på transkriptionel niveau i en tid og celletype afhængig måde [30].

a. Immunblot af H1299 celler viste Cdc25A

Q110del at lokalisere mere i kernen i forhold til Cdc25A

wt. B. 24 timer efter UV-bestråling, viste Cdc25A

Q110del mere stabilitet i H1299 og svarede med mere fosforylering af DDR markør Chk1-ser345. C. konfokalmikroskopi af 293F celler efter 24 timer af transfektion: Cdc25A

Q110del udtryk viste hyppige mitotiske tal (metafase “tynde pile”). Co-ekspressionen af ​​Cdc25A

vægt og Cdc25A

Q110del på (01:01) ratio, mitotisk aktivitet var stadig bemærket (cytokinese, “fed pile”). Histogrammet repræsenterer hele pixel for FITC pr stand og rhodamin. D. pCDK1-Tyr15 dephosphorylering som downstream læser for relativ øget fosfatase aktivitet af Cdc25A

Q110del forhold til Cdc25A

vægt efter 24 timer af transfektion i 293F celler.

Cdc25A

Q110delexpression i NSCLC og dens tilknytning til kliniske parametre

for at afgøre, om der er en potentiel effekt af Cdc25A

Q110del udtryk i tumorer hos patienter med NSCLC, kvantificeret vi Cdc25A

Q110del udtryk i de primære tumorer og deres tilstødende parrede lungevæv fra 88 NSCLC-patienter. Cdc25A

Q110del udtryk varierede fra målbart at lukke til 100% af de samlede Cdc25A udskrifter i tumorerne, med 50% af tumorer, der udtrykker Cdc25A

Q110del på over 20% blandt de samlede Cdc25A udskrifter. Interessant nok mange af de tilstødende normale lungevæv fra samme lungecancerpatienter udtrykte også Cdc25A

Q110del, hvilket antyder, at dette er en tidlig begivenhed i lunge carcinogenese.

Vi analyserede derefter associering mellem ekspressionsniveauer af Cdc25A

Q110del i tumorvæv og kliniske patologiske parametre. Bortset fra en marginal tilknytning til adenocarcinom histologi (

P

= 0,068), blev der ikke anden forening observeret (Tabel S2 og S3). Specifikt var der ingen association med scenen, køn eller rygning historie. Men patienter, hvis tumorer havde højere Cdc25A

Q110del ekspressionsniveauerne viste en ikke-signifikant tendens til dårligere samlet overlevelse (

P

= 0,074 ved Log-rank test) (figur 5A;. Tabel S2). Det er interessant, når man tager i betragtning, Cdc25A

Q110del udtryk i de tilstødende normale lungevæv, vi observeret, at patienter, hvis tumorer udtrykte betydeligt højere Cdc25A

Q110del end deres parrede tilstødende normale lungevæv havde en signifikant dårligere samlet overlevelse (

P

= 0,0018 ved Log-rank test) (figur 5B;. tabel S4 og S5)

A.. Kaplan Meier overlevelseskurver viste Cdc25A

Q110del i tumorvæv at korrelere med dårlig samlet overlevelse NSCLC patienter (log rank

P

= 0,074). B. Kaplan Meier Overlevelseskurver viste, at når Cdc25A

wt er højere i tumor versus normale væv par, det korreleret med bedre samlet overlevelse (log rank

P

= 0,0018). Relativ Kvantificering af målgen “Cdc25A

wt” i NSCLC tumorvæv i forhold til normalt væv par NSCLC-patienter efter formlen: 2

-ΔΔct. Cdc25A skabelon af tumor eller normalt blev kørt tredobbelt af Uniplex reaktion for hver af de Ct

wt og Ct

tot assays, og middelværdien blev beregnet for hvert assay.

Diskussion

Cdc25A niveau reguleres stramt, så cellecyklusprogression og checkpoint overgang opretholdes i fysiologiske forhold [20], [26], [31] – [35]. Tidligere rapporterede vi, at Cdc25A ofte overudtrykt i NSCLC på transkriptionsniveauet [7]. I denne undersøgelse rapporterer vi identificering af en hidtil ukendt Cdc25A isoform, Cdc25A

Q110del, som er resultatet af en alternativ RNA-splejsning. Vi fandt, at Cdc25A

Q110del blev udtrykt i de fleste af NSCLC cellelinjer samt primære tumorer. Hertil kommer, at konstateringen af, at histologisk normalt væv støder op til kræft ofte udtrykt Cdc25A

Q110del indebærer, at det er en tidlig begivenhed og kan spille en vigtig biologisk funktion i lunge tumorigenese.

Cdc25A

Q110del mangler en glutamin i position 110, som støder op til 2 konserverede serin- phosphoryleringssteder i positionerne 116 og 124 (fig. 1). S116 kan phosphoryleres af Cdk1 at stabilisere Cdc25A i mitose via en positiv feedback loop, mens S124 kan phosphoryleres med Chk1, Chk2, og MAPKAPK-2 for at fremskynde Cdc25A omsætning [11], [14], [27], [36] . Ioniserende bestråling kan inducere phosphorylering af S124 gennem Chk1 og Chk2 kinaser [37], [38]. I en transgen dyremodel med S124 erstattet med en alanin blev Cdc25A fundet placeret i centrosomer og at Cdc25A niveauer blev ikke reduceret efter ioniserende bestråling [39]. I denne undersøgelse, vi observeret, at Cdc25A

Q110del har en forlænget protein halveringstid end Cdc25A

vægt, især efter UV-bestråling, hvilket tyder på, at Cdc25A

Q110del udtryk kan påvirke cellulære respons på de skader fremkaldt af ioniserende stråling . I overensstemmelse med dette begreb, fandt vi, at celler transficeret med Cdc25A

Q110del er resistente over for UV-induceret celledød end celler transficeret med kontrol-vektor eller Cdc25A

wt (fig. 3E), i overensstemmelse med en dybere aktivering af Cdk1 (fig. 4D).

Cdc25A fosfatase reguleres primært gennem proteinnedbrydning [8], [21], [31]. Phosphorylering af specifikke serin- eller threoninrester efter proteinkinaser, hovedsagelig Chk1, p38 og GSK-3β, er nødvendige for dets ubiquitinmedieret proteolyse [22], [37], [40], mens phosphorylering på S18 og S116 af CDK1 kan stabilisere Cdc25A [11]. Phosphorylering regulerer også beslaglæggelse af Cdc25A af 14-3-3 protein [41]. I vores undersøgelse, vi observeret, at Cdc25A

Q110del protein har en lavere omsætningshastighed, selv efter UV-bestråling (fig. 3B og 4B), og mere kerneakkumulation. To muligheder kan forklare disse observationer. For det første kan Q110 sletning i polypeptid producere betydelige konformationsændringer i umiddelbar nærhed og /eller nærliggende region, ændring af den bindende affinitet med sine kinaser, der fører til en lavere omsætningshastighed af Cdc25A

Q110del. For det andet kan Cdc25A

Q110del protein har en anden kapacitet til shuttle mellem cytoplasmatiske og nukleare rum via 14-3-3 proteiner [42]. Aminosyresekvensen umiddelbart forud Q110, RRIHSLP, udgør en konsensus 14-3-3 bindingssted, (R) RxxSxP [43]. Da bindingen af ​​14-3-3 til dets mål er fosforylering afhængig og er påvirket af sekvens kontekst, rejser dette interessante mulighed, at et ukendt protein kinase kan phosphorylere dette websted og påvirke handel med Cdc25A. Disse fund har potentiel betydning i forbindelse med resistens over for DNA-skader i celler med ektopisk udtrykker Cdc25A

Q110del (fig. 3E). Yderligere undersøgelser vil være nødvendige for at afgøre, om tumorer med højere Cdc25A

Q110del er mere modstandsdygtige over for DNA-ødelæggende midler eller strålebehandling, og hvis målrette Cdc25A

Q110del vil bevidstgøre disse tumorer til disse behandlinger [44].

en interessant observation er udtryk for Cdc25A

Q110del i de normale optræder lungevæv støder op til NSCLC, undertiden med høj overflod, hvilket tyder på abnormitet er en tidlig hændelse under lunge carcinogenese [44].