PLoS ONE: Photoimmunotherapy af mavekræft Peritoneal carcinomatose i en musemodel

Abstrakt

Photoimmunotherapy (PIT) er en ny kræftbehandling, der kombinerer specificitet af antistoffer til målretning tumorer med toksicitet fremkaldt af fotosensibilisatorer efter udsættelse for nær infrarød (NIR) lys. Vi udførte PIT i en model af dissemineret mavekræft peritoneal carcinomatose og overvåget effekt med

in vivo

GFP-fluorescens billeddannelse.

In vitro

in vivo

forsøg blev udført med et HER2-udtrykkende, GFP-udtrykkende, mavekræft cellelinje (N87-GFP). Konjugat bestående af en fotosensibilisator, IR-700, konjugeret til trastuzumab (TRA-IR700) fulgt af NIR lys blev anvendt til PIT.

In vitro

PIT blev vurderet ved måling cytotoksicitet med dødt farvning og et fald i GFP-fluorescens.

In vivo

PIT blev evalueret i et formidlet peritoneal carcinomatose model og en flanke xenograft hjælp tumor volumen målinger og GFP-fluorescens intensitet.

In vivo

anti-tumor effekter af PIT blev bekræftet ved betydelige reduktioner i tumor volumen (på dag 15, s 0,0001 vs. kontrol) og GFP-fluorescens intensitet (flanke model: på dag 3, PIT behandlet vs. kontrol p 0,01 og peritoneal dissemineret model: på dag 3 PIT behandlet vs. kontrol p 0,05). Cytotoksiske virkninger

in vitro

viste sig at være afhængig af lysdosis og forårsagede nekrotisk celle brud fører til GFP frigivelse og et fald i fluorescensintensitet

in vitro.

Således tab af GFP-fluorescens serveret som et nyttigt biomarkør for celle nekrose efter PIT

Henvisning:. Sato K, Choyke PL, Kobayashi H (2014) Photoimmunotherapy af gastrisk kræft Peritoneal carcinomatose i en musemodel. PLoS ONE 9 (11): e113276. doi: 10,1371 /journal.pone.0113276

Redaktør: Irina V. Lebedeva, Columbia University, USA

Modtaget: Juli 2, 2014 Accepteret: 21 oktober, 2014; Udgivet: November 17, 2014

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:. Forfatterne bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NIH Intramural programmet og JSP’er Research Fellowship. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Gastric karcinom forårsager mere end 740.000 kræftrelaterede dødsfald om året på verdensplan, især i Asien [1] – [3]. Hovedparten af ​​mavecancerpatienter stede med lokalt fremskreden, recidiverende eller metastatisk sygdom hinder helbredende operation, der er for det meste styres af ikke-helbredende terapi [1]. Peritoneal carcinomatose og levermetastaser er almindelige livstruende manifestationer af fremskreden mavekræft [1], [4]. Peritoneal carcinomatose forekommer også i æggestokkene, appendiceal, colon, pancreas og gastriske cancere. Prognose er universelt fattige og lokale behandlinger er uvægerligt mislykket med høje tilbagefald satser og sygelighed i forbindelse med ascites og tarmobstruktion. Systemisk terapi er også normalt mislykket. Således er der behov for nye metoder til behandling af peritoneal carcinomatose.

Photoimmunotherapy (PIT) er et nyt mål-celle specifik kræftbehandling, der beskæftiger et antistof fotosensibilisator konjugat (APSC) efterfulgt af nær infrarød (NIR) lys eksponering. En APSC består af en cancercelle-specifikt monoklonalt antistof (mAb) og en fotosensibilisator, IR700, som er en silica-phthalocyanin derivat kovalent konjugeret til antistoffet. Den APSC binder målmolekyler på cellemembranen og derefter inducerer næsten øjeblikkelig celle nekrose efter udsættelse for NIR lys ved 690 nm.

In vitro Salg undersøgelser har vist PIT at være yderst cellespecifik derfor ikke-udtrykkende celler umiddelbart tilgrænsende til målrettede celler viser ingen toksiske virkninger [5]. Celler behandlet med PIT undergå hurtig volumenekspansion fører til sprængning af cellemembranen, ekstrudering af celleindhold til det ekstracellulære rum, og irreversibel nekrose [6] – [8]. Vores resultater og andre viser, at cytotoksicitet induceret af PIT ikke fuldstændigt afhængige af reaktive oxygenspecies eller tilstedeværelsen af ​​singlet oxygen quenchere [9]. Endvidere cytotoksicitet induceret af PIT ligger primært inden for cellemembranen snarere inden mitokondrierne som forekommer med PDT.

Mens PIT resulterer i hurtig cellulær nekrose, kan den samlede mængde af tumoren ikke ændre i flere dage. Dette er fordi det tager mindst flere dage for makrofager til at indtaste, proces og efterlade den behandlede tumor. Derfor nye metoder, ud over størrelse målinger, der er nødvendige for at overvåge virkningerne af PIT. Fluorescens-proteiner (RP) er almindeligt anvendt til visualisering cellulære processer [10], [11]. Mens de fleste apoptotisk celledød resulterer i bevarelsen af ​​cellemembranen og fastholdelse af FP gør fluorescens ufølsom til celledød [12], [13], i PIT, den pludselige brud på cellemembraner resulterer i ekstrudering af cytoplasmatisk rammeprogrammerne og derfor en relativt hurtig udlæsning af celledød. En fordel ved rammeprogrammerne for

in vivo

billeddannelse er, at de ikke kræver ydre injektioner af midler (såsom luciferin i tilfælde af bioluminescens) og kan overvåges i realtid [14] – [18]. Da de kræver gen transfektion, ville de sandsynligvis kun være anvendelige i prækliniske undersøgelser.

I denne undersøgelse undersøgte vi effekten af ​​PIT i en musemodel af dissemineret peritoneal mavecancer ved anvendelse in vivo GFP-fluorescens billeddannelse til overvåge respons.

Materialer og metoder

Reagenser

Vandopløselig, silicium-phthalocyanin derivat, IRDye 700DX NHS ester og IRDye 800 CW NHS ester blev indhentet fra LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA). Panitumumab, et fuldt humaniseret IgG

2 mAb rettet mod EGFR, blev købt fra Amgen (Thousand Oaks, CA, USA). Trastuzumab, 95% humaniseret IgG

1 mAb rettet mod HER2, blev købt fra Genentech (South San Francisco, CA, USA). Alle andre kemikalier var af reagenskvalitet.

Syntese af IR700-konjugeret trastuzumab eller panitumumab, og IR800-konjugeret trastuzumab

Konjugation af farvestoffer med mAbs blev udført i overensstemmelse med en tidligere rapport [19]. Kort fortalt panitumumab eller trastuzumab (1 mg, 6,8 nmol) blev inkuberet med IR700 NHS-ester (60,2 ug, 30,8 nmol) eller IRDye 800 CW NHS-ester (35,9 ug, 30,8 nmol) i 0,1 mol /l Na

2HPO

4 (pH 8,6) ved stuetemperatur i 1 time. Blandingen blev oprenset med en Sephadex G50-søjle (PD-10; GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Proteinkoncentrationen blev bestemt med Coomassie Plus protein assay kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA) ved måling af absorptionen ved 595 nm med spektroskopi (8453 Værdisystem; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Koncentrationen af ​​IR700 eller IR800 blev målt henholdsvis ved absorption ved 689 nm eller 774 nm med spektroskopi for at bekræfte antallet af fluoroforen molekyler konjugeret til hvert mAb. Syntesen blev styret således, at gennemsnitligt fire IR700 molekyler og to IR800 molekyler bundet til et enkelt antistof. Vi udførte SDS-PAGE som en kvalitetskontrol for hvert konjugat som tidligere beskrevet [19]. Vi forkorte IR700 konjugeret til trastuzumab som tra-IR700, til panitumumab som pan-IR700 og IR800 konjugeret til trastuzumab som tra-IR800.

Cell kultur

N87-GFP celler stabilt udtrykker GFP blev købt fra ANTI CANCER (San Diego, CA, USA). Høj GFP-ekspression blev bekræftet i fravær af et selektionsmiddel med 10 passager. For at evaluere specifik celledrab af PIT blev 3T3-celler, der stabilt udtrykker DsRed (3T3 /dsRed) anvendt som en negativ kontrol [5]. Celler blev dyrket i RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin (Life Technologies) i vævskulturkolber i en fugtig inkubator ved 37 ° C ved en atmosfære af 95 % luft og 5% kuldioxid

fluorescens mikroskopi

at påvise antigen-specifikke lokalisering af IR700 konjugater og ændringen i cellemorfologi efter PIT blev fluorescensmikroskopi udført (IX61 eller IX81.; Olympus Amerika, Melville, NY, USA). Ti tusinde celler blev podet på cover-glas-bund skåle og inkuberet i 24 timer. Tra-IR700 blev derefter tilsat til dyrkningsmediet (phenolrødtfrit) ved 10 ug /ml og inkuberet ved 37 ° C i 6 timer. Cellerne blev derefter vasket med PBS; Propidiumiodid (PI) (1:2000) eller Cytox Blå (1:500) (Life Technologies) blev sat til mediet 30 min før PIT til påvisning døde celler. Cellerne blev derefter eksponeret for NIR lys og serielle billeder blev opnået. En dag efter PIT blev celler vasket og inkuberet med nyt medie efter PIT (0,5 J /cm

2) og PI blev igen tilsat. For at sikre, at den samme region blev afbildet markeringer blev foretaget på hver kultur fad for at angive, hvor billeddannelse blev erhvervet. Filteret blev indstillet til at detektere IR700 fluorescens med et 590-650 nm excitationsfilter og et 665-740 nm båndet passere emission filter. Analyse af billederne blev udført med ImageJ software (https://rsb.info.nih.gov/ij/).

flowcytometri

Fluorescens fra cellerne efter inkubation med pan-IR700 eller tra-IR700 blev målt ved anvendelse af et flowcytometer (FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) og CellQuest software (BD Biosciences). Celler (1 x 10

5) blev inkuberet med hvert konjugat i 6 timer ved 37 ° C. For at validere den specifikke binding af det konjugerede antistof blev overskydende antistof (50 ug) anvendes til at blokere 0,5 ug farvestof-antistof-konjugater [8]. Salg

In vitro PIT Salg

Et hundrede tusinde celler blev podet i plader med 24 brønde og inkuberet i 24 timer. Dyrkningsmedier blev erstattet med frisk dyrkningsmedium indeholdende 10 ug /ml tra-IR700 og cellerne blev inkuberet i 6 timer ved 37 ° C. Efter vask med PBS blev phenolrødtfrit dyrkningsmedium tilsat. Derefter blev cellerne bestrålet med NIR laserlys ved 685-695 nm bølgelængde (BWF5-690-8-600-0.37; B . W TEK INC, Newark, DE, USA). Selve effekttæthed på mW /cm

2 blev målt med en optisk powermeter (PM 100, Thorlabs, Newton, NJ, USA).

cytotoksicitet assay

De cytotoksiske virkninger af PIT med tra-IR700 blev bestemt ved flowcytometrisk PI farvning, der registrerer kompromitterede cellemembraner. For flowcytometrisk assay blev celler trypsiniseret 1 time efter behandling og vasket med PBS. PI blev tilsat i cellesuspensionen (endelig 2 ug /ml) og inkuberet ved stuetemperatur i 30 minutter, efterfulgt af flowcytometri.

Estimering af GFP-fluorescens intensitet in vitro

Et hundrede tusinde celler blev podet på cover-glas-bund skåle og inkuberet i 12 timer. Tra-IR700 blev derefter tilsat til dyrkningsmediet (phenolrødtfrit) ved 10 ug /ml og inkuberet ved 37 ° C i 6 timer. Cellerne blev vasket med PBS og erstattes med en ny, phenolrødtfrit dyrkningsmedium og undersiden af ​​dækslet glas blev mærket (til at bestemme positionen af ​​observation). Efter PIT blev cellerne inkuberes igen i 1 dag. En dag efter PIT blev cellerne igen observeret. GFP intensitet blev evalueret med samlede pixels med samme tærskel inden for samme område [20]. Analyse af billederne blev udført med ImageJ software (https://rsb.info.nih.gov/ij/).

Fluorescens fra behandlede celler blev også målt under anvendelse af et flowcytometer (FACS Calibur).

Animalske og tumormodeller

Alle

in vivo

procedurer blev udført i overensstemmelse med vejledningen for pasning og anvendelse af forsøgsdyr Resources (1996), US National Research Council, og godkendt af NIH Animal Care og brug Udvalg. Seks- til otte uger gamle hun homozygote athymiske nøgne mus blev købt fra Charles River (NCI-Frederick). For at evaluere kun den direkte tumorcelle dræbende virkning af

in vivo

PIT, immunkompromitterede nøgne mus blev anvendt. Under procedurer blev musene bedøvet med isofluran. Ti millioner N87-GFP-celler blev injiceret subkutant i højre dorsum af musene. For at bestemme tumorvolumen blev den største langsgående diameter (længde) og den største tværgående diameter (bredde) målt med en ekstern skydelære. Tumor mængder baseret på caliper målinger blev beregnet ved følgende formel; tumorvolumen = længde x bredde

2 × 0,5. Tumorer Når cirka 100 mm

3 volumen blev udvalgt til undersøgelsen. For at måle GFP-fluorescens efter PIT blev ti millioner N87-GFP-celler subkutant injiceret i begge dorsi af musene. For dissemineret peritoneal cancer musemodel blev halvtreds millioner N87-GFP-celler med PBS (total 300 uL) injiceret i den peritoneale kavitet.

In vivo fluorescensafbildning

In vivo

fluorescensbilleder blev opnået med et Pearl Imager (LI-COR Bioscience) til påvisning af IR700 /IR800 fluorescens, og en Maestro Imager (CRi, Woburn, MA, USA) for GFP. For GFP, blev et band-pass filter fra 445 til 490 nm (excitation) og en lang-pass blå filter løbet 515 nm (emission) anvendes. Den justerbar emission filter blev automatisk trådte i 10 trin nm 500-600 nm for de grønne filtersæt ved konstant eksponering (500 ms). De spektrale fluorescensbilleder består af autofluorescens spektre og spektrene fra GFP (N87-GFP tumor), som blev derefter ublandede, baseret på den karakteristiske spektrale mønster af GFP under anvendelse Maestro software (CRI). Regioner af interesse (ROIs) blev manuelt trukket enten på flanken tumor eller over maveregionen alt efter model og fluorescensintensiteten blev målt [19].

Karakterisering af dissemineret peritoneal musemodel

Mus med enten dissemineret peritoneal cancer (ved 6 uger efter celleimplantation) eller flanke-tumorer (ved 7 dage efter celleimplantation) blev injiceret intravenøst ​​med 100 ug tra-IR700 og tra-IR800. En dag efter injektion blev serielle billeder udført med en Pearl Imager at opdage IR700 /IR800 fluorescens, og Maestro for GFP. Hvidt lys billeder af musene blev opnået med en iphone5 (Apple Inc., Cupertino, CA, USA).

In vivo PIT

For at vurdere effekten af ​​PIT i flanken model blev N87-GFP tumorbærende mus randomiseret i 4 grupper på mindst 10 dyr per gruppe som følger: (1) ingen behandling (kontrol); (2) Kun NIR lys eksponering ved 50 J /cm

2 på dag 1 og 100 J /cm

2 på dag 2; (3) 100 ug tra-IR700 intravenøst, ingen NIR lys eksponering; (4) 100 ug tra-IR700 intravenøst ​​blev NIR lys indgivet med 50 J /cm

2 på dag 1 efter injektion og 100 J /cm

2 på dag 2 efter injektion. Disse betingelser blev anvendt hver uge i op til 3 uger. Mus blev overvåget dagligt, og fluorescens billeder blev opnået begyndende 1 dag før PIT, og tumorvolumener blev målt tre gange om ugen, indtil tumoren diameter nåede 2 cm, hvorefter musene blev aflivet med carbondioxid. Til fluorescens billeddannelse blev mus injiceret med 100 ug tra-IR700 eller bestrålet som følger: (1) NIR lys blev indgivet med 50 J /cm

2 på dag 1 efter injektion og 100 J /cm

2 om dag 2 til højre tumor (2) ingen NIR lys blev administreret til venstre tumor, der tjente som kontrol. Controls inkluderet (1) kun NIR lys eksponering ved 50 J /cm

2 på dag 1 og 100 J /cm

2 på dag 2 til højre tumor; (2) ingen behandling for den venstre tumor

At evaluere formidles peritoneal cancer, blev mus randomiseret i 4 grupper af 5 dyr pr gruppe for følgende behandlinger:. (1) ingen behandling (kontrol); (2) Kun NIR lys eksponering ved 50 J /cm

2 på dag 1 og 100 J /cm

2 på dag 2; (3) 100 ug tra-IR700 intravenøst, ingen NIR lys eksponering; (4) 100 ug tra-IR700 iv blev NIR lys indgivet med 50 J /cm

2 på dag 1 og 100 J /cm

2 på dag 2 efter injektion.

Statistisk analyse

data er udtrykt som middelværdi ± SEM fra mindst fire forsøg, medmindre andet er angivet. Statistiske analyser blev udført under anvendelse af en statistik program (GraphPad Prism, GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). For multiple sammenligninger, blev anvendt en envejs variansanalyse (ANOVA) med post test (Kruskal-Wallis test med post-test) og Tukey test. Den kumulative sandsynlighed for overlevelse, bestemmes heri som tumor diameter ikke når 2 cm, blev anslået i hver gruppe ved anvendelse af Kaplan-Meier overlevelse kurveanalyse, og resultaterne blev sammenlignet med log-rank test og Wilcoxon test. Studerendes

t

test blev også brugt til at sammenligne de to

in vitro

undersøgelse; p 0,05 blev anset for at indikere en statistisk signifikant forskel

Resultater

Bekræftelse af udtryk profil N87-GFP celler som et mål for PIT

Vi undersøgte fluorescens signaler. af pan-IR700 og tra-IR700 bundet til N87-GFP celler ved FACS. Efter 6 timer inkubation med enten pan-IR700 eller tra-IR700, N87-GFP celler konsekvent viste højere lysstyrke med tra-IR700 end pan-IR700 (fig. 1A). Disse signaler blev næsten fuldstændigt blokeret ved tilsætning af overskud af trastuzumab eller panitumumab, tyder specifik binding og bekræfter højere ekspression af HER2 end EGFR [21]. Disse data antydede, at HER2 var den foretrukne mål for PIT i N87-GFP-celler på grund af dens højere ekspression.

(A) Ekspression af HER1 og HER2 i N87-GFP-celler blev undersøgt med FACS. HER2 blev overudtrykt mere end HER1. Specifik binding blev påvist ved hjælp af antistof blokering. (B) N87-GFP celler blev inkuberet med tra-IR700 for 6 timer og observeret ved mikroskopi (Før og efter bestråling af NIR lys, 2 J /cm

2). Nekrotisk celledød blev observeret ved excitation med NIR lys (efter 30 min). Bar = 25 um. PI-farvning viste skaden membran. (N = 4, * p 0,001 vs. ubehandlet kontrol Students t-test) blev (C) Membran beskadiget af PIT målt med de døde celletal under anvendelse PI-farvning, som steg på en måde, afhængig af den lysdosis. (D) N87-GFP-celler blev inkuberet med tra-IR700 i 6 timer og bestrålet med NIR-lys (0,5 J /cm

2). GFP-fluorescensintensitet faldt i døde celler, men var uændret i levende celler ved 1 dag efter PIT (*). Bar = 200 um. Den sorte linje til højre øvre hjørne var markøren til at bestemme positionen for observation. (E) Faldende GFP-fluorescensintensitet ved 1 dag efter PIT forekom på en måde, afhængig af den lysdosis (total pixel af GFP-fluorescens i den samme) (n = 12 felter) (** P 0,0001 vs. ubehandlet kontrol Students t-test). (F) Diminishing GFP-fluorescens intensitet induceret af PIT, som målt ved FACS, bekræfter en NIR-lysdosis-afhængighed. (N = 4, *** P 0,0001, vs. ubehandlet kontrol, Students t-test)

Mikroskopi af in vitro PIT

Serial fluorescens mikroskopi af N87-GFP celler. blev udført før og efter PIT. Efter eksponering for NIR lys (2 J /cm

2) cellulær hævelse, blæredannelse og sprængning af lysosomer blev observeret, hvilket resulterede i ekstrudering af cytoplasma ekstracellulært (fig. 1B). PI farvning viste akutte skader cytotoksisk membran forårsaget af PIT. De fleste af disse cellulære ændringer blev observeret inden for 30 min af lys eksponering (Støtte Information video S1 og S2). Der blev ikke påvist signifikante ændringer i EGFR-negative 3T3-celler bestrålet med NIR lys, hvilket tyder på PIT inducerede ingen skader i uden for målgruppen celler (Fig. S1).

Evaluering af in vitro PIT effekt

for at kvantificere virkningen af ​​

in vitro

PIT udførte vi en cytotoksicitet assay baseret på inkorporering af PI, som viste, at celledød øges med stigende lysdosis (fig. 1C). Ingen signifikant cytotoksicitet blev påvist med NIR lys eksponering eller tra-IR700 alene.

Evaluering med GFP-fluorescens in vitro efter PIT

En dag efter udsættelse for NIR lys på 0,5 J /cm

2, omkring 50% af celler viste akut cytotoksicitet (fig. 1C), og GFP-fluorescensintensitet blev stærkt reduceret i døde celler (farvet positive med PI), mens GFP-fluorescens blev bevaret i overlevende celler (fig. 1D). Disse undersøgelser antyder, at GFP blev ekstruderet fra cellen efter membran brud. For at undersøge ændringen i GFP-fluorescens, sammenlignede vi samlede GFP pixels i samme område før og én dag efter PIT (Fig. S2). Den GFP-fluorescens-forholdet faldt direkte med lys dosis, mens nogen nedgang blev påvist med NIR lys eksponering eller tra-IR700 alene (fig. 1E). Disse resultater blev bekræftet ved FACS-analyse (fig. 1F og fig. S3), og antyder, at PIT fører til et fald af GFP-fluorescens efter nekrotisk celledød ved 1 dag efter PIT på en måde, afhængig af den lysdosis.

In vivo PIT reducerer tumor volumen i flanken xenograftmodel

Dernæst undersøgte vi effekten af ​​PIT

in vivo

på flanke tumor bærende mus (fig. 2A). PIT inducerede signifikante reduktioner i tumorvolumen (n = 10 i hver gruppe, * p = 0,0456 0,05, Tukeys test). Fire mus ud af ti i PIT gruppe blev fuldstændigt helbredt ved behandlingen (fig. 2B). Overlevelse blev forlænget betydeligt i PIT-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen (n = 10 i hver gruppe, ** p 0,0001, lang-rank test og Wilcoxon test) (figur 2C).. Disse data tyder på, at PIT forårsagede betydelig reduktion tumor og forlænget overlevelse

in vivo

.

(A) PIT regime. (B) PIT fører til N87-GFP reduktion flanke tumorvolumen (n = 10 mus i hver behandlingsgruppe; * p = 0,0456 0,05 vs. APSC), Tukey test med ANOVA). Behandling er indiceret under grafen. (C) Gentagen PIT fører til forlænget overlevelse i N87-GFP tumorbærende mus (n = 10 mus i hver behandlingsgruppe, ** P 0,0001), Long-rank test og Wilcoxon test). Komplet tumor drab blev opnået for 4 mus af 10 i PIT-gruppen efter re-behandling.

GFP-fluorescens billeddannelse efter In vivo PIT i flanken xenograftmodel

For at overvåge

in vivo

PIT, real-time GFP billeddannelse blev udført i mus med N87-GFP bilateral flank tumorer (fig. 3A). GFP-fluorescens demonstrerede tumor byrde og reaktionen på PIT. GFP-fluorescens blev korreleret med IR700 fluorescens, som hurtigt faldt efter PIT (fig. 3C). Totale fluorescens billeddannelse (TFI) af GFP i ubehandlede tumorer (kontrol) og i tumorer der modtager lys kun steg på grund af tumorvækst. I tumorer behandlet med PIT, TFI af GFP faldt gradvist i den behandlede tumor, mens det modsatte tumor i samme mus (kun iv, intet lys) påviste øget GFP-fluorescens (fig. 3B).

(A) PIT regime. Fluorescensbilleder blev opnået ved hvert tidspunkt som angivet. (B)

In vivo GFP

fluorescens realtid billeddannelse af bilateral flanke tumor bærende mus som reaktion på PIT. Tumoren behandles af PIT viste faldende GFP-fluorescens efter PIT. (C) Kvantitativ analyse af GFP fluorescensintensiteter (samlet intensitet /tumor) i N87-GFP tumorbærende mus viste signifikant nedsat fluorescens mellem kontrolgruppen og PIT-gruppen (n = 5 mus i hver gruppe, (* p = 0,0118 0,05, vs. kontrol) (* p = 0,0016 0,01, vs. NIR lys) (* p = 0,0012 0,01, vs. APSC) (** p = 0,0010 0,01, vs. kontrol) (** p = 0,0003 0,001, vs. NIR lys) (** p = 0,0003 0,001, vs. APSC) (*** p = 0,0049 0,01, vs. kontrol) (*** p = 0,0039 0.01, vs. NIR-lys) (*** p = 0,0012. 0,01, vs. APSC), Tukey test med ANOVA)

Kvantificering af total GFP-fluorescens intensitet afslørede, at der var en signifikant fald efter PIT (n = 5 mus i hver gruppe, * p = 0,0118 0,05, ** p = 0,0010 0,01, *** p = 0,0049 0,01, Tukeys test med ANOVA) (. fig 3C) . På grund af tumor re-vækst, GFP steg igen fra dag 4 efter PIT, selv om det var lavere end andre kontrolgrupper. Den realtid GFP-fluorescens billeddannelse og dens kvantificering aktiveret realtid sammenligning af grupperne og viste en stærk sammenhæng mellem højere GFP-fluorescens og tumor progression i hver gruppe.

For at bekræfte denne effekt,

ex vivo

analyse blev udført (fig. 4A). PIT virkning blev bekræftet med et fald i IR700 fluorescens (fig. 4B). Under denne betingelse, GFP intensitet

ex vivo Salg tumorer faldt efter PIT (fig. 4B). Disse data tyder på, at real-time GFP direkte billedvisning er i overensstemmelse med

ex vivo

billeddannelse.

(A) PIT regime. Fluorescensbilleder af

ex vivo Salg tumorer blev opnået ved hvert tidspunkt som angivet. (B)

Ex vivo

fluorescens billeddannelse af N87-GFP tumor i respons på PIT. Fluorescens ændringer er set med både GFP og IR700 fluorescens i reaktion på PIT. (C) Fluorescens-billeder blev opnået ved hvert tidspunkt som angivet. (D)

In vivo

fluorescens realtid billeddannelse af bilateral flanke tumor bærende mus som reaktion på gentagne PIT. GFP-fluorescensintensitet af tumoren blev næsten elimineret efter den anden PIT.

Når PIT blev gentaget ugentligt, GFP-fluorescens aktivitet sidst forsvandt (fig. 4C og D), hvilket viser fuldstændig aflivning af tumoren.

Karakterisering af dissemineret peritoneal model med fluorescens billeddannelse

for at bestemme den naturlige historie formidles peritoneal model blev seriel fluorescens billeddannelse udført. De implanterede tumorer demonstrerede højt fluorescenssignal med IR700, IR800, og GFP, som alle co-lokaliseret med hinanden (IR800 blev anvendt for at undgå intestinal autofluorescens) (fig. 5). Disse data tyder på, at kan overvåges denne model af dissemineret peritoneal cancer i levende mus ved hjælp af GFP-fluorescens.

In vivo

GFP-fluorescens billeddannelse af en N87-GFP flanke tumor og formidles peritoneal model. Colokalisering af tra-IR700 og tra-IR800 blev bekræftet i peritoneal dissemineret tumor med fluorescens billeddannelse. Intravenøs injektion af midlet kan nå disseminerede tumorer i bughulen. For at undgå auto-fluorescens i tarmen, blev tra-IR800 anvendes såvel som tra-IR700.

GFP-fluorescens billeddannelse efter In vivo PIT i dissemineret peritoneal model

Real-tid GFP-fluorescens billeddannelse blev udført på dissemineret peritoneal model før og efter PIT (fig. 6A). IR700 fluorescens faldt efter PIT (fig. S4). GFP TFI steg gradvist i de ikke-PIT-grupper på grund af tumorvækst. I PIT behandlede gruppe, GFP TFI faldt fra 1 dag til 3 dag efter PIT (fig. 6B). Kvantificering af total GFP-fluorescens intensitet afslørede et signifikant fald efter PIT (n = 5 mus i hver gruppe, * p = 0,0295 0,05, ** p = 0,0355 0,05, Kruskal-Wallis test med post-test) (fig. 6C). På grund af den tumor genvækst, GFP steg igen fra 4 dag efter PIT, selv om det holdes under andre grupper, som observeret med flanken tumor model. Således PIT forårsaget betydelig målrettet tumor dræbende virkning i både flanken og formidles peritoneal tumormodeller og dette kunne blive overvåget med GFP TFI.

(A) PIT regime. Real-time GFP-fluorescens billeddannelse blev opnået ved hvert tidspunkt angivet. (B)

In vivo

realtid fluorescens billeddannelse som reaktion på PIT. (C) Kvantitativ analyse af GFP fluorescensintensiteter viste signifikante fald ved dag 3 efter PIT mellem kontrolgruppen og PIT-gruppe (n = 5 mus i hver gruppe, (* p = 0,0295 0,05 over NIR lys) (** p = 0,0489 0,05 vs. kontrol) (** p = 0,0355. 0,05 vs. APSC), Kruskal-Wallis test med post-test)

diskussion

Denne undersøgelse viser, at kan overvåges virkningen af ​​PIT med GFP-fluorescens billeddannelse. I modsætning til apoptose [12], [13], hvor GFP og relaterede fluorescerende proteiner bliver lysere på grund af den faldende cytoplasmatiske volumen, under nekrotisk celledød med PIT, skader membran fører til frigivelse af cytoplasmatiske indhold, herunder GFP. Denne unikke egenskab af GFP og relaterede fluorescerende proteiner gør dem brugbare biomarkører for PIT.

In vivo

GFP-fluorescens billedbehandling giver den fulde proces med tumorigenese, behandling, regression, metastaser, eller fornyet, til påvises i det samme dyr uden invasive procedurer [10], [11]. Ved at anvende celler, der udtrykker cytoplasmatisk GFP, kunne antitumorvirkninger induceret af PIT let overvåges på grund af ekstrudering af GFP fra behandlede celler.

Konceptet med at anvende målrettede lys terapi er mere end tre årtier gamle [22]. På grund af den hydrofobicitet traditionelle fotodynamisk terapi (PDT) sensibilisatorer, er farmakokinetikken af ​​antistof konjugeret PDT-midler stærkt begrænset i sin evne til at levere konjugater til målet. Derfor har PDT sensibilisatorer målrettet med antistoffer kun været succesfuld i modeller, hvor konjugatet blev injiceret direkte i tumoren eller bughinde [23]. For at kunne levere et antistof-fotosensibilisator-konjugat (APSC) systemisk, bør fotosensibilisatoren være fortrinsvis hydrofil. Den hydrofile phthalocyanin-baserede fotosensibilisator, IR700DX når den er konjugeret til et antistof bliver en APC, som kan indgives intravenøst. Denne form for terapi, betegnet PIT, adskiller sig fra traditionelle PDT ikke kun i hydrofilicitet fotosensibilisatoren, men også i sin afhængighed af NIR lys for at aktivere fotosensibilisatoren. NIR lys har bedre vævsgennemtrængning end lavere bølgelængde lys, der anvendes i PDT. Denne nye generation af APC’er demonstrerer lignende intravenøse farmakokinetik for åben antistoffer, hvilket resulterer i meget målrettet tumorakkumulering med minimal non target-bindende og kan anvendes til et bredt spektrum af antistoffer, så mange potentielle anvendelser i hele kroppen.

Trods cytotoksisk kemoterapi, resultatet for fremskreden mavekræft forbliver fattige. Fordi de fleste patienter med peritoneale metastaser til stede med snigende symptomer såsom dårlig appetit, vægttab, oppustethed følelse, smerte eller anæmi diagnose er ofte forsinket og lokale terapier er ikke længere mulig [24]. PIT er en lovende fremgangsmåde til behandling af dissemineret peritoneal cancer. For at kunne udføre en effektiv PIT bør APSC leveres systemisk og lyset skal påføres selektivt til peritoneum. Under disse betingelser der er tilstrækkelig levering af APSCs at resultere i reduktion af formidles tumorer efter PIT. Denne proces kan overvåges med realtid

in vivo

GFP-fluorescens billeddannelse.

Der er flere begrænsninger for denne undersøgelse. Det skal bemærkes, at ikke alle gastriske cancere udtrykker HER2 og derfor kan TRA-IR700 ikke være ensartet effektive i dissemineret gastrisk cancer. Faktisk kan det være nødvendigt at anvende en cocktail af APSCs til effektivt at dække de fleste af de udtryk profiler i en given tumor [25].