PLoS ONE: androgen Regulering af 5α-reduktase-isoenzymer i prostatakræft: Konsekvenser for prostatakræft Prevention

Abstrakt

Enzymet 5α-reduktase, der omdanner testosteron til dihydrotestosteron (DHT), udfører vigtige funktioner i androgen receptor (AR) signalvejen. De tre isoenzymer af 5α-reduktase identificeret til dato er kodet af forskellige gener:

SRD5A1

,

SRD5A2

, og

SRD5A3

. I denne undersøgelse undersøgte vi mekanismer bag androgen regulering af 5α-reduktase isoenzym ekspression i humane prostata celler. Vi fandt, at androgen regulerer mRNA-niveauet af 5α-reduktase isoenzymer i en celletype-specifik måde, at en sådan regulering sker på det transskriptionelle niveau, og at AR er nødvendig for denne regulering. Desuden tyder vore resultater, at AR rekrutteres til en negativ androgen responselement (nare) af promotoren af ​​

SRD5A3 in vivo

og gælder binder til Nare

in vitro

. De forskellige ekspressionsniveauer af 5α-reduktase isoenzymer kan give respons eller resistens over for 5α-reduktase-inhibitorer og således kan have betydning i forebyggelse af prostatacancer

Henvisning:. Li J, Ding Z, Wang Z, Lu JF, Maity SN, Navone NM, et al. (2011) Androgen forordning af 5α-reduktase-isoenzymer i prostatakræft: Konsekvenser for Prostata Cancer Prevention. PLoS ONE 6 (12): e28840. doi: 10,1371 /journal.pone.0028840

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA

Modtaget: Maj 16, 2011; Accepteret: November 16, 2011; Udgivet: December 14, 2011

Copyright: © 2011 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev finansieret af Prostate Cancer Research Program på MD Anderson Cancer center og delvist understøttet af National Institutes of Health gennem MD Andersons Cancer center Support Grant, CA016672. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

flerårig, flertrins proces med prostata carcinogenese og dens lange latenstid gør prostatakræft ideel til kemoforebyggelse [1]. Androgen receptor (AR) signalvejen, som er afgørende for prostata udvikling og normal funktion, er også central for prostatakræft s patogenese og progression [2], [3]. Nøgleenzymet i AR signalering, 5α-reduktase, omdanner testosteron til det mere potente androgen dihydrotestosteron (DHT) [4]. Selvom testosteron kan binde til og aktivere AR, DHT binder sig til det med en dissociation rate tre gange langsommere end for testosteron [5], [6].

Tre isoenzymer af 5α-reduktase, som er kodet af forskellige gener (

SRD5A1

,

SRD5A2

, og

SRD5A3

), er blevet identificeret. Immunohistokemisk og polymerasekædereaktion (PCR) analyser af humane prostatavæv antyder, at SRD5A1 og SRD5A2 niveauer ændre sig med prostatakræft udvikling og progression [7], [8], [9].

In vitro

undersøgelser har bekræftet den 5α-reduktase aktivitet mere-nylig identificeret SRD5A3 [10], som blev overudtrykt i hormon-refraktær prostatakræft væv [10], [11]. Knockdown af

SRD5A3

udtryk reducerede også væksten og levedygtigheden af ​​prostata kræftceller [10]. Ved anvendelse af et monoklonalt antistof, Godoy et al. viste desuden øget niveau af SRD5A3 protein i prostatacancer sammenlignet med benign prostata væv [12]. Disse resultater antydede, at SRD5A3 kan bidrage til prostatakræft progression. Det er også blevet nylig rapporteret, at SRD5A3 kan spille en vigtig rolle i proteinglycosylering [13]. Mutationer af

SRD5A3

medføre medfødte lidelser [13], [14] og Kahrizi syndrom [15].

To 5α-reduktasehæmmere er blevet testet klinisk. Finasteride specifikt hæmmer SRD5A2 aktivitet [16], og dutasteride hæmmer det både SRD5A1 og SRD5A2 [17]. Den Cancer Prevention Trial Prostata (PCPT) gav opmuntrende resultater: finasterid reduceret den samlede forekomst af prostatakræft med 25%, selv om de potentielle virkninger af high-grade tumorer vedrørende [18]. Tilsvarende reduktion af Dutasteride af prostatakræft Events (Reducer) forsøg viste, at dutasterid reducerede forekomsten af ​​prostatakræft med 23% blandt mænd med høj risiko og viste ingen statistisk signifikant stigning af høj kvalitet tumor i dutasterid-behandlede mænd [19] , [20].

Tre faktorer kan give respons eller modstand til 5a-reduktase hæmmere. Først respons eller modstand kan skyldes tilstedeværelsen af ​​forskellige isoenzymer [21]. For det andet kan forskelle i følsomhed tillægges af

SRD5A2

genotypiske varianter [22]; Makridakis et al. [23] viste

in vitro Hoteller, som

SRD5A2

varianter har forskellige tilhørsforhold til finasterid. Tredje, forskellige ekspressionsniveauer af 5α-reduktase isoenzymer kunne bidrage til både følsomhed og modstand. I modsætning androgen ablation, hvilket nedsætter prostatisk testosteron og DHT inhibering af 5α-reduktase aktivitet falder DHT men øger testosteron [24], [25], [26]. Da 5α-reduktase-inhibitorer ændrer testosteron-til-DHT-forhold, og i betragtning af den kritiske rolle 5α-reduktase i AR signalering kan de forskellige 5α-reduktase ekspressionsniveauer give fingerpeg om respons og modstandsdygtighed over for 5a-reduktase-inhibitorer i forebyggelse prostatacancer .

Androgener kan påvirke ekspressionen af ​​

SRD5A1

SRD5A2

i forskellige væv og celletyper. Hos rotter ventrale prostata, positiv regulering af

SRD5A2

af androgen er blevet rapporteret [27], og rotten testiklerne, negativ regulering af

SRD5A1

[28]. Androgen ablation førte til nedsat immunfarvning af 5α-reduktase [29].

SRD5A1

og

SRD5A2

, reguleres også af testosteron og DHT i T- og B-lymfoide celler [30] og i rotte lever og hjerne [31], [32], [33], [ ,,,0],34]. Men hvor 5α-reduktase ekspression reguleres i humane prostata celler er ikke blevet grundigt undersøgt.

Vores primære formål med denne undersøgelse var således at evaluere androgen regulering af 5α-reduktase-isoenzymer i humane prostata celler. Vi yderligere undersøgt, om de regulatoriske effekter af androgener på 5a-reduktaser er medieret af AR og om der foreligger en direkte interaktion mellem

cis

reguleringsmyndigheder elementer af 5α-reduktase isoenzymer og AR.

vores data viste celletype-specifik androgen regulering af isoenzymer, der er medieret af AR. Så vidt vi ved, er dette den første påvisning af, at AR kan direkte binde til det negative androgen responselementet (nare) i

SRD5A3

promotor i LNCaP-prostatacancerceller. Vores resultater kan have kliniske implikationer for identificering mænd, hvis sygdom kan have gavn af 5α-reduktasehæmmere.

Materialer og metoder

Cellelinjer og kulturer

PWR-1E, LNCaP, og VCap celler blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA); BPH-1-GFP, BPH-1-AR, og C4-2B4 celler var en gave fra Dr. Sue-Hwa Lin (The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX); og LAPC-4-celler blev venligst leveret af Dr. Robert Reiter (University of California, Los Angeles, CA).

PWR-1E celler blev holdt i serumfrit keratinocyt-medium (Invitrogen, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA) suppleret med 50 ug /ml oksehypofyseekstrakt, 5% L-glutamin og 5 ng /ml epidermal vækstfaktor. LNCaP blev C4-2B4, BPH-1-GFP, og BPH-1-AR-celler opretholdt i RPMI-1640 medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin og streptomycin (P /S). LAPC-4-celler blev opretholdt i Iscoves modificerede Dulbeccos medium (Invitrogen) suppleret med 5% FBS og 1% P /S. VCap celler blev opretholdt i Dulbeccos Modified Eagles Medium suppleret med 10% FBS og 1% P /S. Alle kulturer blev holdt ved 37 ° C i befugtet luft med 5% CO

2. Cellelinjer blev valideret på MD Anderson Karakteriseret cellelinje Core af STR DNA fingeraftryk ved hjælp af AmpFℓSTR Identifiler kit (Applied Biosystems, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). De STR profiler blev sammenlignet med de kendte ATCC fingeraftryk, til Cell Linje Integreret Molekylær Authentication Databaseversion 0.1.200808 (https://bioinformatics.istge.it/clima/) [35], og til MD Andersons fingeraftryksdatabase. STR profiler af PWR-1E, LNCaP, C4-2B4, og VCAP celler matchede kendte DNA-fingeraftryk; dem af BPH-1-AR og LAPC-4-celler var unikke.

Kvantitativ revers-transkription-PCR (QRT-PCR)

Totalt RNA blev ekstraheret fra hver cellelinje ved anvendelse af et RNeasy Plus mini kit (Qiagen Inc., Valencia, CA) ifølge fabrikantens protokol. QRT-PCR blev udført ved anvendelse af en TaqMan One-Step RT-PCR-kittet (Applied Biosystems, Life Technologies Corp.) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Kort fortalt QRT-PCR indstilling for hver reaktion var 48 ° C i 30 minutter, 95 ° C i 10 minutter, og 42 cykler ved 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 minut. Humant β-actin blev anvendt som den endogene kontrol i hver reaktion. Primer og prober til

SRD5A1

,

SRD5A2

, og

SRD5A3

gener var også fra Applied Biosystems.

Androgen behandling

Testosteron og DHT indkøbtes fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). R1881, et syntetisk androgen, blev venligst stillet til rådighed af Dr. Sue-Hwa Lin. Celler blev podet i 12-brønds plader med deres regelmæssige vækstmedium. Efter serumudsultning natten over, blev celler eksponeret for ethanol (kontrol) eller 1 nM, 10 nM eller 100 nM androgen. Efter 24 timer og 48 timers inkubation blev cellerne høstet og RNA udvundet for QRT-PCR-analyse.

Actinomycin D behandling

BPH-1-AR, LNCaP, og PWR-1E celler blev behandlet med dimethylsulfoxid (DMSO; kontrol) eller 1 ug /ml eller 5 ug /ml actinomycin D i 30 minutter, efterfulgt af ethanol (kontrol) eller 10 nM DHT. Efter 24 timers inkubation blev cellerne høstet, og totalt RNA udvindes.

Transfektion med små interfererende RNA (siRNA)

For at vælte AR udtryk, vi seedet LNCaP celler i 12-brønds plader, serum sultet dem natten over og derefter transficeres dem med 20 nM AR siRNA eller kontrol siRNA ved hjælp DharmaFECT 1 (Dhamarcon, Inc., Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO). Efter inkubering natten over blev cellerne eksponeret for ethanol (kontrol) eller 2 nM DHT. Ar siRNA og kontrol siRNA blev opnået fra Dhamarcon.

Western blot-analyse

Efter 24 timers inkubation med siRNA, blev cellerne høstet og centrifugeret ved 5.000 rpm i 5 minutter. Cellepellets blev resuspenderet i RIPA-puffer (Boston Bioproducts, Inc., Ashland, MA) med proteasehæmmer (Roche, Mannheim, Tyskland), inkuberet i 20 minutter med lejlighedsvis hvirvelblanding, og derefter centrifugeret ved 14.000 rpm i 10 minutter. Supernatanten blev dekanteret og gemt til Western blotting. Proteinet-ekstraktionsprocedure hele blev udført ved 4 ° C, og proteinkoncentrationen blev målt ved anvendelse af BCA-assayet (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA). Supernatanten blev kogt i 5 minutter, fyldt på polyacrylamidgel, køre og overført til en PVDF-membran, som derefter blev blokeret i TBST (TBS med 0,2% Tween 20) + 5% mælk i 1 time, inden det undersøgt med anti-AR antistof (Dako North America, Inc., Carpinteria, CA) i blokerende buffer natten over ved 4 ° C, efterfulgt af inkubation ved stuetemperatur i 1 time med sekundære peberrodperoxidase-konjugeret anti-muse-antistof. Detektion blev udført ved hjælp af en elektro-kit (Amersham, GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ).

Luciferaseassayreagens

SRD5A3

promotor (-1027 /+ 155 bp) blev klonet i pGL2 basic vektoren (Promega Corp., Madison, WI) ved Xhol- og Mlul sites, som var yderligere deletionskonstruktioner. LNCaP-celler blev transficeret med disse konstruktioner ved hjælp af Fugene 6 reagent (Roche) eller Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

For at teste AR-afhængig repression evne SRD5A3, vi også indsat dets promotor (-191 /-72 bp) i pGL3-4ARE-E4-luc-konstruktionen ved PstI- og Xhol sites. LNCaP-celler blev transficeret med det og derefter dyrket i fravær og nærvær af DHT i 24 timer.

En dual-luciferase assay blev udført i overensstemmelse med Promega protokol. Den luciferase Forholdet blev udledt ved at dividere luciferaseaktiviteten af ​​

Renilla

aktivitet.

mutagenese

Mutationer blev foretaget i Nare region af

SRD5A3

promotoren ved anvendelse af en QuickChange II XL steddirigeret mutagenese kit (Stratagene, Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) ifølge producentens instruktioner. Sekvensen CTGTTTTGCGTCT blev muteret til ATTTTTTTATTAT i forbindelse med pGL3-4ARE-E4-luc konstruktion.

Elektroforetisk mobilitet-(EMSA)

AR s binding til dobbeltstrengede oligoer blev vurderet i LNCaP-kerneekstrakter ved at udføre EMSA med en LightShift kit (alle kits til EMSA var fra Thermo Scientific) ifølge producentens instruktioner. Nukleare proteinekstrakter blev isoleret fra LNCaP-celler, og proteinkoncentrationer blev bestemt ved anvendelse af et BCA proteinassaykit. Oligoer blev designet til at dække -191 /-91 region på

SRD5A3

promotor og mærket ved hjælp af et biotin 3′-ende-DNA-mærkning kit ifølge producentens instruktioner. AR-binding til dobbeltstrengede oligoer blev vurderet i LNCaP-kerneekstrakter ved EMSA under anvendelse af et LightShift kit ifølge producentens instruktioner. Umærkede oligoer blev brugt i EMSA som en af ​​knapperne. Biotin-mærket DNA blev detekteret på nylonmembran under anvendelse af et kemiluminescerende nucleinsyrepåvisning modul kit.

chromatin immunoprecipitation (chip) assay

LNCaP-celler blev dyrket i både nærvær og fravær af 100 nM DHT, og chip blev udført ved anvendelse af et kit fra Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA), ifølge deres protokol. Kort beskrevet blev celler behandlet med 37% formaldehyd til tværbinding proteiner til DNA. Tværbundet chromatin blev fordøjet af micrococcal nuclease til en længde på 150-900 bp, og de nukleare membraner blev knust ved lydbehandling. AR-specifikke antistoffer (Dako) blev anvendt til udfældning af korte kromatin-fragmenter, som derpå blev vasket og elueret. De protein-DNA-tværbindinger blev tilbageført og DNA yderligere oprenset ved hjælp af spin-søjler i hver PCR-reaktion. Den fremadrettede primer for Nare var CTGTTTTGCGTCTTTGCTTCTG, og reverse primer var GAGGTCCTTGGTCCTGGTC, der forstærker et 120-bp produkt.

xenograftmodeller

RNA fra MDA PCa 183, MDA PCa 144, MDA PCA 146, og MDA PCA 155 xenograftmodeller blev venligst stillet til rådighed af Dr. Sankar N. Maity og Dr. Nora M. Navone. MDA PCa 183 xenograft var afledt af androgen-afhængige prostata karcinom, mens de andre blev afledt fra AR-negative kastrationsniveauer-resistent prostata karcinomer med småcellet prostata carcinom (SCPC) morfologi.

Kvantificering af den relative mRNA niveau af xenograft

SRD5A3

og prostata-specifikt antigen (

PSA

) blev gjort ved hjælp af QRT-PCR med SYBR Green (Applied Biosystems, Inc.). QRT-PCR blev udført som beskrevet i [36]. Primersekvenserne var som følger: SRD5A3: fremad, 5′-TCCAAGCTGGCTTCATGGTT-3 ‘placeret på exon 2 og revers, 5′-CACTCGAAGAGTCTTCGTAA-3′ placeret på exon 3; PSA: forward, 5’-GAGAGCTGTGTCACCATGTG-3 ‘placeret på exon 1 og revers, 5′-CACAATCCGAGACAGGATGA-3’ placeret på exon 2.

Statistisk analyse

Data er præsenteret som middelværdi ± SD. Tosidet

t

tests blev gennemført for at sammenligne midler mellem androgen-behandlede prøver og kontroller. Signifikans blev fastsat til ap-værdi på 0,05.

Resultater

Alle tre 5α-reduktase isoenzymer er til stede i de testede humane prostata-cellelinjer, med varierende ekspressionsmønstre

For at identificere gode modelsystemer til at studere funktionen af ​​5α-reduktase-isoenzymer, evaluerede vi mRNA-niveauerne af 5α-reduktase-isoenzymer i forskellige prostata-cellelinjer, herunder PWR-1E immortaliserede normale prostataepitelceller; BPH-1-AR benign prostatahyperplasi (BPH) celler, som stabilt udtrykker Ar; LAPC-4 og LNCaP androgen-sensitive prostatacancerceller; og C4-2B4 androgen-uafhængige celler. PWR1-E, BPH-1-AR og LAPC-4-celler udtrykker vildtype AR, mens LNCaP og C4-2B4 celler udtrykker en mutant AR, T877A. (Egenskaberne af disse cellelinier, herunder deres kilde, androgen følsomhed, og AR-ekspression status, er opsummeret i tabel S1). Som figur 1 viser, blev mRNA fra alle tre 5α-reduktase isoenzymer detekteret på QRT-PCR-analyse af hver cellelinje, hvilket indikerer, at alle tre er udtrykt i disse cellelinier. Imidlertid er mRNA-niveauet af hvert isoenzym afveg mellem cellelinier, og hver isoenzym havde en karakteristisk ekspressionsmønster.

Grafer afbilder de relative mRNA-niveauer i

SRD5A1

,

SRD5A2

og

SRD5A3

isoenzymer i PWR-1E, BPH-1-AR, LAPC-4, LNCaP, og C4-2B4 celler som bestemt på QRT-PCR-analyse.

5α-reduktase-mRNA-niveauer reguleres af androgener i en celletype-specifik måde

for at teste om mRNA-niveauet af 5α-reduktase reguleres af androgener, behandlede vi LNCaP-celler med enten ethanol (dvs. kun vehikel) eller med testosteron eller DHT ved forskellige koncentrationer (1, 10, og 100 nM). Den normale plasmakoncentration af testosteron hos mænd varierer fra 350 til 1050 ng /dl (12,1-36,4 nM) [37], og kastreringsområdet niveau af testosteron er mindre end 50 ng /dl (1,73 nM) [38]. Plasmakoncentrationen af ​​DHT er ca. 1/10 af testosteron koncentration [39], [40]. Således behandlede vi cellerne med koncentrationer af androgen som er tæt på kastreringsområdet, fysiologiske og superphysiologic niveauer. Vores QRT-PCR-analyse viste, at DHT behandling resulterede i et øget niveau af

SRD5A1

mRNA, mens det førte til nedsat niveau af

SRD5A2

og

SRD5A3

mRNA i LNCaP prostata cancerceller (fig. 2A).

A, blev LNCaP-celler behandlet med ethanol (vehikel) eller forskellige koncentrationer af DHT (1 nM, 10 nM, 100 nM) i 24 og 48 timer. PWR-1E (B), BPH-1-AR (C), LAPC-4 (D), og C4-2B4 (E) -celler blev behandlet på samme måde, men kun i 24 timer. De mRNA niveauer af

SRD5A1

,

SRD5A2

, og

SRD5A3

for alle cellelinjer blev kvantificeret ved QRT-PCR. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001; 2-sidet

t

test.

Vi testede også virkningen af ​​DHT på andre cellelinjer. DHT ikke især påvirke mRNA-niveauet af 5α-reduktase i PWR-1E-celler (fig. 2B), hvorimod i BPH-1-AR celler, DHT øgede mRNA niveauer af alle tre isoenzymer (fig. 2C). I LAPC-4-celler, som udtrykker vildtype-AR, DHT opreguleret SRD5A1 ekspression uden at påvirke SRD5A2 og SRD5A3 ekspression (fig. 2D). Og i androgen-uafhængige C4-2B4 prostatacancerceller, DHT reguleret 5α-reduktase udtryk på samme måde som dens regulering i LNCaP celler, men i mindre grad (fig. 2E).

Vi fandt det interessant, at DHT regulerer mRNA niveau af

SRD5A3

i en celletype-specifik måde, en konstatering, vi ikke har set rapporteret før. At vurdere, om dette sker kun i LNCaP eller LNCaP-afledte cellelinier, vi behandlet på lignende måde VCap-celler, som er afledt af en xenotransplantat knoglemetastaser af human prostatacancer. DHT også nedreguleret mRNA niveau af

SRD5A3

i VCAP celler (Figur S1), hvilket indikerer, at androgen-negative regulering af

SRD5A3

er ikke specifik for LNCaP eller LNCaP-afledte cellelinjer.

Testosteron og R1881 havde de samme virkninger af DHT på ekspressionen af ​​5α-reduktase i alle de testede (figurerne S2 og S3) cellelinier. Vore data således påvise, at androgener regulere mRNA-niveauet af 5α-reduktase isoenzymer i en celletype-specifik måde.

Regulering af 5α-reduktase mRNA-niveau sker gennem transskription

Androgener kunne regulere 5α- reduktase ekspression ved at styre 5α-reduktase transkription eller ved at påvirke mRNA-stabilitet. For at forstå den mekanisme ligger til grund for reguleringen af ​​5α-reduktase af androgener, vi behandlede BPH-1-AR celler med actinomycin D, en transskriptionsinhibitor. Som vist ved resultaterne af QRT-PCR-analyse i figur 3 inducerede DHT forøget ekspression af alle tre 5α-reduktase isoenzymer i forhold til, at der i ethanol (vehikel) kontrol i BPH-1-AR celler. Men mRNA-niveauet af 5α-reduktase ikke ændre sig med DHT behandling, når cellerne blev også behandlet med actinomycin D ved 1 pg /ml og 5 pg /ml-koncentrationer (Fig. 3A). Disse resultater indikerer, at opregulering af 5α-reduktase-ekspression med androgener er følsom over for actinomycin D behandling, hvilket antyder, at androgener regulerer transkriptionen af ​​5α-reduktase.

BPH-1-AR (A) og LNCaP ( B), og PWR-1E (C) celler blev behandlet i 30 minutter med DMSO (vehikel-kun kontrol) eller actinomycin D ved 1 pg /ml og 5 pg /ml koncentrationer. Behandling med enten ethanol (kun vehikel) eller 10 nM DHT eller testosteron fulgt. Vi kvantificeret mRNA niveauerne af

SRD5A1

,

SRD5A2

, og

SRD5A3

af QRT-PCR.

samme måde, når LNCaP celler behandlet med actinomycin D, har testosteron ikke øge

SRD5A1

eller fald

SRD5A2

og

SRD5A3

mRNA-niveauer (fig. 3B). Som en negativ kontrol, vi også behandlet PWR-1E-celler med actinomycin D, efterfulgt af DHT behandling (fig. 3C). I tilfælde af DMSO-only kontrol, havde DHT ikke påvirke mRNA-niveauet af

SRD5A1

,

SRD5A2

eller

SRD5A3

. Med actinomycin D behandling, har DHT ikke væsentligt ændrer mRNA niveauet af disse gener, enten.

Regulering af 5α-reduktase mRNA niveau ved androgener er AR afhængige

Ved at bruge Western blotting, vi verificeret ekspressionen af ​​AR i hver af de undersøgte cellelinier ved sammenligning med den af ​​AR-negative BPH-1-GFP-celler (fig. 4A).

A, AR-protein for hver prostata-cellelinien var analyseret ved Western blotting. BPH-1-GFP-celler blev anvendt som en negativ kontrol for AR ekspression. B, blev AR proteinniveau analyseret ved Western blotting for LNCaP-celler (venstre) med tre kontrol og to AR siRNA behandlinger. AR mRNA-niveau blev analyseret ved QRT-PCR for PWR-1E celler (til højre), også med tre kontrol og to AR siRNA behandlinger. C, LNCaP og PWR-1E-celler blev behandlet med kontrol siRNAs og AR siRNAs og derefter behandlet med 2 nM DHT. Vi målte mRNA niveauerne af

SRD5A1

,

SRD5A2

, og

SRD5A3

ved hjælp QRT-PCR og normaliseret de værdier til p-actin. Ændringerne i mRNA-niveauer med DHT behandling, er vist i forhold til niveauet i celler behandlet med køretøjet alene.

For at afgøre, om AR er forpligtet til at mægle regulering af 5α-reduktase udtryk ved androgener, vi udførte vestlige blotting og QRT-PCR-analyse efter behandling LNCaP og PWR-1E-celler med AR siRNAs og derefter med 2 nM DHT. Western blotting og QRT-PCR valideret effektiv knockdown af AR ekspression af AR siRNAs (fig. 4B). QRT-PCR viste, at kontrollen siRNA’er ikke signifikant ændrer effekten af ​​DHT på 5α-reduktase-niveauer i LNCaP-celler (fig. 4C, øverst). DHT behandling alene resulterede i øget

SRD5A1

mRNA men faldt

SRD5A2

og

SRD5A3

mRNA (fig. 4C, øverst). I modsætning hertil de 5α-reduktase-niveauer i LNCaP-celler behandlet med AR siRNAs ikke ændre som respons på behandling med DHT (fig. 4C, øverst). Da vi behandlede LAPC-4 celler på en lignende måde,

SRD5A1

mRNA tilsvarende forøget med DHT eller testosteron behandling alene, men ikke når celler blev også behandlet med AR siRNA (figur S4). Da vi behandlede PWR-1E-celler på samme måde, har DHT ikke påvirke mRNA-niveauet af 5α-reduktase i PWR-1E celler, uanset om de blev behandlet med kontrol siRNA’er eller Ar siRNAs (fig. 4C, nederst).

tilsammen indikerer disse resultater, at reguleringen af ​​5α-reduktase af androgener er AR afhængige.

SRD5A3

promotor indeholder en Nare

Vi viste, at androgen regulerer transskriptionen af ​​5α-reduktase og at AR er nødvendigt at mediere denne transkriptionel regulering. AR binder direkte til ARE’er og regulerer transkription af AR-målrettede gener. Således har vi undersøgt, om AR direkte kan regulere transkriptionen af ​​5α-reduktase. Vi klonede et promotorområde af

SRD5A3

(-1027 til +155 bp) ind i pGL2-Basic Vector. I LNCaP-celler, denne konstruktion drev luciferaseekspression og, når de behandles med 100 nM DHT, en 75% reduktion af luciferaseaktivitet resultater (fig. 5A). Dette svarer til svaret fra endogene

SRD5A3

til androgen behandling i LNCaP celler. Således kan en ARE opholde sig i denne 1-kb-promotor-regionen i

SRD5A3

.

A, sletning analyse af

SRD5A3

promotor at indsnævre placeringen af ​​nARE- indeholdende region. LNCaP-celler blev transficeret med luciferase- konstruktioner indeholdende en deletion række

SRD5A3

promotor og derefter behandlet med ethanol (vehikel; -DHT) eller 100 nM DHT (+ DHT) i 24 timer. Celler blev derefter høstet, og deres lysater blev anvendt til luciferase assayet. B,

SRD5A3

har en Nare. LNCaP-celler blev transficeret med pGL3-4ARE-E4-konstruktioner med og uden indsætning af

SRD5A3

promotoren (-191 /-72 bp) sekvens i begge orienteringer eller med indsættelse af en

SRD5A1

promotor fragment (-1601 /-1501 bp). Celler blev behandlet med ethanol (kun vehikel) eller 100 nM DHT i 24 timer og derefter høstet for luciferase-assayet. C, Mutationer i Nare afskaffede sin undertrykkende virkning. LNCaP-celler blev transficeret med pGL3-4ARE-E4-konstruktioner med og uden indsætning af

SRD5A3

promotoren (-191 /-72 bp) eller med indføring af den muterede

SRD5A3

promotoren (-191 /-72 bp) og derefter udsat for DHT behandling og luciferaseanalyse

for at identificere de formodede eR, vi foretaget en række deletionskonstruktioner i

SRD5A3

promotor region.; konstruktionerne bibeholdt lydhørhed over for androgen behandling indtil -191 /-91 bps blev slettet, hvilket tyder på, at den formodede ARE ligger i denne region (fig. 5A).

For yderligere at vurdere, om denne region faktisk indeholder en Nare vi indsatte regionen -191 /-72 bp mellem 4ARE og E4 core promotor i pGL3-4ARE-E4-luc-konstruktionen [41], transficerede LNCaP-celler med det, og derefter behandlet af cellerne med DHT. Den pGL3-4ARE-E4-luc konstruktion indeholder fire tandemgentagelser af ARE af

PSA

gen og en E4 kernepromotoren [41]. Som vist i figur 5B, DHT behandling induceret omkring en 24-gange stigning i luciferaseaktivitet i pGL3-4ARE-E4-luc-konstruktionen. Når -191 /-72-bp region af

SRD5A3

promotor blev indsat mellem 4ARE og E4, blev luciferaseaktivitet kun steg 3- til 6-fold ved DHT behandling, hvilket antyder, at denne region indeholder en Nare. Når en 101 bp region afledt af

SRD5A1

promotor (-1601 /-1501 bp) blev ligeledes indsat mellem 4ARE og E4 som kontrol, DHT behandling stadig inducerede en 26-dobling i luciferaseaktivitet. Desuden mutationer i -191 /-72 bp region

SRD5A3

afskaffet sin undertrykkende evne (fig. 5C). Sammen antyder disse data, at

SRD5A3

har en funktionel Nare i sin promotor.

AR rekrutteres til Nare-holdige region af

SRD5A3

for at undersøge om AR rekrutteres til promotoren af ​​

SRD5A3 in vivo

, vi udførte chip bruger genomiske DNA-fragmenter fra LNCaP-celler (150-900 bp;. figur 6A) med primere specifikt rettet mod Nare regionen i

SRD5A3

. Som vist på PCR blev AR beriget ved Nare region, når celler voksede i nærværelse af DHT (fig. 6B). Normalt muse-immunoglobulin G (som negativ kontrol) blev også anvendt til immunfældning med LNCaP genomisk DNA; immunoglobulin G ikke trække ned nogen AR-associerede DNA-sekvenser af den

SRD5A3

promotoren (fig. 6B). Disse resultater antyder, AR rekrutteres til Nare region i promotoren af ​​

SRD5A3

.

A, Agarosegelelektroforese af det fordøjede kromatin af LNCaP-celler dyrket i fravær og nærvær af 100 nM DHT. DNA-fragmenter generelt i området mellem 150 og 900 bp. B, blev fordøjet kromatin af LNCaP-celler dyrket i fravær og nærvær af 100 nM DHT anvendt i immunpræcipitering eksperiment med anti-AR-antistof eller normal muse-immunoglobulin G. Bagefter blev proteinet-DNA krydsbinding omvendt, og oprenset DNA blev anvendt i PCR reaktioner med primere, der flankerer Nare region. C, tre oligo-prober blev designet til at dække -191 /-91 bp region i promotoren af ​​

SRD5A3

. D, AR binder til Nare af

SRD5A3

. De tre (biotin-mærkede) oligo-prober blev inkuberet med LNCaP cellekerner ekstrakt, med LNCaP cellekerner ekstrakt plus umærkede oligo-prober, eller med LNCaP-nukleare ekstrakt plus AR-specifikt antistof.

For at bestemme om AR direkte kan interagere med Nare af

SRD5A3

, vi gennemført EMSA med tre oligo-sonder, hver af 40 bp, til dækning af -191 /-91 bp region af

SRD5A3

promotoren (fig. 6C). Kun sonde 1 viste en mobilitet skift (fig. 6D). For at bekræfte at denne mobilitetsskift er specifik for AR, vi tilføjet anti-AR antistoffer til reaktionerne; føler 1 viste en yderligere mobilitetsforskydning (fig. 6D). Selvom umærket vildtype-probe 1 var i stand til at konkurrere med mærket probe 1 for AR binding i EMSA, det mistet denne evne når vi gjort mutationer i proben 1-sekvensen (figur S5).

Disse resultater viste, at proben 1 indeholder Nare og at AR binder direkte til denne region

in vitro

.

for

SRD5A1

SRD5A2

, vi også gennemført promotor analyse og chip, men vi fandt ikke en ARE region eller direkte AR binding til deres proksimale promotorområder. Den regulational mekanisme for deres udtryk er stadig under efterforskning.

SRD5A3

mRNA stigninger i AR-negative SCPC xenograftmodel

På observere androgen-negative regulering af

SRD5A3

i de testede cellelinier, vi var interesserede i at undersøge, om denne AR-afhængig regulering også forekommer

in vivo

. Derfor undersøgte vi mRNA-niveauet af

SRD5A3

i forskellige xenograftmodeller, herunder MDA PCa 183, en AR-udtrykkende androgenafhængig prostatacancer xenograft, og tre AR-negative androgen-uafhængige SCPC xenografter, MDA PCa 144 , MDA PCa 146, og MDA PCa 155. på QRT-PCR, observerede vi en bemærkelsesværdig højere mRNA-niveau på

PSA

i MDA PCa 183 xenograft end i de andre (fig. 7, øverst), som er overensstemmelse med AR status for disse cellelinier.