PLoS ONE: Targeting Cancer Cells med Reactive Oxygen og Nitrogen Arter Dannet med Atmosfærisk-Pressure Air Plasma

Abstrakt

plasma jet er blevet foreslået som en ny terapeutisk metode til kræft. Anticanceraktivitet af plasma er blevet rapporteret at involvere mitokondriel dysfunktion. Men hvad bestanddele genereret af plasma er knyttet til denne anticancer proces og dets virkningsmekanisme er fortsat uklare. Her rapporterer vi, at de terapeutiske virkninger af luft plasma resultat fra generation af reaktive oxygen /nitrogen arter (ROS /RNS), herunder H

2O

2, Ox, OH

-, • O

2 , NOx, hvilket fører til depolarisering af mitokondrielle membran potentiale og mitokondrie ROS akkumulation. Samtidig ROS /RNS aktivere c-Jun NH

2-terminal kinase (JNK) og p38 kinase. Som følge heraf behandling med luft plasma jets inducerer apoptotisk død i humane livmoderhalskræft HeLa-celler. Forbehandling af cellerne med antioxidanter, JNK og p38-inhibitorer eller JNK og p38 siRNA modvirker depolarisering af mitokondrielle membranpotentiale og forringer luft plasma-induceret apoptotisk celledød, hvilket antyder, at ROS /RNS genereret af plasma udløser signalveje, der omfatter JNK og p38 og fremme mitokondriel perturbation, der fører til apoptose. Derfor kan administration af luft plasma være en realistisk strategi for at eliminere cancerceller

Henvisning:. Ahn HJ, Kim KI, Hoan NN, Kim CH, Moon E, Choi KS, et al. (2014) Målretning Cancer Cells med Reactive Oxygen og Nitrogen Arter Dannet af Atmosfærisk-Pressure Air Plasma. PLoS ONE 9 (1): e86173. doi: 10,1371 /journal.pone.0086173

Redaktør: Xianglin Shi, University of Kentucky, USA

Modtaget: 27. september 2013; Accepteret: December 6, 2013; Udgivet: 21 Jan 2014

Copyright: © 2014 Ahn et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Research Foundation Korea tilskud, der finansieres af Korea regering (MSIP) (2012M3A9B2052871, fra 2010 til 0.018.546, 2011 til 0.030.043). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Plasma omtales ofte som den fjerde tilstandsform ud over fast, flydende og gas. Plasma er helt magen til gas, hvori en del af partiklerne er ioniseret og opkrævet, nogle partikler er elektrisk neutrale, og nogle er kemisk aktiverede radikaler. Plasma kan kategoriseres som enten “termisk (eller varmt) plasma” eller “ikke-termisk (eller koldt) plasma.” Adskillige teknikker anvender plasma er blevet undersøgt og gennemført med succes i visse industrielle applikationer. For nylig har plasma applikationer været ansat i biologiske og medicinske videnskaber, herunder blod koagulation [1], kræftbehandling [2], overflade sterilisering [3], og dental hulrum behandling [4]. Især kan øge plasma translationel forskning i kræftbehandlingen lover nye terapeutiske virkninger. Desuden er det interessant, at kold plasma genereret ved atmosfærisk tryk forøger gennemførligheden af ​​medicinske anvendelser.

Selvom det biologisk effektive materiale (r), der dannes fra plasma og dets cellulære mål forbliver ukendt, adskillige former for evidens link reaktivt oxygen /nitrogen arter (ROS /RNS) til sine biologiske virkninger. Behandling med plasma forårsagede depolarisering af mitokondrielle membranpotentiale og generering af ROS i humane celler [2]. Desuden antioxidanter lindres plasma-induceret mitokondriel dysfunktion, støtter opfattelsen af, at oxiderende arter som ROS kan mediere plasma-inducerede virkninger på pattedyrceller [2]. En bred vifte af tilsyneladende ubeslægtede og komplekse årsager til mitokondriel dysfunktion har fælles underliggende patofysiologiske mekanismer: ROS produktion og akkumulering skader på mitokondrierne, hvilket fører til øget oxidativ stress, tab af ATP, mitophagy til kvalitetskontrol og eliminering af beskadigede mitokondrier, og i sidste ende celledød [5].

Det er nu klart, at ROS har en celle signalering rolle i mange biologiske systemer fra bakterier til mammale celler [6]. ROS kan aktivere celle signalering kaskader, såsom dem, der involverer mange forskellige mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) kaskader [7], [8]. Disse omfatter stress kinaser, c-Jun N-terminale kinaser (JNK) og stress-aktiveret proteinkinase (SAPK). JNK’erne blev identificeret som en kinase, der binder og phosphorylerer c-Jun på Ser-63 og Ser-73 inden for dens transskriptionelle aktiveringsdomæne. JNK aktiveres ved behandling af celler med cytokiner (fx tumornekrosefaktor (TNF) og interleukin (IL) -1) og ved udsættelse af celler for mange former for miljømæssig stress (fx osmotisk stress, redox stress, og stråling ) [9]. Det er blevet fastslået, at ROS er potente inducere af JNK. De fleste rapporter om ROS-induceret JNK aktivering resultat fra eksogen ROS, for det meste H

2O

2. Desuden kan ROS akkumulering induceret af apoptotiske stimuli aktiverer SAPK p38 [10]. De JNK og p38 MAPK veje deler flere opstrøms regulatorer, og derfor er der flere stimuli, der samtidig aktiverer begge veje.

Links mellem ROS signalering og apoptose foreslås at være medieret af mitokondrier. I øjeblikket mange undersøgelser har antydet, at mitokondrier er de vigtigste virkningssted for JNK i apoptose. Både JNK1- og JNK-deleteret primære murine embryonale fibroblaster har vist modstand mod UV-induceret apoptose på grund af en defekt i mitokondrie død signalvejen, herunder manglende frigive cytochrom c [11]. Mitokondrie translokation af JNK sker under forhold med stress, såsom udsættelse for UV, ioniserende stråling, ROS og RNS, og dermed mitokondrie-lokaliserede JNK giver nærhed til mitokondrier-genereret ROS [12], [13]. Desuden apoptotiske stimuli undertiden udløse p38a aktivering af en sekundær vej, såsom produktion af ROS [13]

Vi og flere andre grupper har rapporteret, at atmosfærisk tryk plasma [2], [14]. – [19] og nitrogen plasma jets fra en mikro-dyse array [20] inducere apoptose i cancerceller. For nylig er plasma vist sig at fremme apoptose af cancerceller ved genereringen af ​​ROS, afbrydelse af den mitochondriemembranpotential, og aktivering af caspase-familieproteinerne [2]. Men hvad komponent (er) genereret af luft plasma frembringer sine anticancer effekter og den molekylære mekanisme, ved hvilken plasma inducerer apoptose fortsat uklare. Til denne rapport, forsøgte vi at finde den effektor komponent (er) genereret fra luften plasma og dets mål og for at belyse den molekylære mekanisme og biokemisk vej, hvormed den fremkalder anticancer terapeutiske fordele. Vi identificerede ROS /RNS som centrale effektorer luft plasma, som er rettet mod mitokondrier og fører til aktivering af JNK og p38 signalveje.

Resultater

Air micro plasma jet kan generere reaktive ilt og nitrogenforbindelser

mikro plasma jet system, der drives ved atmosfærisk tryk kan producere kemisk aktive arter, især oxygen- og nitrogenatomer [21]. I denne undersøgelse vi først anvendte optiske emissionsspektrum analyse for at identificere de partikler og radikaler genereret af luft plasma (figur 1a-b), der kan mediere virkningerne af luft plasma i cancerceller [2], [22]. Optisk emission spektroskopi (OES) blev udført over et bredt område af bølgelængder fra 280 nm til 920 nm med en optisk emission spektroskopet (SV 2100, K-MAC) (figur 1c). De dominerende emission linjer illustrerer tilstedeværelsen af ​​begejstrede ilt-ioner (O

2

+) ved 500-600 nm og atomare ilt (O I) på 777 og 844 nm (figur 1c). Derudover de påviste reaktive arter, der er forbundet med nitrogen er ophidset kvælstof-molekyler (N

2 sekunder positiv system, og N

2 første positive-system) i intervaller af 300-390 og 610-710 nm og ioniserede kvælstof molekyler (N

2

+ første negative systemet) i området fra 390 til 480 nm, og atomare nitrogen (NI) på 747, 822, og 868 nm (figur 1c). Disse OES resultater indikerer, at luften mikro plasma jet kan spille en vigtig rolle i produktion af forskellige reaktive oxygen og nitrogenforbindelser (ROS og RNS henholdsvis).

(a) fotografi af den fremstillede microplasma jet system. Indsættelsen er en skematisk præsentation af mikro plasma jet dyse. (B) Fotografi af luft mikro plasma jet genereret ved atmosfærisk tryk. (C) Optisk emission spektrum af luft mikro plasma jet under afladning.

ekstracellulære og intracellulære ROS og RNS blev genereret af luft plasma eksponering

En antydning, at ROS og RNS kan mediere anticancer effekter af luft plasma blev foreslået af vores tidligere undersøgelse rapporterer, at luft plasma induceret apoptose, ledsages af dannelsen af ​​ROS og RNS og faldende mitokondrielle membranpotentiale (MMP) i cervikale cancerceller [2]. Endvidere har produktionen af ​​ROS og RNS ved plasma jet undersøgt for nylig [23], og er i overensstemmelse med emissionsspektrene induceret af luft plasma (figur 1c). Derfor vi biokemisk analyseret produktion af ROS og RNS, deres levering til væskefasen af ​​celledyrkningsmediet, og den sekventielle migration af ROS og RNS i celler (figur 2). Salg

(a) Niveauer af ekstracellulære H

2O

2 blev bestemt i kultur eller ikke-kultur (Medium kun) supernatanter, med (AP) eller uden (non-behandlet) luft plasma behandling. Kultursupernatanten blev høstet ved de angivne tidspunkter efter luft plasmabehandling (AP). AP 0 (min) angiver supernatant høstet umiddelbart efter plasmabehandling. Koncentrationen af ​​H

2O

2 i dyrkningssupernatanten blev bestemt ved sammenligning med en H

2O

2 standard kalibreringskurve, efter inkubation med Amplex UltraRed reagens (

n

= 5). (B) Generation og /eller penetration over plasmamembranen af ​​ROS herunder H

2O

2, OH

-, og • O

2 i den intracellulære matrix efter luft plasma jet (AP) var bestemmes ved hjælp af ROS-følsomme sonde H

2DCFDA (

n

= 5). Fluorescensen af ​​ubehandlede celler (Non-behandlet) blev arbitrært sat til 1. (c) Niveauer af ekstracellulær NO blev bestemt i ikke-kultur (i fravær af HeLa-celler, øvre) og kultur (i nærvær af HeLa-celler, bund ) supernatanter på de angivne tidspunkter efter luft plasma jet eksponering af Griess assay (

n

= 10). (d) Niveauer af intracellulær NO blev vurderet ved anvendelse DAF-FM. Data er vist som middelværdi ± S.E.M. (

n

= 10).

Vi undersøgte først, om behandling med luft plasma ville inducere generation af H

2O

2 i kultursupernatanten (figur 2a ). Kultursupernatanten blev høstet på de angivne tidspunkter efter luft plasmabehandling og koncentrationen af ​​H

2O

2 i kultursupernatanten blev analyseret ved sammenligning med H

2O

2 standardkalibreringskurve. H

2O

2 blev genereret på ca. 26,93 uM umiddelbart efter behandling med luft plasma dyser og koncentrationen i kultursupernatanten hurtigt faldt indenfor 1 time. Men H

2O

2 i ikke-dyrkningsmedium alene faldt mere langsomt, indtil 1 time efter plasma behandling, i forhold til niveauet i kultursupernatanten. I 3 timer niveauerne af H

2O

2 var ens i supernatanter fra HeLa-cellekultur og kun i medium. H

2O

2 var knap detekteret i kultursupernatanten, i 3 timer efter plasmabehandling (figur 2a). Disse resultater antyder, at luft plasma kan generere og sekventielt afgiver H

2O

2 i mediet. Derudover årsagen til den initiale hurtige fald i H

2O

2 genereret af luft plasma i kultursupernatanten sammenlignes med den i ikke-dyrkningsmedium kan være, at cellerne fremmer scavenging af H

2O

2. For at teste denne mulighed, vi overvågede niveauerne af H

2O

2 i kultursupernatanten og ikke-dyrkningsmedium alene efter H

2O

2 behandling (Figur S1a). Da HeLa-celler blev behandlet med 2 mM H

2O

2, H

2O

2 blev tilsvarende påvist i både kultursupernatanten og ikke-dyrkningsmedium umiddelbart efter behandlingen. Men i 3 timer efter H

2O

2 behandling, H

2O

2 var knap detekteret (ca. 100 pM) i kultursupernatanten, men niveauet forblev på ca. 670 pM i ikke- dyrkningsmedium (fig S1a). Baseret på dette resultat, er det spekuleret på, at cellerne kan scavenge H

2O

2 genereret af luft plasma, hvilket fører til en accelereret fald i H

2O

2 i dyrkningssupernatanten.

Vi næste overvåget generation af intracellulær ROS herunder H

2O

2, hydroxylradikaler (OH

-), og singlet oxygen (• O

2), efter plasmabehandling ved anvendelse H

2DCFDA (figur 2b). Efter luft plasma behandling, intracellulære ROS-niveauer steg med ca. 2,7 gange (2,73 ± 0,13). Dette forhøjede niveau faldt indtil 3 timer efter plasmabehandling og udvindes næsten til den ubehandlede basalniveau i 24 timer (figur 2b). Disse data antyder, at plasmabehandling inducerer dannelsen af ​​intracellulære ROS.

Dernæst vurderede vi, om luft plasma kan resultere i dannelsen af ​​ekstracellulære og intracellulære RNS (figur 2C og D). Umiddelbart efter plasmabehandling blev ekstracellulære NO-niveauer forhøjet til ca. 13,28 mM i både ikke-kultur og dyrkningsmedier (figur 2c). Ved 3 timer efter plasmabehandling, ekstracellulære NO-niveauer i ikke-kultur og dyrkningsmedier hurtigt faldt til ca. 8,26 eller 5,8 mM (figur 2C). På tidspunkter senere end 3 timer blev det ekstracellulære NO niveauet i ikke-dyrkningsmedium opretholdes, mens det ekstracellulære NO niveau i dyrkningsmedium blev kontinuerligt reduceret til ca. 1,28 mM i 24 timer efter plasmabehandling (figur 2c), hvilket indikerer, at celler kan optagelse eller fjerne ekstracellulær NO genereret af plasma.

Ligeledes blev intracellulære NO-niveauer i plasma-behandlede celler steg cirka 1,8-fold (1,75 ± 0,20) eller 2,3 gange (2,28 ± 0,07) i 1 time og i 18 timer efter luft plasma behandling, sammenlignet med dem i ikke-behandlede celler. Det forhøjede intracellulære NO niveau blev opretholdt indtil 24 timer (data ikke vist) efter plasmabehandling og udvindes næsten til den ubehandlede basalniveau i 48 timer (figur 2d og fig S1B), svarende til ROS-niveauer efter plasmabehandling (figur 2b). Luft plasma inducerede en større og mere holdbart stigning i NO end den fremkaldt af H

2O

2 (figur 2d og fig S1b-c). Tilsammen tyder disse data, at plasma behandling inducerer generering af ekstracellulære og intracellulære NO.

For at understøtte, at luft plasma genereret ROS og RNS niveauer i pattedyrceller, vi undersøgt, om antioxidanter dæmpe plasma-induceret ROS /RNS generation ved måling ROS og RNS niveauer i HeLa-celler efter behandling med plasma i nærvær af antioxidanter. Først testede vi, om den velkendte thiol antioxidant NAC [24] kan påvirke koncentrationen af ​​H

2O

2 i kultursupernatanter efter luft plasmabehandling (figur 3a). I kombination med plasma jet, kun HeLa-cellekultur eller medium blev forbehandlet med NAC. NAC inducerede hurtigt fald af H

2O

2 til ca. mindre end 4,13 ± 1,67 uM i 15 min efter plasmabehandlingen, svarende til niveauet i 2 timer efter plasmabehandling uden NAC (figur 3a), hvilket antyder, at NAC kan mindske luft plasma-inducerede H

2O

2 generation. Vi undersøgte dernæst, om antioxidanter kan mindske luft plasma-inducerede generering af intracellulære ROS (figur 3b). For at gøre dette, vi evaluerede ROS-niveauer efter forbehandling med antioxidant NAC eller cPTIO og udsættelse for luft plasma. Både NAC og cPTIO kunne dæmpe dannelsen af ​​intracellulære ROS induceret af luft plasma (figur 3b). Interessant nok klare dæmpning af intracellulær ROS-generering af cPTIO, en effektiv antioxidant af RNS såsom nitrogenoxid (NO

•), ført til spekulation at luft plasma kan generere RNS samt ROS og den intracellulære generation af ROS kan være knyttet til generering af RNS.

(a) Niveauer af ekstracellulær H

2O blev bestemt

2 i kultur eller ikke-kultur (Medium kun) supernatanter med luft plasma behandling i nærværelse (AP + NAC) eller fravær (AP) af antioxidanten NAC (

n

= 5). NAC blev tilsat 1 time før plasmabehandling. Kultursupernatanten blev høstet ved de angivne tidspunkter efter luft plasmabehandling. AP 0 (min) angiver supernatant høstet umiddelbart efter plasmabehandling. (B) Frembringelse af ROS herunder H

2O

2, OH

-, og • O

2 i den intracellulære matrix efter luft plasma jet (AP) blev bestemt under anvendelse af ROS-sensitive probe H

2DCFDA (

n

= 5). Celler blev forbehandlet med antioxidanter NAC eller cPTIO for 1 time og derefter udsat for luft plasma (AP + NAC eller AP + cPTIO) eller H

2O

2 (H

2O

2 + NAC eller H

2O

2 + cPTIO). På angivne tidspunkter efter luft plasma behandling blev cellerne høstet. Fluorescensen af ​​ubehandlede celler (Non-behandlet) blev arbitrært sat til 1. (c) Niveauer af ekstracellulær NO blev bestemt i ikke-kultur (i fravær af HeLa-celler, øvre) og kultur (i nærvær af HeLa-celler, bund ) supernatanter på de angivne tidspunkter efter luft plasma jet eksponering af Griess assay (

n

= 10). Medium i nærvær eller fravær af HeLa-celler blev forbehandlet med NAC eller cPTIO i 1 time før eksponering for plasma eller H

2O

2. (d) Niveauer af intracellulær NO blev vurderet ved anvendelse DAF-FM. Data er vist som middelværdi ± S.E.M. (

n

= 10).

Vi yderligere undersøgt, om antioxidanter kan mindske luft plasma-induceret dannelse af RNS. Vi fandt, at NO antioxidant cPTIO fremmes for faldet i det ekstracellulære NO niveau induceret af plasma i både kultursupernatanten og ikke-dyrkningsmedium (figur 3c). I modsætning hertil NAC havde ringe effekt på plasma-induceret ekstracellulære NO-niveauer i både kultur og ikke-dyrkningsmedium (figur 3c). I overensstemmelse med de ekstracellulære INGEN resultater, kunne c-PTIO men ikke NAC betydeligt aftage den generation af intracellulære RNS med fly plasma (Figur 3d og Figur S1B). Den specifikke dæmpning af luft plasma-inducerede RNS ved cPTIO (den effektive RNS antioxidant) og dæmpning af H

2O

2-induceret RNS både NAC (den effektive ROS antioxidant) og cPTIO (figur 3d) tyder at luft plasma kan generere RNS direkte men H

2O

2-induceret RNS generation kan medieres via vej (e), der involverer ROS mellemprodukter. Taget sammen med generation data ROS og RNS (figur 2-3), vores resultater viser, at luft plasma kan generere ekstracellulære og intracellulære ROS og RNS i dyrkningssupernatanter og det cellulære miljø.

Air plasma aktiverer JNK og p38 MAPK-medieret signalering pathway

for at bestemme om ROS og RNS genereret af luft plasma kan fungere som signalmolekyler og hvilke signal pathways er involveret i denne transduktion, vi søgte efter MAPK kaskader, som vides at være impliceret i signalveje som reaktion på oxidative stress såsom ROS, RNS, UV og ioniserende bestråling. For at gøre dette, vi testede, om ROS /RNS genereret af luft plasma inducerer JNK, p38, og /eller ERK aktivering. Immunofluorescens og immunoblotting blev udført for at evaluere phosphoryleringen af ​​disse kinaser induceret af H

2O

2 og dets aktivering som respons på luft plasmabehandling (figur 4 og figur S2). Udsættelse for luft plasma højt induceret aktivering af JNK, sammenlignet med dets beskedne aktivering af H

2O

2 (figur 4a og figur S2a), tyder på, at signalering kan fremkaldt af luft plasma og kan dermed aktivere en JNK-medieret signaltransduktionsvej. Når celler blev behandlet med plasma eller H

2O

2 i tilstedeværelse af en inhibitor af JNK (SP600125), JNK aktivering blev ophævet som forventet, i 1 time efter behandling med plasma eller H

2O

2 (figur 4a og figur S2a). Også, NAC kunne afbøde JNK-aktivering med plasma eller H

2O

2 (figur 4a, lav panel), hvilket indikerer, at en vis form for oxidativt stress signal kan fremkaldes af plasmaet.

(a) Phosphorylering af JNK efter behandling med luft plasma jet eller H

2O

2 blev analyseret via immunfluorescensfarvning og immunoblotting under anvendelse af anti-phospho-JNK-antistof. Det tilsvarende beløb af de samlede JNK proteiner er vist som en kvantitativ belastning kontrol for JNK fosforylering. (B) Phosphorylering af p38 induceret af luft plasma blev visualiseret ved immunblotting under anvendelse af anti-phospho-p38 antistof. De sammenlignelige totale p38 proteiner er vist som en belastning kontrol for p38 phosphorylering. (C) Variation af fosforylering status ERK blev ikke påvist efter behandling med luft plasma eller H

2O

2.

Dernæst undersøgte vi aktiveringen af ​​p38 ved plasma og om NAC kan påvirke p38-aktivering induceret af plasma. På en måde analog med JNK, luft plasma fremkaldt phosphoryleringen af ​​p38 og dette plasma-induceret phosphorylering blev delvis afhjælpes ved NAC, hvilket indikerer, at luft plasma-inducerede signal kan aktivere p38-medierede signal pathway og kan være en slags oxiderende signal (Figur 4b og fig S2b). I modsætning hertil plasma havde ringe virkning på phosphorylering af ERK1 /2 (figur 4c). Disse data sammen, tyder på, at luft plasma kan fremkalde intracellulære signaler og sekventielt aktivere intracellulære signaltransduktionsveje medieret via JNK eller p38.

Air plasma inducerer mitokondrie ROS ophobning og mitokondriedysfunktion

Mitokondrier er en vigtig kilde til cellulære ROS generation [25] og oxidativ stress herunder H

2O

2 kan initiere sammenbruddet af mitokondrielle transmembranpotentiale (A ^ m) [26]. I en tidligere rapport, fandt vi, at sammenbruddet af det mitokondrielle transmembranpotentiale (A ^ m) induceres af N

2 eller luft plasma [2]. At se, om plasma kan inducere mitokondrie ROS akkumulering målte vi mitokondrie superoxid efter plasmabehandling hjælp MitoSox, et fluorogent farvestof til selektiv detektering af superoxid i mitokondrier af levende celler (figur 5A). Mitokondrie superoxid i celler øges ved behandling med luft plasma eller H

2O

2. Desuden er omfanget af mitokondrie superoxid i celler behandlet med luft plasma (4,32 ± 0,05) var ca. 2 gange højere end i H

2O

2-behandlede celler (2,36 ± 0,23) ved 6 timer efter behandling med plasma (figur 5a). Efter denne tid (dvs. 6 timer efter behandling), den akkumulerede mitokondrie superoxid i plasma-behandlede celler faldet, mens den akkumulerede superoxid i mitokondrier af H

2O

2-behandlede celler fortsatte indtil 24 timer (2,45 ± 0,39) (figur 5a). Disse resultater antyder, at luft plasma kan inducere akkumulering af ROS herunder superoxid i mitokondrier.

(a) mitochondrial ROS-produktion blev evalueret ved brug af mitokondrier-specifikke probe Mitosox efter H

2O

2 eller luft plasmabehandling. Mitokondrie ROS i ubehandlede celler (Non-behandlet) blev arbitrært sat til 1. Cellerne blev høstet på de angivne tidspunkter efter luft plasmabehandling og analyseret ved flowcytometri. (B) Celler blev forbehandlet med antioxidanter (NAC eller cPTIO) eller kinaseinhibitorer (SP600125 eller SB203580) i 1 time og derefter udsat for luft plasma (AP + NAC, AP + cPTIO, AP + SP eller AP + SB) eller H

2O

2 (H

2O

2 + NAC, H

2O

2 + cPTIO, H

2O

2 + SP eller H

2O

2 + SB). Celler blev høstet ved angivne tidspunkter efter plasma behandling, og niveauer af mitokondrie ROS blev målt (

n

= 5). Fluorescensen af ​​ubehandlede celler (Non-behandlet) blev arbitrært sat til 1. (c) mitochondriemembranpotential blev evalueret ved brug af mitokondrier-specifikke probe JC-1 med eller uden luft plasma eller H

2O

2, (

n

= 5). Den fluorescens i ubehandlede HeLa-celler blev arbitrært sat til 1.

Derudover har vi undersøgt, om antioxidanter kan dæmpe mitokondrie superoxid ophobning fremkaldt af luft plasma. NAC eller cPTIO var i stand til at aftage produktionen af ​​mitokondrie superoxid (figur 5b). Som luft plasma aktiverer JNK- og p38-medierede signaleringsveje (figur 4a-b og fig S2), blev muligheden for, at plasma-aktiveret signaltransduktionsprocesser er involveret i mitokondrie ROS akkumulering undersøgt. Vi fandt, at kinaseinhibitorer SB203580 og SP600125 kunne underminere plasma-induceret mitokondrisk superoxidfrembringelse (figur 5b), hvilket indebærer, at plasma kan inducere ROS-produktion i mitokondrierne i en JNK- og p38-afhængig måde.

Fordi luft plasma inducerede dannelsen af ​​cellulære ROS /RNS (figur 2) og mitokondrie ROS (figur 5a) og sammenbruddet af det mitokondrielle transmembranpotentiale (A ^ m) [2], undersøgte vi, om ROS /RNS kunne knyttes til luften plasma- induceret mitokondriel dysfunktion ved behandling HeLa-celler med luft plasma i nærvær af antioxidanter NAC eller cPTIO. Vi overvågede mitokondrielle transmembranpotentiale (A ^ m) efter plasmabehandling i fravær eller nærvær af NAC eller cPTIO under anvendelse af mitokondrier-specifikke probe JC-1. Air plasma eller H

2O

2 behandling induceret stigende intensitet af grøn /rød fluorescens (ca. 3,3-fold eller 2,1 gange på 12 timer og 2,9-fold eller 3,6 gange ved 24 timer, henholdsvis), der bekræfter, at både plasma og H

2O

2 kan inducere et fald i a ^ m (figur 5c). NAC eller cPTIO viste delvis bedring virkninger på faldet i ATm induceret af plasma eller H

2O

2 behandling (figur 5c), hvilket antyder, at luft plasma-induceret ROS /RNS kan spille en rolle i mitokondriel dysfunktion. Fordi signaltransduktionsprocesser ligger til grund for plasma-inducerede fald i ATm er ukendte, vi afgøres, om hæmmere af JNK og p38 kunne afbøde plasma-induceret skade på mitokondrier. På lignende måde, inhibitorer af JNK og p38 (SP600125 eller SB203580) var i stand til at mildne virkningerne af plasma og H

2O

2 på Aijjm falde, selv om det ikke resulterer i normal A ^ m (figur 5c). Disse resultater antyder, at luft plasma producerer ROS /RNS, hvilket fører til aktivering af signaltransduktion via JNK eller p38. Samtidig ROS /RNS synes at inducere sammenbruddet af A ^ m, som er delvist medieret gennem JNK- og p38 signaltransduktion

ROS /RNS generation inducerer plasma-induceret apoptotisk celledød via aktivering af cellulær JNK- og p38-medieret signal transduktioner og mitokondriel dysfunktion

til bestemmelse luft plasma-induceret celledød, vi først afprøvet muligheden for, at ROS /RNS var ansvarlige for luft plasma-induceret celledød ved behandling HeLa-celler med luft plasma i nærvær af antioxidanter NAC eller cPTIO. Forbehandling med NAC og cPTIO svækkede plasma-induceret celledød (49,5% ± 2,2% og 38.86% ± 4,2%, henholdsvis figur 6a og fig S3), der bekræfter, at ROS /RNS er impliceret i plasma-induceret celledød. Fordi der ikke er nogen god kontrol for RNS ligner brugen af ​​H

2O

2 som en kanonisk kontrol for ROS, vi også testet, om NaNO

3 kunne inducere apoptose, troværdig involverer NO og RNS genereret fra NaNO

3. NaNO

3 forfremmet celledød ved højere koncentrationer end gjorde H

2O

2 (figur S3-S4). Ifølge dette resultat, grunden NaNO

3 ikke inducerer effektiv celledød er, at den ikke generere effektive RNS /ROS i modsætning til luft plasma eller H

2O

2 (figur S4).

(a) Antioxdizing midler (NAC og cPTIO) eller kinaseinhibitorer (SP600125 og SB203580) delvist reddet plasma-induceret celledød. Data er vist som middelværdi ± S.E.M. (

n

= 10). (B) Plasma-induceret celledød blev delvis ophævet i JNK1 /2 (siJNK1 /2) eller p38 (sip38) knockdown-celler. Til overvågning plasma-induceret celledød blev ATP-baserede celleviabilitetstest udføres i nærvær af kontrol, JNK1 /2, eller p38 siRNA. Data er vist som middelværdi ± S.E.M. i tre eksemplarer fra tre uafhængige forsøg (

n

= 3). Cellelevedygtighed af ubehandlet HeLa cellepopulation blev arbitrært sat til 100%. Immunoblotting med anti-JNK og p38 antistoffer blev udført for at bekræfte knockdown. * P 0,01, ** p 0,05. (C) – (d) Air plasma induceret Bax translokation til mitokondrierne. Den plasma- eller H

2O

2-behandlede celler blev yderligere inkuberet i 6-24 timer. Efter 6-24 timers inkubation blev celler fikseret med 3,7% formaldehyd. Bax (grøn) blev farvet anti-Bax-antistof og MitoTracker blev anvendt til farvning af mitokondrier (Red). Bax (grøn) og mitokondrie (rød, MitoTracker) fluorescens blev vurderet, 6 h (d) og 24 timer ((c) og (d)) efter eksponering for luft plasma i 5 minutter ved fluorescens konfokal mikroskopi. Bax blev fordelt diffust i ubehandlede celler (ikke-behandlet). Men efter behandling med plasma, blev Bax lokaliseret til mitokondrierne, baseret på overlapningen af ​​Bax og MitoTracker fluorescens billeder (Merge, gul). DAPI blev anvendt til nuklear farvning (blå). Hvid bar var gennemsnitlige forstørrelse på billedet (10 uM). (E) Bud dannet et proapoptotiske kompleks med Bd-XL følgende plasmabehandling. (F) Air plasma induceret differentiel celledød i human lunge adenocarcinom A549 og normale lunge fibroblast MRC5-cellelinier. A549 og MRC5-celler blev behandlet med luft plasma jets og derefter inkuberet yderligere i 24 timer. Efter høstning og farvning af celler med anti-annexin V-FITC og PI, blev celledød evalueret med flowcytometri. Værdierne repræsenterer middelværdien (S.E.M.) fra tre uafhængige forsøg. (G) En foreslåede model for luft plasma jet-induceret apoptose i HeLa celler gennem ROS /RNS produktion, ulovlig indtrængen på celler, aktivering af signaltransduktionsveje, og skade på mitokondrier.

For at undersøge rolle JNK og p38 MAPK pathways i luft plasma-induceret apoptotisk celledød, anvendte vi deres specifikke inhibitorer, SP600125 (hæmmer af JNK) og SB203580 (inhibitor af p38 MAPK). Når celler blev forbehandlet med SP600125 eller SB203580 før luft plasma jet eksponering, blev den apoptotiske celledød population reduceret til 59,3% ± 2,3% og 52,0% ± 9,7%, sammenlignet med celledød induceret af plasma jet alene (85,4 ± 3,4%) (figur 6a og fig S3), hvilket antyder, at signaltransduktion via JNK og p38 er delvist involveret i plasma-induceret celledød. For at få mere indsigt i de roller JNK og p38 i plasma-induceret celledød, blev celle levedygtighed JNK- eller p38-udtømte celler analyseret efter plasma behandling ved at måle ATP fra levedygtige celler. Vi fandt, at plasma-inducerede formindskelse i cellelevedygtighed blev svækket af JNK1 /2 siRNA eller p38 siRNA (figur 6b).