PLoS ONE: Den malignt pleura effusion som en model til at undersøge intratumoral Heterogenitet i Lung Cancer

Abstrakt

malignt pleuraekssudat (MPE) kan være nyttig som en model til at studere hierarkisk progression af cancer og /eller intratumoral heterogenitet . For at styrke grundlaget for udviklingen af ​​MPE-modellen til disse formål, vi satte os for at finde beviser for tilstedeværelsen af ​​kræft stamceller (CSC) i MPE og demonstrere evne til at opretholde intratumoral heterogenitet i MPE-primære kulturer. Vores undersøgelser viser, at

kandidat

lunge CSC-udtryk signaturer (PTEN, Oct4, hTERT, Bmi1, EZH2 og SUZ12) er tydelige i cellepellets isoleret fra MPE, og MPE-cytopatologi etiketter også

kandidat

-CSC (CD44, cMET, MDR-1, ALDH) subpopulationer. Øvrigt i primære kulturer, der bruger MPE som kilde til både tumorceller og tumormikromiljøet (TME), er

kandidat

CSC opretholdes over tid. Dette giver os mulighed for at leve sortere

kandidat

CSC-fraktioner fra MPE-tumor mix på grundlag af overflademarkører (CD44, c-MET, uPAR, MDR-1) eller forskelle i miljøfremmede metabolisme (ALDH) . Således MPE-primære kulturer giver en vej til at udvinde

kandidat

CSC befolkninger mod individuelle (isogene) MPE-tumorer. Dette vil give os mulighed for at teste, om disse celler kan blive diskrimineret i funktionelle bioassays. Tumor heterogenitet i MPE-primære kulturer fremgår af variabel immunolabeling, forskelle i koloni-morfologi, og forskelle i spredning satser celle subpopulationer. Kollektivt, disse data berettiger løbende udvikling af MPE-modellen til undersøgelse af intratumoral heterogenitet, tumor-TME interaktioner, og fænotypiske validering af

kandidat

lunge CSC, ud over at give retning for præklinisk udvikling af rationelle lægemidler

Henvisning:. Basak SK, Veena MS, Oh S, Huang G, Srivatsan E, Huang M, et al. (2009) Den malignt pleura effusion som en model til at undersøge intratumoral Heterogenitet i lungekræft. PLoS ONE 4 (6): e5884. doi: 10,1371 /journal.pone.0005884

Redaktør: Mauricio Rojas, Emory University, USA

Modtaget: 17. december, 2008; Accepteret: April 28, 2009; Udgivet: 12 juni 2009

Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Public Domain erklæring hvori det hedder, at når det først er i det offentlige rum, dette arbejde kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål

Finansiering:. Finansiering af undersøgelse, som de Veterans Affairs Biomedical forskningsmidler. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-dødelighed i verden. Aktuel terapi er relativt ineffektive, og 5-års overlevelse er ca. 15%. Intratumoral heterogenitet muligvis ligger til grund modstand lungekræft til nuværende behandlinger; derfor, der tegner sig for intratumoral heterogenitet kan være en vigtig nøgle til at udvikle vellykkede behandlingsstrategier for lungekræft. Desværre er de nuværende modeller for lungekræft begrænset omfang for at studere tumor heterogenitet. Maligne pleuraekssudat (MPE) tilbyder en unik mulighed for at kulturen en bred vifte af kræftceller fra et enkelt individ, for at afgrænse og karakterisere forskellige intratumoral heterogenitet findes i fremskreden lungekræft.

Begrundelsen for at vælge den maksimalt tilladelige fejl, et regionalt fremskredent stadium af lungekræft, som varsler en dårlig prognose, som en model til at undersøge intratumoral heterogenitet er dobbelt. Første, en evolutionær model af carcinogenese forudsiger, at avancerede sygdomstilstande er mere tilbøjelige til at skildre heterogenitet [1]. For det andet, baseret på personlige observationer over flere års studier MPE [2], [3], [4], [5], vidste vi, at primære kulturer afledt af MPE oprindeligt viste markant kultur heterogenitet på vej til oprettelse morfologisk homogen kræft cellelinier. Men havde vi ikke tidligere har undersøgt den biologiske eller tidsmæssige grundlag af disse bemærkninger i et prospektivt måde.

Der er ingen etablerede måder at kultur MPE med målet om at bevare intratumoral heterogenitet. Således har vi satte sig for at udvikle en primær kultur model

de novo

. Denne model inkorporerer MPE-flydende komponent og ekstraheret stromale celler i en tumor mikromiljø (TME), der nøje simulerer den

in situ

miljø. Vores data indikerer, at inkorporering af disse elementer synes at bevare tumor heterogenitet. Da der kan opstå tumor heterogenitet skyldes en hierarkisk progression af transformeret epitel [6], [7], vi hypotese, at inkluderet i blandingen af ​​tumorceller i MPE er celler, som kan fungere som kræft stam- eller progenitorceller. Dette håndskrift indeholder proof of concept, at

kandidat

CSC kan fraktioneres fra MPE primære kulturer. Dette beviser berettiger videreudvikling af MPE-modellen til undersøgelse af intratumoral heterogenitet og studiet af

kandidat

CSC-fænotyper.

Materialer og metoder

MPE isolation, forarbejdning og kultur

Alle emner gennemgik skriftligt informeret samtykke ved en proces, der er godkendt af den institutionelle gennemgang bord på Veterans Affairs-Greater Los Angeles Healthcare System (VAGLAHS). Alle emner var veteraner og aktive eller tidligere rygere, og MPE-prøver blev erhvervet af store volumen thoracenteses. Prøver blev behandlet som beskrevet i figur 1. Kort beskrevet efter centrifugering (200 x g, 20 minutter, stuetemperatur), blev cellepellets resuspenderet i en ficoll densitetsgradient. Den maksimalt tilladelige fejl-Supernatanten blev sterilt filtreret og anvendt til formuleringen af ​​

s

rimær

c

ULTUR

m

edium [pcm; DMEM-H (HyClone, UT) + 30% v /v sterilt filtreret MPE-flydende komponent + Penicillin-G /streptomycin 1.000 U /ml og amphotericin B 0,25 ug /ml (Omega Scientific, CA)]. Udvælgelsen af ​​de 30% v /v brøkdel af MPE-flydende komponent blev empirisk afledt. Fordi de vigtigste opløselige og /eller cellulære bestanddele, der bidrager til opretholdelsen af ​​tumor heterogenitet i MPE-primære kulturer er (er) ikke kendt, og da der er effusion-til-effusion variabilitet i koncentrationerne af opløselige faktorer, udvælgelse af 30 % v /v MPE-flydende komponent var baseret på observation af primære kulturer ved lysmikroskopi. Kort fortalt, monitorerede vi tre forskellige maksimalt tilladelige fejl i primære kulturer indeholdende enten 100%, 70%, 50%, 30% og 10% komponent MPE-fluid. Vi evaluerede kultur integritet og variabilitet ved mikroskopi, og målt fraktionerne af flydende døde celler (ved trypanblåt-farvning) i hver tilstand over flere dage. Der var ingen påviselige kvalitative forskelle i kultur integritet eller variabilitet, og ingen kvantitative forskelle i flydende døde celler blandt de 70%, 50% og 30% v /v MPE-fluidbetingelser. De 100% og 10% v /v MPE-betingelser havde en stigning i celledød i to ud af tre effusioner. Denne observation kombineret med den praktiske overvejelse, at MPE-væske komponent var

den

begrænsende faktor for varighed af eksperimenter med primære kulturer, førte os at bruge 30% v /v MPE i de resterende tilfælde.

MPE blev ekstraheret fra det pleurale hulrum af lungecancerpatienter. Den indsamlede MPE var

sedimenteret (200 × g)

og

cellepelleten

blev adskilt fra MPE væske. Cellepelleten blev resuspenderet i minimum essentielt medium indeholdende MPE-væske og lejret på en

Ficoll gradient

. Den nukleeret cellefraktion, som var stort set blottet for erythrocytter i de fleste tilfælde blev indsamlet fra indskyde af Ficoll gradient og suspension medium, og forarbejdet til farvning (

H Abcam # 33403); primære umærket anti-cMET (mus IgG2a, Abcam # 49210), primær umærket anti-MDR-1 (Mouse monoklonale, Chemicon # Mab4338), og anti-uPAR (Santa Cruz Biotech # 13522). Sekundære antistoffer anvendt til undersøgelsen: Goat F (ab ‘) 2 anti-muse IgG (H + L) -PE-Cy.5.5 (Caltag laboratorier # M35018) og ged anti-mus F (ab’) 2 IgM (Jackson ImmunoResearch )

cytopatologi og immunolabeling

Cell klynger blev undersøgt ved hjælp af fasekontrast mikroskopi (Leica -. Leitz DMRBE) på overdækkede objektglas, eller ved lysmikroskopi efter fiksering og farvning. For de sidstnævnte, celler fikseret i ethanol (Fischer Scientific, PA) eller Z-fix (Anatech, MI) blev sedimenteret at generere en celle knap, som blev paraffinindstøbte. For IHC blev snit (5 um) afparaffineres og rehydreret i xylen og ethanol. Antigen-genvinding [10 mM citronsyre (pH 6), 70 ° C, 30 min, to gange med mellemliggende vandvask) blev udført, hvorefter objektglassene blev afkølet til stuetemperatur og successivt skyllet med deioniseret vand og PBS. Endogen peroxidaseaktivitet blev standset (PBS + 2% hydrogenperoxid), og prøverne blev sekventielt blokeret [1% bovint serumalbumin /PBS, stuetemperatur 1 time, efterfulgt af museserum (Santa Cruz Biotechnology) i 30 min, stuetemperatur] . Vævssnit blev derefter vasket to gange med PBS, inkuberet med det sekundære antistof (HRP-konjugeret gede anti mus, Santa Cruz Biotechnology, 30 minutter, stuetemperatur), skyllet med PBS og eksponeret til DAB substrat kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA ). Negative kontroller typisk anvendes det sekundære antistof alene i fravær af mærkning med det primære. De farvede sektioner blev observeret under mikroskop (Leica – Leitz DMRBE eller Olympus IX71), og de optagne billeder blev analyseret under anvendelse af Openlab software. De positivt farvede celleområder blev estimeret ved anvendelse Image Pro Plus software. Cell klynger blev manuelt defineret ved hjælp af billeder fase og den uregelmæssige AOI værktøj og de resulterende grupper blev segmenteret baseret på en empirisk bestemt positiv farvning tærskel. Procent af positivt farvede celler blev estimeret baseret på den fraktionerede område farvning inden for den samlede klynge området.

Revers transkriptase-PCR (RT-PCR)

RNA blev ekstraheret fra den primære MPE og kultur isolater hjælp Trizol reagens og Fast Track 2.0 mRNA isolation kit (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA). 500 ng af mRNA var revers transskriberet under anvendelse af RT (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) ifølge producentens anbefalinger. To pi aliquot af det syntetiserede cDNA blev anvendt til PCR til amplifikation af PTEN, Oct4, Bmi1, hTERT, SUZ12 og EZH2 gener. De anvendte primere var som følger:

PTEN

Fremad – 5 ‘GGACGAACTGGTGTAATGATATG 3’, reverse 5’TCTACTGTTTTTGTGAAGTACAGC 3 ‘,

Oct4

Frem- 5’CAACTCCGATGGGGC FTT 3′, og Reverse -5 ‘CTTCAGGAGCTTGGCAAATTG 3’

Bmi1

Fremad – 5 ‘AATCTAAGGAGGAGGTGA 3’, reverse 5 ‘CAAACAAGAAGAGGTGGA 3’,

hTERT

Forward -5 ‘GGAATTCTGGAGCTGCTTGGGAACCA 3’, reverse 5’CGTCTAGAGCCGGACACTCAGCCTTCA 3 ‘,

SUZ12

Fremad – 5 ‘GATAAAAACAGGCGCTTACAGCTT 3’, og Reverse 5 ‘- AGGTCCCTGAGAAAATGTTTCGA – 3’,

EZH2

Forward 5’TTGTTGGCGGAAGCGTGTAAAATC 3 ‘, Reverse 5’ TCCCTAGTCCCGCGCAATGAGC 3 ‘. For

PTEN

amplifikation, de var som følger: indledende denaturering ved 94 ° C i 4 minutter, efterfulgt af 32 cyklusser ved 94 ° C for1 minut, 57,5 ​​° C i 1 minut og 72 ° C i 3 min. En endelig ekstension ved 72 ° C i 10 minutter blev anvendt. Amplifikationsbetingelserne for

Oct4

var en indledende denaturering i 5 minutter ved 95 ° C efterfulgt af 32 cyklusser ved 95 ° C i 30 sekunder, 58 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sekunder med en endelig forlængelse ved 72 ° C i 5 min. Amplifikationsbetingelserne for

Bmi1

: indledende denaturering ved 94 ° C i 4 min efterfulgt af 32 cyklusser ved 94 ° C i 1 min, 53 ° C i 1 min, 72 ° C i 1 min, og en endelig forlængelse i 7 min ved 72 ° C. For

hTERT

amplifikationsprodukterne var: en indledende denaturering ved 94 ° C i 4 min, efterfulgt af 32 cyklusser ved 94 ° C i 50 sekunder, 52 ° C i 50 sekunder, 72 ° C i 1 min, og en endelig forlængelse ved 72 ° C i 7 min. For SUZ12 og EZH2 amplifikation: indledende denaturering ved 94 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 30 cykler af 94 ° C i 30 sekunder; 55 ° C i 30 sekunder; 72 ° C i 30 s, og en 7 minutters endelig udvidelse ved 72 ° C. PCR-produkter blev separeret på 8% TBE (50 mM Tris-borat pH 8,0, 1 mM EDTA) geler efterfulgt af ethidiumbromidfarvning. Geler blev analyseret under anvendelse af Kodak 1D software.

Flowcytometri og Aldefluor assay

FACS analyser af primære dyrkede MPE celler blev udført ved standard mutichannel FACS analyse under anvendelse af en FACSCalibur cytometer (Becton Dickinson, San Jose , CA) og FCS Express analysesoftware (De Novo software, Ontario, Canada). Både ikke-adhærente og adhærente celler blev opsamlet og samlet. Celler i primær kultur blev løsnet under anvendelse behandling med trypsin /Versine, vasket med PBS indeholdende 2% BSA, og direkte mærket med fluorochrom-mærkede primære antistoffer eller umærket primært antistof med fluorochrom-mærkede sekundære antistoffer (som angivet nedenfor). Både primære og sekundære antistof koncentrationer blev konsekvent fastholdt på 1 pg /1 × 10

6 celler; Cellerne blev mærket i 45 minutter ved stuetemperatur og successivt vasket tre gange i PBS indeholdende 2% FBS, resuspenderet i PBS og opbevaret på is før FACS-analyser. Den Aldefluor (StemCell Technologies, Durham, NC, USA) assay, som måler aldehyddehydrogenase (ALDH) aktivitet, blev udført ifølge producentens vejledning. MPE-celler fra primær kultur blev suspenderet i Aldefluor assaybuffer indeholdende ALDH-substrat, Bodipy-aminoacetaldehyd (Baaa; 1,5 mM) og inkuberet i 50 minutter ved stuetemperatur. For at verificere specificitet, blev en parallel prøve inkuberet under identiske betingelser, men i nærvær af et 10 gange molært overskud af ALDH-inhibitor, diethylaminobenzaldehyde (DEAB). Denne resulterende fald i fluorescens intensiteten af ​​ALDH-positive celler blev brugt til at kompensere flowcytometeret analyser.

Resultater

MPE-egenskaber, forarbejdning, og primær kultur

Til udvikle en model til at studere lungekræft endophenotypes i primær kultur, vi fraktioneret cellen og flydende rum af MPE (figur 1). De kliniske karakteristika for de udgydelser, der blev anvendt til at generere dette datasæt var typiske for MPE (tabel 1 og 2, se nedenfor). Syv ud af ni effusioner var malign på basis af cytopatologiske diagnose (tabel 1). I to MPE, den endelige cytopatologi fortolkning fra 100 ml specimen prøve var “meget mistænkeligt, men usikkert”; disse sager blev medtaget, fordi væksten af ​​tumor var tydelig i primære kulturer (herunder

in vivo

i ét tilfælde, data ikke vist). Tidligere undersøgelser havde længe vist, at plating effektivitet og afledning af primære kulturer fra kliniske lungekræft prøver er dårlig, og afhænger både af dyrkningsbetingelser og vært-relaterede faktorer [8], [9], [10], [11]. Men disse undersøgelser ikke supplere de primære tumor kulturer med komponenter fra

in situ

tumor mikromiljø (TME), muligvis fordi den primære eller eneste mål var at etablere udødelige tumorcellelinjer. I virkeligheden, for at udlede “ren tumor” cellelinjer i definerede betingelser, tog alle tidligere tilgange foranstaltninger til at minimere “forurening” af kulturer med TME-elementer. Derfor hvis tydelig tumor celle subpopulationer eksisteret i individuelle tumorer, der afhang af TME elementer for overlevelse, så bruger nogen kunstige TME kan have medført en vækst fordel til specifikke tumor celle-undergrupper i en kontinuerlig kultur-system. Således er det muligt, at kræft celle modeller blev “udvalgt til” af kulturen TME, der blev brugt til at udlede tumorcellelinjer.

Vi ræsonnerede, at den fuldtallige tumor celle endophenotypes ville være bedst undersøgt i primære kulturer, der er indarbejdet autolog TME. Således i et forsøg på at opretholde intratumoral heterogenitet

ex vivo

, både tumor-ledsager nukleeret cellepopulation og den flydende komponent af MPE blev anvendt til at berige den primære kultur-TME. For at overvinde den tidligere indregnet ineffektivitet for etablering af primære tumor kulturer, og er baseret på empiriske iagttagelser, der er beskrevet i de metoder, valgte vi den “optimale” tilstand som værende 30% MPE-væske komponent blandes v /v i basen medium, der indeholder antibiotika (primær dyrkningsmedium eller PCM). I

PCM

, både primær kultur og serielle passager blev opretholdt med højere diversitet i morfologi, og kulturer syntes at være mere robust (i forhold til parallel vækst i føtalt bovint serum, data ikke vist). Desuden udnyttelsen af ​​en 30% v /v-brøkdel af MPE-væske tilladt os at bevare denne begrænsende reagens til længere varigheder af eksperimenter med primære kulturer. Under anvendelse af denne metode, vi etableret primære kulturer af MPE-tumorer fra alle syv forsøg.

Indledende analyser indikerede, at supernatanten var stærkt beriget med inflammatoriske cytokiner, med koncentrationer af interleukin (IL) 1, IL 6, CXC kemokin ligand 10 (IP10), CC kemokinligand 2 (MCP1) og vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF), der blev anslået til at være 10 ng /ml. Disse og andre faktorer, som sandsynligvis stammede fra tumor, stromale og /eller cirkulerende celler i MPE (tabel 2), bidraget til en kompleks blanding af cytokiner, kemokiner og vækstfaktorer i MPE-flydende komponent. Med hensyn til de cellulære MPE-komponenter, nukleerede celletællinger varierede fra 1,3 × 10

8 til 2,5 x 10

9 celler per liter effusion. Den fremherskende cirkulerende celletype i TME var lymfocytter (gennemsnit ± StDev: 60 ± 26% af den samlede 681 ± 560 WBC /pl), med signifikant ( 1%) fraktioner af PMN, makrofager, monocytter og mesotelceller (tabel 2) i næsten alle udgydelser. Således, i form af deres cirkulerende celle sammensætning og biokemi (de var alle ekssudater) [12], de udgydelser vi studerede var typiske for MPE.

Dokumentation for intratumoral heterogenitet i udvundet MPE-tumor prøver

Figur 2A viser repræsentative H E i tumor prøvemateriale fra MPE viser klynger og organiserede sfæroider af varierende morfologi, og celle /stromale kompositioner (20 × eller 100 ×). (B) IHC for kandidat CSC markør udtryk. Tumor prøvemateriale fra MPE blev immunolabelled for

kandidat

CSC markører, herunder CD44 (40 × og 400 ×), cMET (100 × og 400 ×), MDR-1 (100 × og 400 ×), og ALDH -1 (40 × og 200 ×).

MPE-tumorer udtrykker CSC-markører impliceret i stamcelle ekspansion eller pluripotens programmer

generelt opstår tumorer på grund af en unormal anholdelse under vævs-differentiering [29], [30]. En af de første manifestationer af differentieringen-arrest er, at der er en udvidelse af progenitorceller pool. Således kan molekylære underskrifter fra stamceller tjene som

kandidat

CSC-biomarkører. I denne forbindelse havde dyreforsøg impliceret PTEN for passende vedligeholdelse og differentiering af den perifere lunge progenitorcellepopulationen [31]. PTEN promotor nedregulering fremgår i human lungecancer [32], implicerer denne vej i sin udvikling og /eller progression. Telomerase (hTERT) aktivering bidrager til lungekræft patogenese [33], og hTERT almindeligvis aktiveres i lungekræft. Sammen med p16 (INK4a), hTERT synes at være nødvendig for celle udødelighed, der kendetegner både stamceller og tumorceller [34], og dets ekspression kan indikere en dynamisk ændring i den del af den immortaliserede fænotype [35], [36]. Delte markører mellem

kandidat

CSC og stamceller også veje, der medierer celle selvfornyelse og pluripotens. Oct4 er en embryonal markør, der er associeret med pluripotens, og er almindeligt anvendt til mærkning af CSC-fænotypen [21], [37]. Tilsvarende er reguleringen af ​​den pluripotente tilstand epigenetisk styret af strukturelle ændringer i kromatin [38], [39], [40]. Transkriptionel kontrol under den pluripotente tilstand anvendes af Polycomb gruppen (PcG) af proteiner, der arbejder for at ændre kromatin struktur. SUZ12, EZH2, og Bmi1 er komponenter af PCG komplekser, og fordi deres ekspression i udviklingen er karakteristisk for væv stamceller, har de også blevet anvendt til at mærke

kandidat

CSC-fænotype [6], [7] , [41]. For at teste om kunne detekteres disse molekylære signaler af

kandidat

CSC i MPE-tumorer, blev RNA ekstraheret fra kerneholdige cellefraktioner og RT-PCR for disse markører blev udført. Vi fandt, at disse

kandidat

CSC-biomarkører blev udtrykt i forskellige MPE-tumorer (figur 3). Disse data antydede, at lungen CSC-fænotype blev opretholdt i MPE trods den inflammatoriske miljø i MPE-TME, i modsætning til nogle konventionelle postulater om CSC niche miljø. Måske var det, fordi CSC var beskyttet (som beskrevet) fra opløselige TME i tumor konglomerater, der er dokumenteret i MPE. Endnu vigtigere er, disse resultater også indstille scenen for dynamisk spore disse molekylære signaler som eksperimentelle ændringer i kulturen betingelser er indført i bestræbelserne på at berige for CSC-fænotype.

Expression profiler af PTEN, Oct4, hTERT, BMI1 , SUZ12, og EZH2 blev undersøgt ved revers transkriptase-PCR. RNA ekstraheres fra celle med kerne pellet af MPE blev revers transkriberet og cDNA’et blev anvendt i PCR-amplifikation af de respektive gener. PCR-produkter blev separeret på 10% TBE-geler, efterfulgt af farvning med ethidiumbromid og analyseret under anvendelse af Kodak 1D software. PTEN, hTERT, SUZ12, EZH2 blev ensartet udtryk i alle MPE, mens BMI1 og Oct4 udtryk ikke blev påvist i de enkelte prøver. Beta tubulin blev anvendt som en belastning kontrol.

Dokumentation for intratumoral heterogenitet i MPE-primære kulturer

MPE-primære kulturer blev etableret i pcm. I disse betingelser, de primære kulturer viste forskellige morfologier (Figur 4A) og variabelt langsomme vækstrater. De primære kulturer tog typisk adskillige uger til “modne” (som defineret ved vækst i dyrkningsbeholderen nærmer 70-80% konfluens). Over dette interval blev klynger og kugleformede strukturer, der blev observeret i den indledende MPE-cytopatologi ikke godt bevaret. Ikke desto mindre er de primære kulturer viste en fænotypisk heterogenitet, der ikke tidligere havde været undersøgt. Under deres evolution, blev primære kulturer altid består af kolonier med varierende morfologier (flydende aggregater, der udelukker trypanblåt, kæmpe celle kolonier, fibroblastoid og brostensbelagte klynger), selvom det er i den samme kolbe med en tilsyneladende identisk TME (figur 4A). Disse kolonier syntes at udvide med forskellige satser, hvilket tyder på, at de havde forskellige proliferative indeks, selvom det er i en “fælles” miljø. Vi ræsonnerede, at hvis CSC, ligesom væv stamceller, havde en reduceret omsætning, så forskelle i spredning ville tillade os at adskille fraktioner beriget for CSC. For at teste, om en sådan strategi var muligt med MPE- primære kulturer, vi udviklet en levende celle sortering strategi, der brugte carboxyfluoroscein succinimidylesteren (CFSE) i en ordning test-mærkning for at fraktionere celler baseret på forskellige replikering indekser. CFSE er en membran permeabel reagens, der spaltes af intracellulære esteraser til opnåelse af et fluorescerende amin-reaktiv metabolit, som forbliver i cytoplasmaet i ugevis. Hver gang celler undergår deling, er mængden af ​​CFSE stede i hver dattercelle halveret. Celler, der ikke replikerende beholde etiketten. Således

, hvis

CSC er langsomt replikerende,

derefter

etiketten fastholde befolkningen skal beriges for CSC. Selvom de cellulære slægter, der omfatter etiketten bevarer delmængde skal defineres bedre, disse pilot, proof-of-concept studier antydet, at MPE-tumor fraktionering baseret på forskelle i spredning indekser var mulig (se etiketten-fastholde cellepopulation-M1, som opstår over tid i

PCM,

figur 4B). Sammenfattende forskelle i morfologi, proliferation, overflade markør og metaboliske egenskaber muligvis afspejle diskrete endophenotypes af cancerceller i MPE. Selvom de funktionelle korrelater forbundet med hver af disse funktioner er endnu undersøges yderligere, vores resultater viser, at i MPE-primære kulturer, undersøgelse af intratumoral heterogenitet er mulig.

(A) Morfologiske heterogenitet i primær kultur. Tre forskellige MPE (prøve A, prøve B og prøve C) dyrket i pcm blev vurderet for kolonimorfologi. Hver kolonne (A, B, og C) repræsenterer en særskilt prøve. Repræsentative mikrofotografier af koloni heterogenitet ved fasekontrastmikroskopi på dag 3, 15 og 20 af primær kultur (række 1, 2 og 3, henholdsvis) er præsenteret. De mikrofotografier i Rækker 1, 2 og 3 er på forstørrelser på 40 ×, 100 × og 400 × hhv. (B) MPE-subpopulationer i primær kultur kan fraktioneret på grundlag af forskelle i spredning: Repræsentative flow histogrammer af Day 1 versus dag 9 i et CFSE-mærket primær kultur. Med ekspansion, subpopulationer, der er proliferativ mister CFSE etiketten, og dem, som er hvilende bevarer etiketten. I dette eksempel

på dag 1, 96,14%

af tællingerne ligger inden for regionen gated ved M1; på

dag 9, 8,36%

af tællingerne ligger inden for regionen gated af M1.

Rationelt fraktionering MPE-primære kulturer til at sortere den formodede CSC-delpopulation

med molekylære signaturer tyder på, at CSC er til stede i MPE, vi næste testet, hvis vi kunne fange den

kandidat

CSC fra MPE-tumorer. På modning blev MPE-primære kulturer sorteres på basis af

kandidat

CSC-markører. Interessant nok i hver testet hidtil tilfælde overfladen immunofænotype af celler i primær kultur generelt angivet en tilsyneladende ekspansion i CD44 + fraktionen (figur 5). Hvorimod celler var næsten ensartet positive for CD44-ekspression, fraktioner var mere variabelt positive for cMET, CD166 [42], og uPAR [43] ekspression (figur 5). Derudover bruger en fluorescerende assay, der blev rapporteret til at sortere formodede CSC fra lungecancer, brystcancer og multipelt myelom [26], [27], [28] på grundlag af forskellen ALDH aktivitet, en lille brøkdel af MPE-afledte primære tumorer vises ALDH

hi /CD44

+ fænotype (figur 6). Kollektivt, disse data viste, at

kandidat

CSC-fraktioner kunne holdes adskilt fra primære kulturer af MPE-tumor.