PLoS ONE: Høj Log-Scale Udvidelse af Functional menneskelige naturlige dræberceller fra navlestrengsblod CD34-positive celler til adoptiv Cancerimmunterapi

Abstrakte

Immunterapi baseret på naturlige dræberceller (NK) celle infusioner er en potentiel adjuverende behandling for mange kræftformer. Sådan terapeutisk anvendelse i mennesker kræver et stort antal funktionelle NK-celler, der er blevet udvalgt og udvides ved hjælp af klinisk kvalitet protokoller. Vi etablerede en yderst effektiv cytokin-baseret system for kultur

ex vivo

udvidelse af NK-celler fra hæmatopoietiske stamceller og stamceller fra navlestrengsblod (UCB). Systematisk forfining af denne to-trins system under anvendelse af en hidtil ukendt klinisk kvalitet medium resulterede i en terapeutisk anvendelig cellekultur protokol. CD56

+ CD3

– NK celle produkter kunne rutinemæssigt genereres fra frisk valgt CD34

+ UCB celler med en gennemsnitlig udvidelse af 15.000 gange og en næsten 100% renhed. Desuden er vores protokol har kapacitet til at producere mere end 3-log NK celle udvidelse fra frosset CD34

+ UCB celler. Disse

ex vivo

-generated celle produkter indeholder NK celle delmængder differentieret udtrykke NKG2A og killer immunglobulin-lignende receptorer. Endvidere UCB-afledt CD56

+ NK celler genereret af vores protokol ensartet udtrykke høje niveauer af aktivering NKG2D og naturlige cytotoksiske receptorer. Funktionel analyse viste, at disse

ex vivo

-generated NK-celler effektivt målrette myeloide leukæmi og melanom tumorcellelinjer, og mediere cytolyse af primære leukæmiceller ved lave NK-mål-forhold. Vores kultur-system eksemplificerer et stort gennembrud i at producere rene NK celle produkter fra et begrænset antal CD34

+ celler til cancerimmunterapi

Henvisning:. Spanholtz J, Tordoir M, Eissens D, Preijers F, van der Meer A, Joosten I, et al. (2010) Høj Log-Scale Udvidelse af Functional menneskelige naturlige dræberceller fra navlestrengsblod CD34-positive celler til adoptiv Cancerimmunterapi. PLoS ONE 5 (2): e9221. doi: 10,1371 /journal.pone.0009221

Redaktør: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Public de la Santé (CRP-Santé), Luxembourg

Modtaget: 16 oktober, 2009; Accepteret: 21 Januar 2010; Publiceret: 15 feb 2010

Copyright: © 2010 Spanholtz et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af de Radboud University Nijmegen Medical center og Glycostem Therapeutics. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Arbejdet vedrører GBGM® medium for ex-vivo generation af NK-celler, som er et kommercielt tilgængeligt cellekulturmedium tidligere udviklet af Glycostem Therapeutics. Køb og /eller brug af GBGM® medium er ikke begrænset af patentrettigheder. Glycostem Therapeutics har fungeret som sponsor i en del af denne forskning. Forfattere Spanholtz og Tordoir er medarbejdere i Glycostem, videnskabeligt instrueret af Dolstra. Erstatning for Dolstra engagement i dette projekt betales af Glycostem til det samlede forskningsbudget for RUNMC. RUNMC og Glycostem samarbejder på grundlag af et forskningssamarbejde aftale, som regulerer de ovennævnte interesser. Hverken Dolstra eller RUNMC har en økonomisk interesse i Glycostem. Alle forfattere bekræfter, at dette ikke ændrer deres tilslutning til alle PLoS ONE politikker på datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere. Forfatterne er enige om at gøre frit ledige materialer og oplysninger i forbindelse med offentliggørelsen, der er rimeligt af andre anmodes om med henblik på akademiske, ikke-kommerciel forskning.

Introduktion

Natural Killer (NK) celler er CD56

+ CD3

– store granulære lymfocytter, som udøver medfødte immunitet mod virusinfektioner og cancer [1]. NK-celler genkender og efterfølgende reagere på virusinficerede og transformerede celler uden forudgående immunisering, dybest set gennem resten af ​​signaler fra inhibitoriske og aktiverende receptorer [2]. Derfor har NK-celler er tidligere blevet beskrevet som lovende effektorer til adoptiv immunterapi mod cancer [3]. Anti-tumor potentiale NK-celler er blevet bedst demonstreret under terapi af leukæmi patienter med allogen stamcelletransplantation (SCT). Ruggeri et al. påvist, at NK-celle alloreactivity kan styre tilbagefald af akut myeloid leukæmi (AML) uden at forårsage graft-versus-host sygdom (GVHD) i fastsættelsen af ​​HLA-uoverensstemmende haploidentical allogen SCT [4]. Desuden har haploidentical NK-celle infusioner sammen med IL-2 i en ikke-transplantation indstilling blevet forbundet med komplet hæmatologisk remission i dårlig prognose patienter med AML [5]. Disse opmuntrende resultater påpeger, at allogen NK celle-baserede immunterapi kan være et lovende terapeutisk strategi for AML i både den ikke-transplantation og efter transplantationen indstillingen [5], [6].

Til dato mest klinisk undersøgelser udnytter allogene NK-celler til adoptiv immunterapi er blevet udført med NK-celler valgt blandt leukapherese produkter ved immunomagnetiske perler selektionsprotokoller [7] – [12]. For at omgå begrænsningerne i celleantal, renhed og tilstand af aktivering af sådanne blodafledte NK-celler,

ex vivo

udvidelse af NK-celler med højere renhed vil lette infusion af et større antal af aktiverede NK-celler i patienter med en relativ stor tumor byrde eller tillader flere NK celle infusioner [8], [13], [14]. Derfor udvikling af innovative strategier, der muliggør dannelsen af ​​klinisk relevante NK celle produkter med høj celle numre, høj renhed og funktionalitet lover et stort gennembrud i NK-celle-baserede immunterapi.

I denne undersøgelse har vi udviklet en cytokin- metode til storstilet udvidelse af funktionel CD56

+ NK celler fra hæmatopoietiske stamceller og stamceller. Lignende undersøgelser er blevet udført tidligere fokus på enten CD34

+ hæmatopoietiske stamceller (HPC) fra knoglemarv (BM) eller navlestrengsblod (UCB) [15] – [17]. Men de fleste af disse dyrkningssystemer er uegnede til klinisk anvendelse på grund af anvendelsen af ​​animalske sera, animalske proteiner og støttende feeder cellelinier. Endvidere er de fleste af disse metoder gav kun begrænset NK celleantal for vellykket adoptiv immunterapi til cancerpatienter. For at overvinde disse mangler, vi etableret en to-trins kultur ordning, hvor vi brugte en roman klinisk kvalitet medium til at generere mere end 3 til 4 log fold-udvidet funktionel CD56

+ NK celler fra frisk valgt eller kryopræserveret CD34

+ UCB celler. The CD56

+ NK celleprodukter genereret ved denne fremgangsmåde har en meget høj renhed, indeholde forskellige NKG2A og killer immunoglobulin-lignende receptor (KIR) ekspression modne delmængder og effektivt lyserer AML og faste tumorceller. Disse resultater eksemplificere, at denne kultur-systemet kunne holde meget lovende for den

ex vivo

generation af klinisk kvalitet NK celle produkter til cellulær immunterapi mod kræft.

Resultater

ex vivo

stamcelle ekspansion og NK Cell Differentiering

Formålet med denne undersøgelse var at udvikle en effektiv cytokin-baserede

ex vivo

kultur-system til udvidelse af CD34

+ celler efterfulgt af den efterfølgende log målestok af CD56

+ CD3

– NK-celler. For at identificere et egnet medium til klinisk anvendelse ekspansion og differentiering af NK-celler, testede vi forskellige basale medier med en to-trins

in vitro

differentiering ordning (figur 1). I første omgang, vi sammenlignet medierne H3000, Stemline I og Stemline II såning 1 × 10

4 CD34

+ celler ved hjælp Metode I. Vi har registreret en kraftig stigning i CD34

+ celletal i alle tre medier, hvilket resulterer i en gennemsnitlig ekspansion sats for alle eksperimenter (n = 15) i 48 ± 7 gange og 78 ± 27 fold efter 1 og 2 ugers dyrkning hhv. Den samlede celle ekspansion var forbundet med et gradvist fald i frekvensen af ​​CD34

+ -celler fra 84% ± 16% på dag 0 Til 47% ± 14% i uge 1 og 17% ± 9% i uge 2 (figur S1a og S1b).

i fremgangsmåde i-III forskellige kombinationer af cytokiner blev testet som beskrevet detaljeret i Materialer og fremgangsmåder startende med forskelligt antal oprindeligt podet CD34

+ -celler. I fremgangsmåde I og II, blev NK-celler genereret fra frisk udvalgte UCB donorer og varigheden kultur var 5 uger. Ved fremgangsmåde III, CD34

+ celler blev anvendt fra kryopræserverede UCB donorer og dyrkningsperioden var 6 uger. Endelig diagrammet viser som NK produkter blev anvendt og vises som resultater i tal og supplerende materiale.

Dernæst undersøgte vi, om den udvidede UCB-afledte CD34

+ celler var i stand til at differentiere til CD56

+ NK-celler. Differentieringen trin blev overvåget ved analyse af celleoverflademolekyler CD34, CD117, CD56, CD94 og CD161, som er beskrevet til at blive udtrykt i forskellige humane NK-celle udviklingsstadier

in vivo

[18]. Vi observeret efter 3 uger samlede kultur varighed, at procentdelen af ​​CD34

+ -celler faldt yderligere, mens CD56

+ CD161

+ CD94

+ NK-celle population steg til 10-18% (f.eks figur 2a). Derefter befolkningens af CD56

+ CD161

+ CD94

+ celler steg hurtigt til 60-77% efter 4 uger og 80-96% efter 5 ugers kultur (f.eks figur 2a).

CD34-berigede UCB celler blev ekspanderet i to uger ved hjælp af tre forskellige medier (H3000, Stemline i og Stemline II) og efterfølgende differentieret i NK-celler i tre ekstra uger i samme basale medium ved fremgangsmåde i (se figur 1). Cellekulturer blev ugentligt analyseret for celleantal og fænotype ved hjælp FCM. (A) Et repræsentativt eksempel på antigenekspression under to-trins dyrkningsperiode hjælp H3000 medium. En uge efter indtræden af ​​NK-celle differentiering trin 2 (dvs. efter 3 uger samlede kultur varighed) CD56

+ CD161

+ CD94

+ NK celle befolkningen stiger og når høj renhed efter 3 ugers differentiering (dvs. uge 5). (B) Mean CD56

+ celle frekvens under de 5 ugers dyrkningsperioden for tre forskellige medier, der er blevet testet i parallelle eksperimenter under anvendelse af 3-6 UCB donorer. (C) Mean samlede CD56

+ NK celle tal efter første såning af 1 × 10

4 CD34

+ UCB celler under 5 ugers dyrkning ved hjælp Metode I. data repræsenterer en teoretisk beregning baseret på den faktiske ekspansion satser CD56

+ celler. Samlet udbytte af CD56

+ -celler ved hver uge blev beregnet ved at gange udvidelseshastigheden per uge med antallet af dyrkede celler. (D) Mean fold ekspansion af totale celler efter indledende såning af 1 × 10

4 CD34

+ UCB celler under 5 ugers dyrkning ved hjælp Metode I. data repræsenterer en teoretisk beregning baseret på de faktiske ekspansion satser for totale celler .

Selvom vi ikke kunne påvise signifikante forskelle mellem de forskellige basale medier, renheden af ​​CD56

+ celle produkt optrådte lidt højere med H3000 medium (77% ± 24%, n = 3 ) og Stemline i medium (75% ± 21%, n = 6) sammenlignet med Stemline II-medium (66% ± 17%, n = 6) (figur 2b). Desuden blev en tendens i retning af højere CD56

+ celletal med Stemline I medium (interval 4 × 10

6-1,1 × 10

8 CD56

+ celler; n = 6) efterfulgt af H3000 (5,2 × 10

6-5.4 × 10

7 CD56

+ celler; n = 3) og Stemline II medium (interval 1 × 10

6-2 × 10

7 CD56

+ celler, n = 6) (figur 2c). Den gennemsnitlige totale celleekspansion efter 5 ugers dyrkning med Stemline I mediet var ~4,400 gange og med H3000 medium ~3,200-fold, men kun ~850-fold ekspansion med Stemline II (figur 2d). Disse resultater viser, at dyrkningsbetingelserne støtte en effektiv udvækst af CD56

+ NK celler med en høj renhed af det endelige NK-celle produktet efter en dyrkningsperiode på 5 uger under anvendelse af forskellige basale medier.

Superior Udvidelse af Ekstremt Pure NK Cell Products blev opnået ved hjælp af en roman Klinisk Grade Medium

Selvom høje ekspansion satser og renheder kunne opnås med nuværende kommercielt tilgængelig basale medier, vi ikke var tilfredse med renheden af ​​CD56

+ NK celle produkt efter 5 ugers dyrkning under anvendelse af fremgangsmåde i (figur 1). For yderligere at øge effektiviteten af ​​vores kultur metode, testede vi en nyformulerede serum-frit medium, betegnet Glycostem basalvækstmedium (GBGM®), som er fremstillet under GMP betingelser og egnet til kliniske anvendelser. Desuden er vi lidt tilpasset cytokin forhold under ekspansion skridt, da vi observeret, at en udvidelse af CD34

+ celler samt totale celler var mest fremtrædende i den første uge af kultur (figur S1a og S1c). Endvidere at øge balance mod ekspansion af NK-stamceller er føjet IL-15 i stedet for TPO til en udvidelse medium fra dag 9 i kultur, og udeladt Flt3L i differentieringen medium (figur 1). Under anvendelse af denne modificerede fremgangsmåde II, kultur i GBGM® resulterede i den højeste samlede celle ekspansion i den første uge og efterfølgende differentiering i CD56

+ NK celler (figur 3 og figur S1E). Den samlede celle ekspansion sats i GBGM® steget til 15.000 gange (interval 16,991-73,666, n = 3) (figur 3a). Vigtigere,

ex vivo

generation af CD56

+ NK celler i GBGM® gav en signifikant højere renhed på 99% ± 1% (n = 3) sammenlignet med H3000 med 88% ± 3% (n = 3; p 0,05) og Stemline I med 63% ± 24% (n = 3; p 0,05), (figur 3b). Disse data viser, at opfindelsen modificerede dyrkningssystem anvendelse af de nyformulerede GBGM® mediet resulterer i mere end 4-log udvidelse af rent humant NK-celler fra frisk valgt CD34

+ UCB celler.

Den nye GBGM® medium blev sammenlignet med to tidligere testede medier i NK-celle generation af systemet ifølge fremgangsmåde II (se figur 1). Cellekulturer blev ugentligt analyseret for celleantal og fænotype ved hjælp FCM. (A) Fold udvidelse af totale celler efter indledende såning af 1 × 10

4 CD34

+ UCB celler blev bestemt i løbet af 5 uger af kultur. Data viser beregning baseret på de faktiske ekspansion satser for totale celler og vises som gennemsnit ± SD af tre forskellige eksperimenter. (B) CD56

+ celle frekvens under differentieringen scenen for tre forskellige medier, der er blevet testet i parallelle eksperimenter under anvendelse af tre UCB donorer. Data er vist som middelværdi ± SD. * Repræsenterer en p-værdi på 0,05

Fænotypisk Profil af CD56

+ NK celler fra Udvidet CD34

+ Celler

Flowcytometrisk analyse viste, at.

ex vivo

-generated NK-celler efter 5 ugers dyrkning indeholdt en homogen cellepopulation udviser høj ekspression af CD56 i fravær af CD3 (figur 4a). En høj frekvens af denne CD56

+ CD3

– NK-celle population viste ekspression af CD94, mens kun en begrænset delmængde var positiv for CD16. Desuden NK celle produkterne fremvist ensartet og relativt høj ekspression af NKG2D og de naturlige cytotoksicitet receptorer (NCR) NKp30, NKp44 og NKp46, mens NKG2A blev mere differentielt udtrykt (figur 4b og figur S2a). Udover disse resultater, vi har registreret høj ekspression af 2B4 (CD244) og NKR-P1 (CD161) typiske NK celle receptorer, mens NKG2C og NKp80 var fraværende eller udtrykt ved relativt lave niveauer. Derudover observerede vi høj ekspression af MHC klasse I (HLA-ABC) og cytokinreceptor kæder for IL-2 og IL-15 (CD122; IL-2 /IL-15Rβ) og SCF (CD117 c-kit-R) , som er vigtige for NK-celledifferentiering, ekspansion og aktivering.

(a) Flowcytometrisk analyse af en NK-celle-produkt fra CD34

+ UCB progenitorceller. Cellerne ved 5 ugers dyrkning blev analyseret for ekspression af CD56, CD3, CD94 og CD16. (B) Ekspression af et repertoire af receptorer er vigtige for regulering af NK-celleaktivitet, herunder C-type lectin receptorer, naturlige cytotoksiske receptorer og cytokinreceptorer. Histogrammer viser ekspression af antigenet af interesse (sort histogram) sammenlignet med den specifikke isotype kontrol (grå histogram). (C) Køb af KIR

+ NK celle-undergrupper under

ex vivo

NK celle generation fra udvidet CD34

+ UCB celler. KIR udtryk blev bestemt i uge 4 og 5 under differentiering trin FCM.

KIR repertoire analyse viste store individuelle forskelle i frekvensen af ​​KIR-udtrykkende NK celle-undergrupper mellem forskellige UCB donorer. KIR

+ NK celle delmængder kunne allerede påvises i uge 4 af kultur og forblev forholdsvis stabilt indtil udgangen af ​​den kultur periode på uge 5 (figur 4c og figur S2b). Mens nogle CD56

+ NK celle produkter indeholdt positive celler for alle fire KIR fænotyper analyseres (figur 4c), andre manglede specifikt KIR2DL1 /DS1

+ delmængde (Figur S2b). Generelt er KIR2DL2 /DL3 /DS2

+ delmængde var til stede i en højere andel i alle NK celle produkter analyseret hidtil, hvilket er i overensstemmelse med tidligere observationer, at genopretningen af ​​KIR2DL2 /DL3 /DS2

+ NK-celler er hurtigere i forhold til den KIR2DL1 /DS1

+ delmængde efter HSCT [19].

samlet set disse resultater viser, at UCB-afledte NK-celler genereret med vores optimerede kultur-system indeholder udviklingsmæssigt modne NK cellepopulationer, der udtrykker NKG2A , KIR og forskellige aktiverende receptorer.

Ex vivo

-Generated CD56

+ KIR

+ og CD56

+ NKG2A

+ NK-celler er funktionelt Reguleret af MHC klasse i Expression

Fænotypisk analyse viste, at vores

ex vivo

-generated NK celle produkter indeholdt op til 10% CD56

+ KIR

+ celler og en høj andel (40 -60%) CD56

+ NKG2A

+ -celler. Til bestemmelse cytolytisk aktivitet af disse delmængder og undersøge, om denne aktivitet er reguleret af de udtrykte inhibitoriske receptorer, udførte vi CD107a-baserede degranulering assays ved anvendelse HLA-negative K562-celler og KG 1 a-celler, der udtrykker relativt høje niveauer af HLA-ABC og -E (se tabel 1). Til disse forsøg brugte vi to

ex vivo

-generated NK celle produkter, der indeholdt ca. 15-30% CD56

+ CD107a

+ celler efter co-kultur med K562 (figur 5 og figur S3 ). I modsætning hertil KG1a-celler næppe stimuleret degranulering af disse NK celleprodukter, hvilket indikerer, at cytolytisk aktivitet inhiberes af HLA-ekspression. Tilsvarende omkring 35% af CD56

+ KIR2DL2 /DL3

+ delmængde degranulerede ved udløsning af K562, mens kun en lille procentdel ( 5%) udtrykte CD107a efter co-kultur med KG1a (figur 5a og figur S3). Efter aftale med disse resultater, degranulering ved CD56

+ KIR2DL2 /DL3

+ delmængde kunne specifikt inhiberes af K562-celler transficeret med HLA-C-gruppen 1 allel HLA-CW3, mens transfektion af HLA-C-gruppen 2 allel HLA-Cw4 allelen havde ikke virkning (fig S4). Endelig har vi observeret, at også den dominerende CD56

+ NKG2A

+ delmængde var i stand til effektivt degranulere som respons på K562 (28% CD107a

+ -celler), mens degranulering dybt KG1a var lav nok på grund af relativ høj ekspression af HLA-E-molekyler (figur 5B og tabel 1). Disse data viser, at KIR

+ og NKG2A

+ delmængder inden for UCB-afledte NK celleprodukter er fuldt responsiv mediere stærk degranulating aktivitet, som reguleres af ekspressionen af ​​MHC klasse I molekyler på de engageret målceller.

Ex vivo

-generated NK-celler ved hjælp af Metode II med GBGM blev inkuberet alene, eller 18 timer med MHC klasse i-negative K562 eller MHC klasse i-udtrykkende KG1a celler på en E:T forhold på 1:01. Celler blev derefter farvet for CD56, CD3, KIR eller NKG2A, og degranulering antigen CD107a. (A) degranulering af total CD56

+ CD3

– NK-celler og KIR2DL2 /DL3

+ NK-celle delmængde udvidet i 5 uger fra CD34

+ UCB celler. Density plots er gated på CD56

+ CD3

– NK-celler og histogram plots viser CD107a degranulering af KIR2DL2 /DL3

+ NK-celler. (B) degranulering af total CD56

+ CD3

– NK-celler og NKG2A

+ NK-celle delmængde udvidet i 6 uger fra CD34

+ UCB celler. Density plots er gated på CD56

+ CD3

-. NK-celler og histogram plots viser CD107a degranulering af NKG2A

+ NK celler

ex vivo

-Generated NK-celler effektivt Target leukæmi og Solid tumorceller

for at bestemme cytotoksiske potentiale

ex vivo

-generated NK celle produkter, vi udførte flowcytometri-baserede cytotoksicitet analyser ved hjælp af forskellige myeloide leukæmi-cellelinjer (K562, Lama, Kasumi og KG1a), primære AML-celler og to melanoma cellelinier (BLM og FM3).

Ex vivo

-generated NK-celler i GBGM® medierede effektiv lyse af K562-celler (~ 40% og -90% efter 4 og 24 timer, henholdsvis) ved en meget lav E:T forhold på 02:01 ( Figur 6a). Endvidere kunne dyb lysis observeres mod MHC klasse I-udtrykkende KG1a-celler (-20% og ~ 40% efter 4 og 24 timer, henholdsvis). Interessant, NK-celler dyrket i GBGM® viste højere cytotoksiske og degranulating aktivitet sammenlignet med NK-celler dyrket i H3000 medium fra samme UCB donor (figur S5a-c). Desuden fandt vi, at GBGM-afledte NK-celler viste højere udtryk for de aktiverende receptorer NKG2D, NKp30, NKp44 og NKp46 (figur S5d).

(a) Specifik cytotoksicitet af et CD56

+ NK-celle produkt (98% renhed), mod de myeloide leukæmi-cellelinier K562 og KG 1 a. Specifik lysis blev bestemt efter 4 og 24 timer efter co-kultur i et FCM-baserede cytotoksicitet assay på en E:T forholdet 2:01. Data er vist som middelværdi ± SD af tredobbelte brønde. (B) degranulering af CD56

+ NK celler blev bestemt ved FCM som procentdelen af ​​CD107a

+ -celler. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD af tredobbelte brønde. (C) IFNy-produktion blev bestemt ved ELISA og afbildet som middel ± SD af tredobbelte målinger. (D) Specifik cytotoksicitet af et andet CD56

+ NK-celle produkt (95% renhed), mod de myeloide leukæmi-cellelinier K562, Lama, Kasumi og KG1a, og melanomcellelinjer BLM og FM3. Specifik lysis blev bestemt efter 18 timers co-kultur i et FCM-baserede cytotoksicitet assay på en E:T forhold på 01:01. Data er vist som middelværdi ± SD af tredobbelte prøver. (E) degranulering af CD56

+ NK celler blev bestemt ved FCM som procentdelen af ​​CD107a

+ -celler efter natten over stimulering med forskellige mål. Data er vist som middelværdi ± SD af tredobbelte prøver. (F) IFNy-produktion blev bestemt ved ELISA og afbildet som middel ± SD af tredobbelte målinger. (G) Specifik cytotoksicitet af en tredje CD56

+ NK-celle produkt (97% renhed) mod primære AML-celler fra 5 forskellige patienter. Specifik lysis blev bestemt efter 24, 48 og 72 timers co-kultur i et FCM-baserede cytotoksicitet assay på en E:T forhold på 03:01. Data er vist som middelværdi ± SD af tredobbelte prøver.

Udover effektiv lyse af K562, også de leukæmicellelinjer Lama og Kasumi samt BLM og FM3 melanomceller blev effektivt lyseret ved NK-celler (Figur 6d). Interessant nok blev et monolag af FM3 melanomceller fuldstændig ødelagt inden for en time co-kultur med NK-celler (film S1). Høj NK cellemedieret cytolytisk aktivitet mod leukæmi og melanom-cellelinjer var associeret med en høj procentdel af CD107a

+ NK celler (figur 6b og 6e) og betydelig produktion af IFNy (figur 6C og 6F).

Endelig har vi undersøgt om primære leukæmi celler er modtagelige for drab af

ex vivo

-generated NK-celler. Derfor udførte vi cytotoksicitetsassays med AML-celler fra fem forskellige patienter. Primære AML-celler fra tre patienter (Pt 2, 4 og 5) blev i det væsentlige dræbt inden for 3 dages co-kultur ved lav E:T forhold på 03:01 omend mindre potent end K562-celler (figur 6 g). Disse resultater indikerer, at UCB-afledte NK-celler genereret af vores effektive dyrkningsmetode har evnen til at dræbe myeloid leukæmi og faste tumorceller.

Ex vivo

Generering af NK-celle Produkter fra Frozen CD34

+ UCB Celler

for at undersøge om vores NK celle ekspansion protokol kunne tilpasses til en klinisk anvendelig procedure, har vi udført eksperimenter med GBGM® medium, hvor vi udeladt LIF og MIP-1α i lav- dosis cytokin blanding, fordi disse cytokiner er ikke tilgængelige kliniske kvalitet. Endvidere har vi udførte disse eksperimenter med CD34

+ celler valgt fra optøet UCB ifølge fremgangsmåde III afbildet i figur 1. Optøning og CD34

+ celleselektion resulterede i at opnå 1,30 ± 0,61 × 10

6 (interval 0,84 -2,50 × 10

6) CD34

+ UCB celler fra seks donorer (tabel 2).

Ex vivo

generation ved hjælp af metode III resulterede i et beregnet NK celle udbytte på 4,6 ± 2,4 × 10

9 (interval 1,9-7,8 × 10

9) NK-celler med en renhed på 95 % efter 6 ugers kultur (tabel 2). Udvidelsen sats lå mellem 1500 og 6500 gange startende med CD34

+ celler fra kryopræserveret UCB. Disse data viser, at overførslen af ​​vores beskrevet procedure kliniske gældende betingelser er muligt, og genererer rene NK celle produkter med mere end 3-log ekspansion potentiale.

Diskussion

Her rapporterer vi en hidtil ukendt og yderst potent totrins kultur fremgangsmåde til

ex vivo

generation af funktionelle NK celler til klinisk anvendelse til behandling af patienter med AML og andre maligniteter. Vi implementerede en ny klinisk kvalitet basal medium, betegnet GBGM®, hvilket letter effektive

ex vivo

HPC og NK celle udvidelser. Vores metode gør det muligt generation af funktionelle humane NK-celler mere end 4-logs fra CD34

+ celler beriget fra frisk indsamlet UCB og mere end tre-log fra frossen UCB. Så vidt vi ved, er dette den første demonstration af, at human CD56

+ NK celler kan effektivt genereres

ex vivo dele på sådanne høj log-skala størrelsesorden.

Lignende undersøgelser har blevet rapporteret tidligere ved hjælp af forskellige kombinationer af cytokiner med eller uden feeder cellelinjer og anvendelse af animalske og humane sera [15] – [17], [20] – [24]. For eksempel en nylig undersøgelse af Kao et al. viste, at serumfrie ekspanderede CD34

+ -celler kunne opdeles i en NK-celle produkt med en gennemsnitlig renhed på 40% -60% efter 5-7 ugers dyrkning. De nåede en beregnet gennemsnitlig udvidelse på 300-fold, men anvendes kalvefosterserum under NK-celle generation fase [16]. Sammenlignet med disse nyligt offentliggjorte data, vores nye kultur-system lover godt, hvilket resulterer i mere end tre-log-skala

ex vivo

generation af NK celle produkter med næsten 100% renhed ved hjælp af klinisk kvalitet medium, humant serum, og cytokiner. De eneste cytokiner, der i øjeblikket eller i den nærmeste fremtid ikke tilgængelig som klinisk kvalitet reagenser er LIF og MIP-1α, som er en del af lavdosis understøtter cytokin cocktail. forsøg under anvendelse CD34

+ selekterede celler fra kryopræserveret UCB afslørede imidlertid, at disse to faktorer kan kasseres uden tab af NK-celledifferentiering potentialet i vores raffinerede protokol (tabel 2). Tager den høje ekspansion potentiale, vores system tillader dannelsen af ​​et gennemsnitligt antal på 4,6 × 10

9 yderst rene NK-celler fra frosne CD34

+ UCB celler (tabel 2). Endvidere indledende opskalering eksperimenter i cellekultur poser afslørede, at proceduren kultur genererer op til 2 × 10

9 NK-celler med den samme fænotype og funktion som vist for NK-cellepopulationer genereret i vævskulturplader (data ikke vist) . Disse resultater viser, at vores raffineret

ex vivo

ekspansion protokol har potentiale til at producere flere NK-celler (dvs. 2 × 10

9 med en renhed mellem 95-99%) i forhold til rensning af moden NK-celler fra en 15 liters lymphapheresis procedure, som giver 0,25 × 10

9 ± 0,14 × 10

9 (interval 0,01-0,47 × 10

9) NK-celler overensstemmelse med de publicerede data for McKenna et al. i 2007 [7] – [12]

NK-celle-produkt genereret af vores metode vises reproducerbart en aktiveret fænotype med en høj ekspression af CD56 og forskellige aktiverende receptorer, såsom NKG2D, NKp30, NKp44 og NKp46.. I overensstemmelse med tidligere observationer, vores

ex vivo

-generated NK-celler dyrket i nærværelse af IL-2 og IL-15 viste en CD56

lyse fænotype hvoraf kun en delmængde udtrykt CD16 [20], [21], [25], [26]. De resulterende NK celle produkter indeholdt 40-60% CD56

+ NKG2A

+ NK celler og op til 10% af CD56

+ population udtrykt forskellige KIR’er, selvom der var betydelig variation i hyppigheden af ​​KIR

+ NK-celle delmængder mellem de forskellige UCB donorer. Ifølge NK celledifferentiering model af Freud og Caligiuri, vores

ex vivo

-generated NK celle produkter overvejende indeholder udviklingsmæssigt modne NK-celler, der udtrykker høj CD94 /NKG2A, CD117 og /eller KIR medierende potent cytolytisk aktivitet mod K562-celler [27]. Et mindretal af CD56

+ NK celler i vores produkter er fænotypisk umodne mangler NKG2A og KIR. Dog kan disse umodne NK-celler har potentiale til at modne

in vivo

efter adoptiv overførsel. Interessant Cooley et al. har vist, at CD56

+ NKG2A

-KIR

– NK-celler er i stand til at modne

in vitro

på kultur med IL-15 og en stromal feeder cellelinje [28]. Fænotypisk analyse har afsløret, at UCB-afledte NK-celler genereret med vores protokol display udtryk for cytokinreceptorer, herunder IL-2 /IL-15Rβ (CD122), som kan fremme

in vivo

overlevelse, ekspansion og modning ved overførsel efter immunosuppressiv terapi.

den stærke cytotoksiske aktivitet af vores UCB-afledte NK-celler mod forskellige tumorcellelinier samt cytolyse af primære AML-celler blev vist ved specifik lyse, CD107a-medieret degranulering og produktionen af ​​IFNy. De fleste eksperimenter blev udført med AML cellelinier og primære AML-celler, som har vist sig at være et attraktivt mål for NK cellemedieret immunterapi [5], [6]. Interessant, vi også observeret effektiv lyse af melanom-cellelinjer, der styrker det terapeutiske potentiale af vores produkt NK-celler også mod ikke-hæmatologiske kræftformer. Senest har flere undersøgelser vist, at NK cellemedieret cytotoksicitet og anvendelse af NK-celle-baseret immunterapi kan være en effektiv metode til behandling af melanom, som også blev påvist i et fase I forsøg ved anvendelse af NK-92 cellelinien [ ,,,0],29] – [31]

Som konklusion fremgangsmåden præsenteret her tilvejebringer et vigtigt fremskridt for generering klinisk relevante NK celleprodukter fra hæmatopoietiske stamceller og progenitorceller med høj celleantal, høj renhed og funktionalitet til brug i NK. cellebaserede immunterapi.