PLoS ONE: Aktivering af c-MET inducerer en Stem-Ligesom Fænotype i Human Prostata Cancer

Abstrakt

Prostatakræft består af sekretoriske celler og en population af umodne celler. Funktionen af ​​umodne celler og deres indbyrdes forhold med sekretoriske celler stadig dårligt forstået. Umodne celler har enten en hierarkisk relation til sekretoriske celler (celle model stamceller) eller repræsentere et inducerbart population spirende ved passende stimulering af differentierede celler. Hepatocytvækstfaktor (HGF) receptor c-MET udtrykkes specifikt i umodne prostataceller. Vores mål er at fastlægge den rolle, umodne celler i prostatakræft ved analyse af HGF /c-MET vej.

Gene-udtryk profilering af DU145 prostatacancerceller stimuleret med HGF afslørede induktion af en molekylær signatur i forbindelse med stamceller, karakteriseret ved opregulering af CD49b, CD49f, CD44 og Sox9 og nedregulering af CD24 ( ‘dæmme-lignende signatur «). Vi bekræftede købet af en stilk-lignende fænotype ved kvantitativ PCR, FACS-analyse og Western blotting. Endvidere HGF førte til aktivering af stamceller relaterede Notch vej ved opregulering af dets ligander Jagged-1 og Delta-lignende 4. Små molekyler SU11274 og PHA665752 målrettet c-MET-aktivitet var begge i stand til at blokere de molekylære og biologiske effekter af HGF. Knock-down af c-MET af shRNA infektion resulterede i signifikant reduktion og forsinkelse af ortotopisk tumor-dannelse i NMRI mus. Immunohistokemisk analyse i prostatektomi viste betydelig berigelse af c-met-positive celler ved den invasive front, og demonstreret co-ekspression af c-MET med stamceller-lignende markører CD49b og CD49f.

Det kan konkluderes, aktivering af c-MET i prostatacancerceller inducerede en stilk-lignende fænotype, hvilket indikerer en dynamisk relation mellem differentierede og stamceller-lignende celler i denne malignitet. Dens formidling af effektiv tumor-dannelse

in vivo

fremherskende receptor udtryk ved den invasive foran implicerer, at c-MET regulerer tumor infiltration i omgivende væv formodet ved køb af en stilk-lignende fænotype.

Henvisning: van Leenders GJLH, Sookhlall R, Teubel WJ, de Ridder CMA, Reneman S, Sacchetti A, et al. (2011) Aktivering af c-MET inducerer en Stem-lide fænotype i human prostatacancer. PLoS ONE 6 (11): e26753. doi: 10,1371 /journal.pone.0026753

Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: Januar 14, 2011; Accepteret: 3 oktober 2011; Udgivet: November 14, 2011

Copyright: © 2011 van Leenders et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Holland Organisation for Sundhedsforskning og Udvikling (ZonMw, giver 907-00-138, personlige tilskud til Dr. van Leenders, https://www.zonmw.nl/); Foundation for Videnskabelig Urologisk Forskning (SUWO); Foundation Adessium; Foundation Zabawas, Holland. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Inden prostata epitel, er vævshomeostase medieret af stamceller, der er bosiddende i den basale kirtelepitel [1]. Efter asymmetrisk deling stamceller giver anledning til transit-amplifikation celler, som er til stede i både basal og luminale epitel, og som endelig differentieres til luminale sekretoriske celler. Forskellige hindeagtige markører udtrykkes forskelligt i stilk og differentierede celler i godartede gnaver og menneskelige prostata epitel herunder Sca-1

+, α

6-integrin /CD49f

+, α

2-integrin /CD49b

+, CD133

+, CD117

+, CD44

+ og CD24

– [2] – [9]. Kombination af disse markører kan fremme afgrænse stængel, transit-forstærker og terminalt differentierede celler i normal epitel. For eksempel stamceller formodet udtrykkelig α

2β

1-integrin

+ /CD133

+, er transit-forstærker celler a

2β

1-integrin

+ /CD133

– og terminalt differentierede celler a

2β

1-integrin

– /CD133

-. [3], [7]

Cell populationer med biologisk kendetegn, der ligner dem af godartede stamceller er også blevet identificeret i maligne tumorer [10] – [13]. I prostatakræft, α

2β

1-integrin

+ /CD133

+ celler besidder styrken til selv-fornyelse og multi-retningsbestemt differentiering

in vitro

[8], [ ,,,0],14]. Desuden CD44

+ /CD24

– celler isoleret fra prostatakræft-cellelinier demonstrerer høj tumor-dannende potentiale

in vivo

[4]. På trods af deres tilsyneladende variabilitet i klonogene og tumorfremkaldende potentiale, er den gensidige relation mellem umodne og differentierede celler stadig dårligt forstået. I korrespondance til deres forhold i normale væv, har en streng hierarkisk relation mellem såkaldte cancer-stamceller (CSC) og differentierede celler blevet postuleret [12] – [14]. Ifølge denne model, CSCs er direkte og irreversible forfædre differentierede celler. For nylig, dog blev det påvist, at differentierede celler kan erhverve CSC funktioner i brystkirtler og tyktarmskræft [15], [16]. Især fænotypiske og biologiske egenskaber bidrog til stamceller kan opnås, når mere differentierede celler undergår epitelial-mesenkymale overgang (EMT) enten ved tvungen depression af E-cadherin eller af faktorer, der udskilles af mikro-miljø som hepatocytvækstfaktor (HGF ) [15], [16]. Da er stadig kontroversielt dens nøjagtige karakter og relation med andre celletyper, henviser vi til den celle population viser stamceller egenskaber som stamceller-lignende celler.

HGF og dens tyrosinkinasereceptor c-MET er vigtige mediatorer af organogenesen , vævsregeneration og sårheling [17]. Inden for den normale prostata epitel, er c-MET specifikt udtrykkes i basal og atrofiske luminale celler, hvor det putativt medierer regenerering af beskadigede sekretoriske kirtler [18], [19]. I prostatacancer, c-MET er til stede i lave niveauer, med et mindretal af celler, som viser høj proteinekspression [18], [20], [21]. Tidligere andre, og vi har vist, at c-met og basalcelle markør Keratin 5 co-udtrykkes i den samme cellepopulation i prostatacancer [14], [18]. Siden HGF /c-MET vej har en regulerende funktion i migration og invasion

in vitro

, vi har foreslået, at denne celle population er specielt udsat for infiltration i omgivende væv [18], [22].

der vides kun lidt om den rolle, c-MET i forhold til at dæmme-lignende celler i prostatakræft og hvordan

in vitro

undersøgelser om stamceller-lignende celler oversætte til faktiske kræft hos patienter. I denne undersøgelse viser vi, at aktivering af c-MET fører til induktion af en stilk-lignende fænotype i prostatacancer. Knock-down af c-MET yderligere stærkt reduceret tumor-dannelse i nøgne mus. Endelig viser vi, at c-MET præferentielt udtrykkes ved omkredsen af ​​humane prostatektomi prøver og er co-lokaliseret med dens ned-stream mål a

2-integrin og α

6-integrin. Disse data indikerer, at stamceller-lignende celler medierer tumor ekspansion på invasive forsiden af ​​prostatakræft.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Undersøgelsen blev godkendt af den nationale Animal Experiment Udvalg (DEC, 102-08-01, EUR1396). Alle patientprøver blev anonymt brugt efter passende skriftligt informeret samtykke og under godkendelse af de menneskelige etik Institutional Review Board (METC; MEC02.0957).

Celler og materialer

DU145 prostatakræft cellelinje og humane embryoniske nyre (HEK) 293T-celler blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). DU145 blev holdt ved 37 ° C /5% CO

2 i RPMI 1640 indeholdende 5% føtalt kalveserum (FCS) og penicillin /streptomycin (P /S) (Lonza, Verviers, Belgien). For stimulering eksperimenter blev DU145 celler seedet natten over i RPMI /FCS medium. Efter 1 dag blev mediet erstattet med 5% Dextran Charcoal (DCC) behandlet RPMI (Sigma, St. Louis, MO, USA). Efter tilpasning natten over, HGF (25 ng /ml; Sigma) blev tilsat til dyrkningsmedium og celler blev høstet ved inkubering med 2 mM EDTA (Sigma) i 20 min. Små molekyler SU11274 (1,0 uM; Sigma) og PHA665752 (0,1 uM; Calbiochem, Nottingham, UK). Opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) blev anvendt til c-MET inhibition

microarray analyse

DU145-celler blev stimuleret i 2, 8 og 24 timer med HGF eller vehikel, og RNA blev isoleret under anvendelse af RNAzol B reagens (Tel-test Inc., Friendswood, USA). Efter RNA-isolering med chloroform, isopropanol og ethanol blev DNA spaltet under anvendelse af DNA-free kit (Ambion, Huntingdon, UK). RNA kvalitet og mængde blev målt under anvendelse af RNA 6000 Nano kit på en 2100 Bioanalyzer (Agilent, Palo Alto, CA, USA). Prøver med RNA integritet antal 8,5 blev udvalgt. 5 ug totalt RNA fra stimulerede og kontrolprøver blev anvendt til fremstilling antisense biotinyleret RNA ifølge producentens én-cyklus-protokol (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). Hybridisering til Affymetrix Menneskelig U133plus2.0 GeneChips (54,614 probe sæt, der repræsenterer cirka 47.000 udskrifter), farvning, vask og scanning procedurer blev udført som beskrevet af Affymetrix (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA), og udført af Erasmus MC Center for BIOMICS. Microarray data blev behandlet og normaliseret ved hjælp af Affymetrix Microarray Suite-softwaren. RMA fraktil normalisering blev udført og ekspressionsvektorer værdier (EVS) mellem arrays blev normaliseret ved at sætte gennemsnittet af hver af de 6 arrays til 150; værdier 30 blev sat til 30. For hvert tidspunkt

2log forhold mellem HGF og bærerbehandlede celler blev beregnet. Array data er MIAME kompatibel og er blevet forelagt GEO (GSE16659). Kobling til andre databaser blev udført ved hjælp af SRS7; den Træstrukturvindue program blev anvendt til generering Heatmap billeder [23], [24].

Kvantitativ realtids-PCR

Kvantitativ realtids-PCR blev udført under anvendelse Taqman rxn PCR Core Reagents herunder MQ, Taq Buffer, MgCl

2, dNTP, Amplitaq G (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). De følgende prober blev anvendt: Hs02379687_s1 (CD24); Hs00174139_m1 (CD44); Hs01041017_m1 (CD49f); Hs00165814_m1 (Sox9); Hs00158148_m1 (CD49b). Mængden af ​​målgen blev normaliseret til GAPDH (Hs99999905_m1).

Til analyse af c-met-inhibitorer på CD49b blev totalt RNA isoleret med RNAzol B reagens (Tel-Test) ifølge fabrikantens protokol. RT-reaktionen blev udført med oligo (dT) 12-18-primer (Invitrogen, La Jolla, CA). Efter tilsætning af første-streng-puffer, dithithreitol, dNTP’er og RNAsin, blev RT-reaktioner initieret af MMLV-RT (Invitrogen) og inkuberet i 1 time ved 37 ° C. Kvantitativ PCR blev udført under anvendelse af SYBR-green mastermiksens (Applied Biosystems). CD49b frem 5′-CAG GCA CAC CAA AGA ATT GA-3 ‘, omvendt 5′-GAA GAA GCC GAG CTT CCA TA-3′, GAPDH frem 5’-ACT GTG GTC ATG AGT FTT TC-3 ‘, omvendt 5’ -cat GTT CGT CAT GGG TG-3 ‘, og PBGD fremadrettet 5′-CAT GTC TGG TAA CGG CAA TG-3′ og revers 5’-GTA CGA GGC TTT CAA TGT TG-3 ‘. Signaler blev analyseret ved ABI Prism 7700-system (Applied Biosystems). Mængde af målgener blev bestemt ved anvendelse af standard kurver fra serielle fortyndinger. Til bestemmelse af Notch-receptorer og ligander blev RT-PCR udført under anvendelse af primersæt og cyklusser som vist i tabel S1 ved en annealingstemperatur på 60 ° C.

Flowcytometri og Western blotting

til analyse af hindeagtige proteiner 0,5 × 10

6 DU145 celler blev inkuberet med anti-CD49b (1:500, Chemicon, Hampshire, UK), anti-CD49f (1:10,000, Abcam, Cambridge, UK), anti- CD44-FITC (1:200, BD, Franklin Lakes, NJ, USA), anti-CD24-PE (1:10; BD) og anti-CD133-PE (klon AC133; 1:100; Miltenyibiotec, Bergisch Gladbach, Tyskland ), i 50 pi PBS /2% FCS i 30 min. på is. Efter vask blev cellerne inkuberet med sekundære antistoffer mærket med Alexa Fluor 488 (1:500) i 15 min. Efter suspension i 300 pi PBS /2% FCS med Hoechst 33258 (2 ug /ml) for at selektere for levende celler, blev proteinekspression måles ved anvendelse af en FACSAria flowcytometer (BD) udstyret med tre lasere (407, 488 og 633 nm).

til analyse af Sox9 og c-met-proteinet, stimulerede og kontrolceller blev lyseret i RIPA-buffer (10 mM tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton × 100, 1% deoxycholat, 0,1% SDS, 5 mM EDTA) indeholdende proteinaseinhibitorer (Complete; Roche, Basel, Schweiz). Proteinkoncentrationer blev målt under anvendelse af Biorad protein-reagenser (BioRad Laboratories, Munchen, Tyskland). 40 ug totalt protein blev fyldt på en 10% SDS-PAGE-gel og overført til nitrocellulose papir (Protan, Schleicher og Schuell, Dassel, Tyskland). Efter blokering i 5% NFDM /TBST (Protifar, Nutricia, Zoetermeer, Holland) i 1 time, blots blev inkuberet ved 4 ° C natten over med 0,2 ug /ml anti-Sox9 (klon AF3075; R Santa Cruz). Efter vask blev blots inkuberet med 1:1,000 anti-ged-HRP eller anti-kanin-HRP (Dako, Glostrup, Danmark) i 1 time, behandles ved hjælp BM Chemiluminescence Blotting Substrate (Roche) og kvantificeret med ImageJ program.

MTT og celleadhæsionsassays

5,0 x 10

3 DU145 celler blev stimuleret i plader med 96 brønde med 25 ng /ml HGF for 0, 3 og 6 dage. Kulturer blev inkuberet med thiazolylblåt tetrazoliumbromid (MTT 5 mg /ml; AppliChem, Darmstadt, Tyskland) i 4 timer, hvorefter det metaboliske produkt blev suspenderet i 100 pi buffered DMSO og målt ved 570 nm med en BIO-RAD 550 mikropladelæser (Biorad). Til kvantificering af celleadhæsion, 3,0 × 10

5 stimulerede DU145-celler blev podet på 12-brøndsplader overtrukket med kollagen I (Becton Dickinson Labware, Bedford, UK). Efter adhæsion i 15 minutter. Blev pladerne vasket, inkuberet med 1 ml DCC medium indeholdende 5 mg /ml MTT, og optisk densitet blev bestemt.

Lentiviral infektion

HEK 293T-celler blev podet i kolber overtrukket med 0,1% gelatine /PBS og dyrket til 50-60% konfluens. Lentivirale partikler blev produceret efter transfektion af HEK 293T-celler med 20 ug vektor-DNA (pLKO.1 shRNA, ID167, klon NM_000245.x-502s1c1, Sigma) sammen med 15 ug pPAX

2 og 6 ug PMD

2G hjælp CaPO

4 udfældning, hvorefter dH

2O, 2,5 M CaCl

2 og HEPES bufret saltvand (pH 7,05) tilsat. Transfektionsblandingen blev efterladt til inkubering i 20-30 min. ved stuetemperatur, før den blev tilsat til HEK 293T-celler. De shRNA lentivirus-holdige cellekultursupernatanter blev opsamlet 24 og 48 timer efter transfektion, og passeres gennem et 0,45 um filter. For at bestemme transfektionseffektiviteten HEK 293T-celler blev samtidig transficeret med grønt fluorescerende protein (GFP). Scrambled shRNA (Sigma) blev anvendt som kontrol. DU145 blev derefter inficeret med de indsamlede virus (01:01) natten over og inficerede kloner blev udvalgt af fortyndingshyponatriæmi kloning.

ortotopisk injektion

1,0 × 10

5 DU145 celler blev injiceret i dorsolaterale lap af mandlige nu /nu Naval Medical Research Institute (NMRI) mus sammen med 1,0 x 10

6 PRSC prostata fibroblaster i 20 pi RPMI /DCC medium indeholdende humant HGF (25 ng /ml) [25]. Injektioner blev udført med en 30G microlance nål (Becton Dickinson, Alphen a /d Rijn, Holland) på en Luer spids mikroliter 700 injektionssprøjte (Hamilton, Bonaduz, Switserland) efter abdominal incision under anæstesi. Tumor volumen (TV) blev overvåget hver uge ved transrektal ultrasonografi (Endosonics Europe BV, Rijswijk, Nederlandene). Musene blev aflivet ved en TV 1000 mm

3 eller efter 3-4 måneder. Prostata blev histologisk analyseret sammen med abdominal lymfeknuder og lunger.

Immunhistokemi

Immunhistokemi for c-MET blev udført på 94 formalinfikserede, paraffinindlejrede radikale prostatektomi (RP). Dele af 4 um blev afvokset og rehydreret hjælp xylen og ethanol. Endogen peroxidase blev standset og antigen-genvinding blev udført i 15 min. af mikrobølgebestråling (700 W) i Tris-EDTA (pH = 9). Objektglas blev inkuberet med kanin-anti-humant c-MET (1:100; C12; Santa Cruz) natten over ved 4 ° C og visualiseret ved hjælp af EnVision systemet (DAKO). For kvantificering af c-MET, blev tilstedeværelsen af ​​stærkt positive celler scoret på omkredsen, arbitrært defineret som den ydre 2 mm af tumoren og sammenlignet med centrum.

For co-lokalisering undersøgelser, 6 væske N

2 frosne RP dias var acetone-fikseret og inkuberet med anti-c-MET (1:100), og muse-anti-humant CD49b (1:100; HAS-3; Abcam) eller rotte anti-human CD49f (1 :100; Abcam) natten over ved 4 ° C. Efter vask blev objektglassene inkuberet med svine-anti-kanin biogenin (1:150; DAKO). Kombineret med anti-muse eller anti-rotte-antistof mærket med Alexa 488 (1:100) i 30 minutter, efterfulgt af avidin-Cy3 (1 :100) kompleksdannelse i 30 min. ved stuetemperatur.

Statistik

Vækst virkninger af HGF og c-MET-hæmmere blev evalueret med Students

t

-test. Immunhistokemisk udtryk for c-MET i RP blev analyseret med Pearson χ

2 test. Tumordannelse hos mus blev vurderet ved anvendelse begge prøver, der alle bruger SPSS-version 15.0 (SPSS Inc., IL, USA). En to-sidet p-værdi under 0,05 blev betragtet som signifikant.

Resultater

Fund af HGF /c-MET regulerede gener

Forrige RT-PCR og Northern blot analyse påvist at c-MET udtrykkes i androgen-uafhængig prostatacancer-cellelinier DU145 og PC3, men ikke i androgen-afhængige LNCaP [18], [20]. Stimulering af DU145 med HGF resulterede i celle-spredning og migration i 2D-kultur (figur 1A), mens stjerneformige spirer dannes i 3D Matrigel matricer (figur 1b). Under spredning, opnået DU145-celler en spindel formular i modsætning til deres normale epithelioid form, mens cellevækst blev signifikant inhiberet med 21% efter 3 dage (p 0,003) og 10% efter 6 dage (p = 0,024) (figur 1C). Selvom PC3 besidder c-MET protein, havde HGF stimulation ikke fremkalde morfologiske ændringer (upublicerede observationer) -sagerne på grund af sin mangel på en funktionel α-catenin /E-cadherin kompleks [26].

A

, HGF inducerede transformation fra epithelioide celleklynger retning enkelt spindel celler i 2-dimensional kultur.

B

, I 3-dimensionelle Matrigel spirer stammede fra kompakte cellulære knuder efter HGF-stimulering.

C

, Cell spredning hæmmes med 21% (p 0,003) efter 3 dage og 10% (p = 0,024) efter 6 dages HGF stimulation (kontrol

sorte bjælker

-; HGF

grå søjler

+).

En

,

B

Original forstørrelse 40 ×.

For at udforske de molekylære veje er relevante for c-MET funktion i prostatakræft, vi udførte microarray udtryk analyse af DU145-celler stimuleret med HGF. Gener blev udvalgt baseret på en to-fold op eller nedregulering af mindst én probe sat til de 24 timers tidspunkt og en gennemsnitlig udtryk med en 1,41 ganges forskel. I alt 371 gener opfyldte disse kriterier, hvoraf 238 var op- og 133 nedreguleres af HGF (tabel S2); de øverste 20 op- og ned-regulerede gener er afbildet i figur 2A.

En

, Top 20 op- og nedreguleret gener efter HGF stimulering i 24 timer, kombineret med respektive gen -expression profiler efter stimulation i 2 og 8 timer. .

B

, Effekt af HGF på gener forbundet med prostata stamcelle fænotype

Vi fandt, at forskellige hindeagtige markører anvendes til stamceller valg blev forbedret efter 24 timer: α

2-integrin /CD49b, α

6-integrin /CD49f og CD44, mens CD24 blev nedreguleret (figur 2B). Transkriptionsfaktoren Sox9 blev også induceret af HGF. Sox9 er nødvendig for tidlig differentiering af prostata epitel under embryogenese og aktiveres i prostata carcinogenese implicerer en relevant funktion i umodne prostata celler [27]. Angivelse af to andre formodede prostata stamcelle markører CD133 og LGR5 var under detektionsgrænsen [14], [28].

Validering af fænotypisk stilk-lignende celle induktion

Regulering af stamceller associerede gener af HGF /c-MET pathway blev valideret i tre uafhængige DU145 forsøg med kvantitativ PCR. En regulerende effekt af HGF blev demonstreret for alle udvalgte gener (figur 3). Efter 24 timers stimulering CD24 (0,4 gange) blev nedreguleret, mens CD49b (2,6 gange), CD49f (2,0 gange), CD44 (1,8 gange) og Sox9 (2,9 gange) blev alle forbedret. Efterfølgende FACS analyse bekræftede opregulering af hindeagtige proteiner CD49b, CD49f, CD44, og undertrykkelse af CD24 (figur 4A). Virkningerne på proteinekspression var mest fremtrædende for CD49b med en generel stigning på 240%. Membranøs ekspression af CD49f og CD44 blev kun let forbedret efter HGF-stimulering (22% og 26%, hhv.). Da Sox9 er lokaliseret i kernen, vi udførte Western blot analyse for at bekræfte sin regulering af HGF. Som forventet blev ekspression af Sox9 protein kraftigt induceret i stimulerede DU145 celler op til 521% efter 24 timer (figur 4B).

Kvantitativ realtids-PCR bekræftede induktion af CD49b, CD49f, CD44 og Sox9 mRNA, sammen med nedregulering af CD24.

En

, FACS demonstrerede opregulering af CD49b (240%), CD49f (22%), CD44 (26%), sammen med nedregulering af CD24 (-69%) efter HGF-stimulering. Tynd grå linje repræsenterer mærkning med sekundært antistof kun (negativ kontrol), tynd sort linje DU145 uden HGF, og tyk sort streg DU145 med HGF.

B

viste Western blot forøgelse af Sox9 udtryk på HGF stimulering fra 2 til 24 timer.

C

, FACS demonstrerede induktion af dobbelt-mærket CD44

+ /CD24

– DU145 celler (kontrol 8%

versus

HGF 26%)

.

Både CD44

+ /CD24

– og α

2β

1-integrin

+ /CD133

+ profiler vælger for stamceller-lignende celler i prostata cancer [4] , [14]. Ved HGF stimulation, CD44

+ /CD24

– befolkningen blev beriget 3,25 gange (fra 8% til 26%) kombineret med en 0,8 gange fald (fra 91% til 73%) af mere modne CD44

+ /CD24

+ -celler (figur 4C). Valg til α

2β

1-integrin

+ /CD133

+ celler er ofte forfølges først ved kortvarig adhæsion til kollagen I matrix, som vælger for højt integrin udtrykkende celler [3] . For at kontrollere, om c-MET-aktivering øger den del af hurtigt fastgørelse umodne celler, vi kvantificeret adhæsion til kollagen I efter 15 min. Inden for denne periode, 0,037% (middelværdi, SD 0,006%) af kontrolceller bundet til kollagen I. HGF aktivering af DU145 celler signifikant (p 0,01) beriget for hurtigt at klæbe celler (gennemsnit 0,055%; SD 0,011%). Med FACS-analyse, CD133 ekspressionen i DU145 var under detektionsgrænsen og ikke påvirket af HGF stimulering (data ikke vist).

HGF aktiverer Notch vej

Notch signalering spiller en vigtig rolle i prostata udvikling og er blevet impliceret i CSC funktion [29] – [31]. Analyse af genekspression profil demonstrerede overekspression (3,0 ×) i down-stream Notch target HES-1 på HGF stimulering. Derfor undersøgte vi virkningerne af HGF på Notch receptorer og deres ligander. Vi fandt, at c-met-aktivering førte til opregulering af Notch-ligander Jagged-1 og Delta-lignende (Dll) 4 (figur 5). Liganden Jagged-2, receptorer Notch-2 og Notch-3 var upåvirkede, mens Notch-1-receptor blev nedreguleret ved HGF-stimulering (data ikke vist), implicerer, at Notch-aktivering resulterede fra overekspression af ligander Jagged-1 og Dll-4.

HGF stimulering førte til overekspression af Notch ligander Jagged-1 og Dll-4-RNA, og downstream-Notch target HES-1.

Inhibitors af c-MET blok udvikling af stilk-lignende fænotype.

Anerkendelse af umodne celler i humane maligniteter indledt udviklingen af ​​specifikke farmaceutiske midler rettet mod dette biologisk vigtige befolkning. De små molekyler SU11274 og PHA665752, der hæmmer c-MET enzymatisk aktivitet helt blokeret celle spredning i kultur og dannelse af stjerneformige spirer i Matrigel (data ikke vist) [32], [33]. HGF-medierede reduktion vækst var signifikant tilbage til baseline niveau (p 0,001) ved PHA665752, men ikke af SU11274 (p = 0,186) (figur 6A). SU11274 (p 0,001) og PHA665752 (p = 0,016) vendte markant både induktionen af ​​CD49b (figur 6B) samt inhiberingen af ​​CD24 (både p 0,001) inden for 24 timer (figur 6C). Fordi HGF kun moderat påvirket CD49f og CD44-niveauer, vi ikke vurdere farmakologiske virkninger på disse markører.

En

, Cell spredning hæmmes af SU11274 i både kontrol (

sorte bjælker

-) og HGF stimulerede celler (

grå søjler

+), således at den ikke vende HGF-medieret vækst reduktion (p = 0,186). PHA665752 påvirkede ikke celleproliferation i kontrolceller, og blokeret HGF inducerede vækstinhibering (p 0,001).

B

,

C

, Både SU11274 og PHA665752 blokeret HGF medieret induktion af CD49b (

B

) og hæmning af CD24 (

C

). Standardafvigelser repræsenterer tre uafhængige forsøg.

Angivelse af c-MET modulerer effektiv tumor-dannelse

in vivo

For at analysere den rolle, c-MET i tumor -formation

in vivo

, vi inficerede DU145 celler med lentivirus udtrykker shRNA målrettet c-MET-receptoren og udvalgt tre c-met negative kloner (figur 7A). C-met negative DU145 kloner havde samme morfologi som forældrenes linje, når der dyrkes i 2D eller 3D-kultur, men reagerede ikke på HGF ved at sprede eller dannelse af stjerneformige spirer (data ikke vist). Ortotopisk injektion af forældrenes DU145 resulterede i 90% (9/10) tumordannelse; disse mus blev aflivet med et tv på 1357 mm

3 (middel; interval 1016-1860 mm

3) efter 42,6 dage (betyde; range 38-52 dage). Kontrol DU145 celler inficeret med røræg shRNA førte til tumordannelse i 100% (5/5). Disse mus blev alle ofret på grund af store tv efter 59 dage (betyde; range 52-66 dage) (Figur 7B). Væsentlig reduktion af tumor dannelse opstod i DU145 kloner med tavshed c-MET. I alt 55% (11/20) af de kloner (6/10 Sh167 # 14, 3/5 Sh167 # 5 og 2/5 Sh167 # 6) gav anledning til tumorer, hvoraf kun én var ofret på grund af store TV ( 1013 mm

3; 81 dage). Femten mus blev aflivet efter 119 dage (betyder; range 109-124 dage), heraf 6 havde små tumorer (middel TV 477 mm

3; interval 137-788 mm

3). Fire mus døde utidig mellem 52 til 102 dage, der alle viser små tumorer (TV betyde 225 mm

3; interval 137-304 mm

3) (Figur 7C). I ingen af ​​de mus metastaser blev observeret. Tilsammen funktionel c-MET medieret effektiv tumor dannelse i forældrenes DU145 (p 0,02) og resulterede i signifikant større tumorer i kontrol DU145 celler (p 0,001).

En

, tre DU145-kloner (5, 6, 14) med lav til negativ c-MET-proteinekspression (Western blot) blev dannet ved stabilt shRNA infektion.

B

, ortotopisk injektion af 1,0 x 10

5 DU145 med funktionel c-MET førte til en effektiv tumor-dannelse i 9/10 forældre (

sort

) og 5/5 kontrol DU145 celler (

grøn

) inficeret med røræg RNA.

C

blev ortotopisk tumor-dannelse betydeligt reduceret i DU145 med lav c-MET udtryk. I alt 6/10 DU145Sh167 # 14 (

sort og), 3/5 DU145Sh167 # 5 (

grøn

) og 2/5 DU145Sh167 # 6 (

rød

) injektioner resulterede i tumor-dannelse. Kun én tumor nåede et tv på 1000 mm

3 i løbet af undersøgelsen periode på 52-124 dage.

Celler, der udtrykker c-MET er placeret på invasiv foran prostatakræft.

Tumorceller med høje c-MET-ekspression er specifikt beriget på den invasive foran colorektale carcinomer, hvor de medierer EMT, migration og matrix invasion [34], [35]. Til bestemmelse c-MET-ekspression ved den invasive front i prostatacancer, sammenlignede vi tilstedeværelsen af ​​høje c-met udtrykkende celler ved omkredsen og centrum af godt faste RP prøver (N = 94). Generelt høje c-MET udtrykkende celler (figur 8A) blev fundet i 37 tilfælde (39,4%). Omkredsen indeholdt mere høj c-MET udtrykker celler end tumoren center i 27 tilfælde (73,0%). I 6 tilfælde (16,2%) disse celler var mere rigelige i centrum, mens der i 4 RP s (10,8%) var der ingen forskel i udtryk (Pearson χ

2; p 0,001). Ekspression af c-MET i præ-eksisterende godartede basale celler i hele objektglasset tjente som en intern kontrol for at udelukke fiksering-induceret farvende artefakter. I alt 25 tilfælde afslørede tumor ekspansion i ekstra-prostata fedtvæv; i 10 ekstra prostata tumor områder (40,0%) høje c-MET udtrykkende celler opstod (Figur 8B).

c-MET er stærkt udtrykt i spredte prostatacancerceller (

A

) , og især på invasive fronter inden peri-prostata fedtvæv (

B

); pilespidser angiver positive celler. Original forstørrelse 100 ×.

Endelig blev co-ekspression undersøgelser udført i RP prøver at validere c-MET co-ekspression med stamceller-lignende celle markører i patienter. Immunfluorescerende farvninger til c-MET, CD49b og CD49f demonstrerede diffus udtryk for alle markører i basale celler af præ-eksisterende kirtler. Ekspression var lav til fraværende i størstedelen af ​​normale og maligne luminale celler. Receptor c-MET blev udtrykt sporadisk i høje niveauer i enkelte maligne celler. Disse celler co-udtrykkes CD49b og CD49f, hvilket indikerer, at c-met-positive celler faktisk co-udtrykke en stilk-lignende cellefænotype i human prostatacancer (figur 9).

Immunfluorescerende dobbelt-mærkning af c-MET ( Cy3, rød) med CD49b eller CD49f (Alexa 488, grøn). Co-ekspression af c-MET med både CD49b og CD49f var til stede i spredte prostatacancerceller (

pile

). Original forstørrelse 100 ×.

Diskussion

Mindst tre forskellige cellepopulationer kan blive diskrimineret i human prostatacancer. Mens differentierede exokrine og neuro-endokrine celler repræsenterer de fremherskende celletyper, er bevis stigende, at en mindre population af umodne celler er bestemmende for den biologiske opførsel af prostatacancer. Analog til normal glandular prostata epitel, Collins et al. skelnes umodne stamceller (α

2β

1-integrin

+ /CD133

+) og transit-forstærke celler (α

2β

1-integrin

+ /CD133

-) i humane prostatakræft prøver ved klonogene, proliferative og differentiere kapacitet

in vitro

[14]. Selvom CD133 foreslås som en generel markør for tumor stamceller, dens specificitet for faktiske tumor stamceller er stadig under debat [10] – [12], [14], [36], [37]. I coloncancer, for eksempel er det blevet foreslået, at CD44

+ /CD24

– /CD133

– profil repræsenterer tumor stamcellepopulation mens CD133

+ snarere mærker mere differentierede celler [38 ].