PLoS ONE: et atlas over ændret ekspression af afubiquitinerende Enzymer i Human Cancer

Abstrakt

Baggrund

afubiquitinerende enzymer (DUBs) er proteaser, der behandler ubiquitin (Ub) eller ubiquitin-lignende genprodukter , remodel polyubiquitin (-lignende) kæder på målproteiner, og modvirke protein ubiquitinering udøves af E3 ubiquitin-ligaser. Et væld af undersøgelser har etableret relevansen af ​​DUBs til styring af fysiologiske processer, hvis undergravende virksomhed er kendt for at forårsage cellulær transformation, herunder cellecyklusprogression, DNA-reparation, endocytose og signaltransduktion. Ændret udtryk for DUBs kunne derfor undergrave både proteolytiske og signalanlæg funktioner i Ub-systemet.

Metode /vigtigste resultater

I denne undersøgelse rapporterer vi den første omfattende screening af DUB dysregulering i humane cancere ved in situ hybridisering på væv microarrays (ISH-TMA). ISH-TMA har vist sig at være en pålidelig metode til at foretage denne form for undersøgelse, især fordi det giver mulighed for præcis identifikation af den cellulære oprindelse signaler. Således kan signaler associeret med tumoren komponent skelnes fra dem, der er forbundet med tumormikromiljøet. Prøvemateriale fra forskellige normale og maligne tumorvæv blev analyseret, og de “normale” prøver blev afledt, når det er muligt, fra de samme patienter, fra hvem tumorer blev opnået. Af de -90 DUBs kodes af det humane genom, blev 33 fundet at blive udtrykt i mindst en af ​​de analyserede væv, hvoraf 22 er blevet omformet i cancere. Udvalgte DUBs blev udsat for yderligere validering, ved at analysere deres udtryk i store kohorter af tumor prøver. Denne analyse afslørede signifikante korrelationer mellem DUB udtryk og relevante kliniske og patologiske parametre, som var i nogle tilfælde tegn på aggressiv sygdom.

Konklusioner /Betydning

Resultaterne præsenteret her viser, at DUB dysregulering er en hyppig begivenhed i kræft, og har betydning for terapeutiske metoder baseret på DUB hæmning

Henvisning:. Luise C, Capra M, Donzelli M, Mazzarol G, Jodice MG, Nuciforo P, et al. (2011) Et atlas over ændret ekspression af afubiquitinerende Enzymer i Human Cancer. PLoS ONE 6 (1): e15891. doi: 10,1371 /journal.pone.0015891

Redaktør: Maria Masucci, Karolinska Institutet, Sverige

Modtaget 2 oktober, 2010; Accepteret: November 29, 2010; Udgivet: 25 Jan 2011

Copyright: © 2011 Luise et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af tilskud fra Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro, det Europæiske Fællesskab (FP6 og FP7), det Europæiske Forskningsråd, de italienske undervisningsministerier-University-Forskning (MIUR) og Sundhedsstyrelsen, Ferrari Foundation, Monzino Fonden samt CARIPLO Foundation til PPDF. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

posttranslationel modifikation af proteiner med mono- eller poly-ubiquitinering er kritisk for regulering af proteinstabilitet, aktivitet og interaktioner. Gennem modulering af disse mål proteinegenskaber, ubiquitinering kontrollerer flere cellulære programmer, herunder signaltransduktion, vesikulær transport, transkription, apoptose, chromatin remodeling, og DNA-reparation [1] – [7]. Ligner andre kovalente modifikationer, såsom phosphorylering eller methylering, ubiquitinering er reversibel. Ca. 100 afubiquitinerende enzymer (DUBs) kodes af det humane genom, hvoraf 90 synes at blive udtrykt [8]. Disse enzymer spalter isopeptide binding mellem proteinet substratet og ubiquitin (Ub) rest, hvorved afslutning Ub-afhængig signalering. DUBs tilhører superfamilien af ​​peptidaser, specifikt til cystein- og metallo-peptidase familier. På grundlag af deres Ub-protease-domænet, kan cystein-peptidase DUBs yderligere organiseret i fire underklasser: Ub carboxylterminale hydrolaser, familier 1 (UCH) og 2 (USP) [9], ovarietumor-lignende (OTU eller OTUBIAN) proteaser [10], [11], og Machado-Joseph sygdom (MJD eller MACHADO) proteaser [12]. Desuden er en klasse af DUB metallo-enzymer blevet beskrevet:. Den JAB1 /MPN /Mov34 (Jamm) familie [13]

DUBs deltager i reguleringen af ​​flere biologiske funktioner. Nogle DUBs er blevet fundet i kompleks med proteasomet, hvor deres funktion er nødvendig for nedbrydning protein og Ub genanvendelse [14], [15]. I andre tilfælde er DUBs involveret i remodeling Ub indholdet af målproteiner, en mekanisme kaldet Ub-redigering. Denne proces kan være involveret i redning af fejlagtigt ubiquitinerede proteiner fra proteasomalaktivitet nedbrydning, eller i fine modulation af mængden og typen af ​​Ub kæder knyttet til særlige substrater [16]. Endelig og ikke overraskende i betragtning af den store inddragelse af Ub-systemet i intracellulær signalering, er næsten alle aspekter af celle regulering gennemskæres af DUBs, herunder regulering af transskription, kromatin remodeling, intracellulær vesikulær menneskehandel, DNA-reparation, cellecyklusprogression, apoptose, og signaltransduktion kinase kaskader (for seneste anmeldelser se [17], [18]).

Subversion af DUBs kunne derfor ændre både proteolytiske og signalanlæg funktioner i Ub-systemet. Dette forventes at påvirke cellulær homeostase og under visse omstændigheder, for at fremme cellulær transformation. Faktisk er der blevet foreslået både onkogene og tumor suppressor roller for en række DUBs [18], [19], hvilket fører til det koncept, at de kan udgøre attraktive mål for nye kræftbehandlinger ([20], [21] og referencer deri) . Således kan en bedre forståelse af de funktionelle roller DUBs i kræft har vigtige konsekvenser for kræftbehandling, især i lyset af de seneste fremskridt i udviklingen af ​​DUB-specifikke småmolekyleinhibitorer [22]. Men forstå den nøjagtige rolle af DUBs i “rigtige” kræft kompliceres af, at DUBs har flere substrater. Således kan et atlas over DUB ændringer i human cancer give et vigtigt redskab til at dirigere den fremtidige farmakologiske udvikling. På det genetiske niveau, mutationer eller omlejringer /translokationer af DUBs synes sjældne (med det vigtige forbehold, at problemet ikke er blevet grundigt undersøgt). Omvendt, ændringer i niveauerne af udtryk synes at være hyppigere (for seneste anmeldelser af kræftrelaterede DUBs, se [18], [19]). Her rapporterer vi den første omfattende screening af ændringer i DUB udtryk i ni menneskelige kræftformer. Denne undersøgelse er det første skridt hen imod udarbejdelsen af ​​en systematisk katalog over DUB dysregulering i kræft.

Resultater

Studie design

En skematisk af undersøgelsen design er afbildet i figur 1A. I alt 89 DUB gener blev analyseret af

in situ

hybridisering (ISH) på multi-tumor væv microarrays (TMA’er). Vi ansat ISH /TMA som screeningen platform, fordi blandt RNA baserede teknologier, ISH /TMA par Fordelene ved en medium /high-throughput metode (hundredvis af gener kan screenes på hundredvis af tumorer) med dem af en høj opløsning teknologi (hver kerne kan analyseres ved visuel inspektion, hvilket tillader identifikation af den cellulære oprindelse af signalet i en heterogen væv). Vi har tidligere udførligt valideret specificiteten og det dynamiske område for påvisning af denne metode (for eksempel som sammenlignet med dem, der kan opnås med yderst kvantitative metoder, såsom Q-PCR) på en række store screening projekter [23] – [26 ]. ISH /TMA screening førte til identifikation af 22 DUBs der blev dysreguleret i humane cancere, for i alt 34 forekomster af dysregulering (figur 1A). Udvalgte DUBs blev udsat for yderligere validering ved at analysere deres udtryk i store kohorter af tumor prøver (figur 1A).

A. En ordning af undersøgelsen design er vist. Venstre (indrammet i sort), strategi og resultater ISH /TMA screening højre (indrammet i rødt), strategi de udvidede analyser (detaljer er i hovedteksten). Alle DUBs udtrykt i humane væv (90, ifølge [8]) blev analyseret; Men rækkefølgen af ​​Jamm familiemedlem ENSG00000198817 blev pensioneret fra Ensembl databasen; desuden den genomiske kontekst, som denne formodede transkript blev tildelt (CHR2: 58,390,463-58,391,299) (se tabel S1 i [8]) nu svarer til FANCL gen, som er en E3-ligase. B. dysregulering af DUBs i humane kræftformer. De gennemsnitlige niveauer af ekspression i forskellige humane tumorer (T) og matchede normale væv (N) er angivet ved en semikvantitativ farvekode, som afspejler den gennemsnitlige ISH scores. Faktiske scores (og

P

værdier) er anført i tabel S3. Stjernerne mark statistisk signifikant (

P

≤.05) forskelle (sorte stjerner, opregulering, røde stjerner, nedregulering). ** Godartede nævi blev brugt som normale væv modparter for melanomer. *** For ikke-Hodgkins lymfomer (NHL’er), vi brugte reaktive lymfeknude væv som den normale modstykke.

Analyse af ændringer i DUB udtryk i humane kræftformer ved ISH /TMA

Vi screenet af ISH /TMA ~300 tumorer, herunder bryst-, colon-rectum, strubehovedet, lunge (ikke-småcellet karcinom, NSCLCs), mave, nyrer og prostata, ikke-Hodgkins lymfomer (NHL’er) og melanomer (sammensætning TMA’erne er beskrevet i tabel S1). Desuden har vi screenet ~260 normale prøver fra de samme væv (ofte, og når det er muligt, fra den samme patient, se tabel S1, for NHL, vi brugte reaktiv lymfeknude væv som den normale modpart, mens det for melanom vi brugte godartet nevi ). De 89 screenet DUBs omfattede 55 befordringspligtige virksomheder, 4 UCHs, 5 MJDs, 13 Otus og 12 JAMMs (opregnet og beskrevet i tabel S2).

Af de 89 analyserede udskrifter, 33 (37%) kunne detekteres ( ISH score 1) i mindst en af ​​de analyserede væv (tabel S3). De resterende gener var enten ikke påviselig (40 gener) eller knap (16 gener) påvises i de analyserede væv, sandsynligvis på grund af lav mRNA overflod. Af note, i alle tilfælde, hvor antisense-prober givet positive signaler, det tilsvarende sense-proben, anvendt som en negativ kontrol, gav ikke nogen mærkbar signal (data ikke vist). Det komplette sæt af resultater er vist i tabel S2 og tabel S3.

Toogtyve DUBs blev dysreguleret (67% af alle påviselige gener og -25% af alle screenede gener) i en statistisk signifikant måde (figur 1B og tabeller S2 og S3) i mindst en tumortype (se figur 2 for repræsentative eksempler). Elleve andre DUB mRNA (CYLD, USP2, USP4, USP7, USP15, USP18, USP21, USP25, USP49, PRPF8, OTUB1) blev udtrykt i forskellige væv eller tumorer, men var ikke signifikant dysreguleret (se tabel S3). Samlet set var der 34 tilfælde, hvor en specifik DUB var signifikant dysreguleret i en given tumortype, i forhold til den normale modpart; af disse var 22 (65%) var upregulations, mens 12 (35%) var downregulations (figur 1b). Påfaldende, forekom 9 upregulations i larynx carcinomer, mens 6 downregulations forekom i NHL’er. Brystcarcinom var den eneste tumortype, hvor vi observeret både op- og ned-regulativer. Ingen DUBs var signifikant dysreguleret i prostatacarcinomer, og kun en blev fundet i nyre (UCHL1, nedreguleret), hvilket antyder, at forskellige tumortyper vise forskellige niveauer af ændring af deubiquitination maskiner. Endelig mens 15 DUBs viste sig at blive væsentligt dysreguleret i kun én form for kræft, 7 (UCHL1, USP9X, USP11, USP10, USP22, COPS5 og COPS6), der vises flere ændringer i to eller flere tumortyper (Figur 1B).

Eksempler på de data, der er opsummeret i figur 1B er vist for normale og tumorvæv. I hvert par, det øverste panel er et lyst felt (for morfologisk evaluering) og det nederste panel er en mørk felt (transkripter vises som lyse punkter). Forstørrelser af udvalgte områder er også vist nedenfor hver enkelt kerne.

Med terapeutiske implikationer i tankerne, de mest interessante DUBs blev dem, der udtrykkes ved lave eller ikke-detekterbare niveauer i de fleste normale væv, og samtidig være opreguleret i det mindste én tumortype. I disse tilfælde, de dysregulerede DUBs ofte vises overekspression kun en brøkdel af tumor prøver, hvilket tyder på, at deres mængde også kan være nyttige for patienten lagdeling for berettigelse til anti-DUB terapi. For eksempel blev UCHL1 i lungecarcinomer (ligeledes i larynx carcinomer) udtrykkes kraftigt i 7 ud af 25 tumorprøver (28%), mens det var helt målbart i den normale modstykke. Desuden USP31 blev stærkt udtrykt i 8 ud af 27 larynx carcinomer (30%), og kun i to ud af 31 normale væv, hvor dens udtryk blev begrænset til den proliferative basale lag (data ikke vist).

Udvidet analyse af udvalgte DUBs i store grupper af tumor patienter

for yderligere at undersøge ændringer af DUBs i humane kræftformer, vi analyserede udtryk for udvalgte DUBs i store kohorter af humane tumorer. Vi koncentrerede sig om NSCLCs og melanomer som eksempler på tumorer huser hyppig opregulering af DUBs, og gastriske carcinomer som eksempler på tumorer, der udviser nedregulering af DUBs

I NSCLCs, fire DUBs signifikant overudtrykt:. JOSD1, COPS5 UCHL1 og USP9X ( Figur 1B). JOSD1 er stadig helt karakteriseret på det funktionelle plan, og blev derfor ikke undersøgt yderligere. COPS5, på den anden side, er blevet grundigt kendetegnet ved tumorer, herunder NSCLCs (se Diskussion), hvilket gør det ekstra karakterisering mindre nødvendig. Vi koncentrerede derfor analysen af ​​UCHL1 og USP9X ved ISH /TMA fra sag samling af 420 på hinanden følgende NSCLC prøver (beskrevet i tabel S4). Vi observerede, UCHL1 ekspression direkte korreleret (P 0,001) med tumorklassificering, køn og Ki67-ekspression, mens USP9X ekspression direkte korreleret med Ki67-ekspression (P 0,001; tabel 1). Desuden blev begge DUBs oftere udtrykt i lunge pladecellecarcinomer (SSC), sammenlignet med adenokarcinomer (AC).

I den indledende screening af melanom prøver, fem gener (USP10, USP11, USP22, USP48 og COPS5) var signifikant overudtrykt sammenlignet med godartet nevi. Vi udførte en grundig analyse på fire af dem (COPS5 blev ikke analyseret for de i foregående afsnit årsager) på en stor melanom tilfælde samling (beskrevet i tabel S5). Ekspressionen af ​​tre ud af fire analyserede gener (USP10, USP11, USP22) var signifikant højere i metastatisk melanom sammenlignet med benigne nævi og primitive tumorer (tabel 2), hvilket antyder, at deres ekspression er forbundet med en mere aggressiv og invasiv fænotype. Denne konklusion understøttes af den signifikant korrelation observeret mellem DUB udtryk og klinisk-patologiske indikatorer for fremskreden sygdom (tabel 2), herunder Breslow indeks (for USP10 og USP22), Clark indeks (for USP22, USP11 vises et grænsetilfælde korrelation) , tilstedeværelsen af ​​sårdannelse (for USP10 og USP22), og antallet af mitotiske celler (for USP10 og USP22, USP11 vises et grænsetilfælde korrelation). USP48 ekspression korrelerede ikke med nogen klinisk-patologiske parametre, da lave niveauer af transkript blev påvist i næsten alle tumorprøver ( 95%, data ikke vist). Således i et betydeligt antal melanomtilfælde, DUB udtryk korreleret med nogle af de stærkeste kendte prognostiske faktorer, projektering deres anvendelighed i prognostiske modeller.

Endelig har vi målt udtryk for USP1 på en mavekræft “progression” TMA indeholdende normal gastrisk epitel, intestinal metaplasi, dysplasi, primære carcinomer og metastaser (tabel S6). Vi observerede, at ekspressionen af ​​USP1 blev tabt i overgangen fra normalen til metaplastisk tilstand (tabel 3, se også figur 1 B og fig S1). Alle unormale og neoplastiske gastriske væv var negative for USP1 udtryk, hvilket muligvis indikerer, at denne begivenhed korrelerer med de indledende trin i omdannelsen af ​​maveslimhinden.

Diskussion

Heri vi giver første atlas på ændringer af DUB udtryk i menneskelige kræftformer. Den komplette repertoire af DUBs kodes af det humane genom blev analyseret i ni kræftformer, som omfattede de fire hyppigste kræftformer (lunge, prostata, bryst, colon-rectum), og som tegner sig for ~two tredjedele af alle kræfttilfælde og cancer dødsfald i den vestlige verden.

Twenty-to blev fundet DUBs at være væsentligt dysreguleret i mindst én type kræft. I syv tilfælde (UCHL1, USP9X, USP11, USP10, USP22, COPS5 og COPS6) blev dysregulation observeret i mere end én tumortype. I betragtning af at kun 33 af de 89 screenede DUBs viste kvantificerbare ISH signaler, fremgår det, at disse enzymer ofte ændres i humane cancere. Naturligvis betyder dysregulation i tumorer ikke udgøre

per se

evidens for en kausal involvering i kræft. I vores udvidede analyser, men observerede vi en sammenhæng mellem ekspression af udvalgte DUBs og relevante klinisk-pathalogical parametre, i nogle tilfælde indikerer aggressiv sygdom. Disse data understøtter den opfattelse, at i det mindste nogle af de detekterede dysregulations kan have en rolle i tumorigenese. Desuden kan nogle af de karakteriserede DUBs tilvejebringe nyttige markører for diagnostisk /prognostisk evaluering (f.eks USP10, USP11 og USP22 ved melanom), eller kan repræsentere terapeutiske mål (f.eks DUBs som er højt udtrykt i tumorer, men fraværende i normalt væv ), uanset deres nøjagtige rolle i tumorigenese.

Flere af de dysregulerede DUBs identificeret her, har allerede vist sig at være involveret i kræft (for seneste anmeldelser se [18], [19]). For eksempel er COPS5 overudtrykt i flere tumortyper [27], [28], og dets overekspression er associeret med korte sygdomsfri og samlet overlevelse i lungekræft [29], [30]. Faktisk har COPS5 blevet foreslået som et mål for anti-cancer stof udvikling [31].

USP9X udtryk har vist sig at fremme selv-fornyelse af embryonale stamcelle-afledte neurale stamceller fungerer som et neuralt stemness gen [32]; det fremmer celle overlevelse ved at stabilisere MCL1, som er afgørende for overlevelsen af ​​stamceller og stamceller fra flere slægter [33]. Vi fandt USP9X overudtrykt i lungekræft, hvilket tyder på, at denne begivenhed kan være forbundet med en udvidelse af kræft stamceller ved i denne tumor: a. Mulighed, der berettiger yderligere undersøgelse

opregulering af UCHL1 ekspression blev observeret i bronchiale biopsier af rygere sammenlignet med ikke-rygere [34], og dets ekspression er blevet forbundet med sygdommen resultat i lungekræft [35], [36]. Desuden UCHL1 udtryk i kræft-associerede fibroblaster af kolorektal cancer viste sig at være en uafhængig prognostisk faktor for den samlede og tilbagefald overlevelse [37]. Endelig dens overekspression stærkt accelereret lymphomagenesis i Eu-myc transgene mus gennem styrkelse af AKT signalering [38].

Et andet eksempel er repræsenteret ved USP22, som er en del af et lille sæt af markørgener i stand til at forudsige metastatisk potentiale og terapeutisk resultat i human cancer [39], [40]. USP22 er overudtrykt i kolorektal cancer og dens aktivering er forbundet med tumor progression og fiasko terapi [41]. USP22 kan udøve den onkogent potentiale gennem BMI-1-onkogen-drevet pathway signatur ved at aktivere c-Myc-målrettede gener, såsom cyclin D2 [41]. Navnlig behandling med USP22-specifikke siRNA og aiRNA (asymmetrisk interfererende RNA) inhiberer væksten af ​​implanterede blæretumorer in vivo [42], eventuelt gennem nedregulering af Mdm2 og cyclin E, hvilket resulterer i stabilisering af p53 og p21 og efterfølgende cellecyklusstandsning [42].

i alle disse tilfælde, vores resultater støtter den tanke, at disse DUBs spiller en vigtig rolle i human cancer, og yderligere stille spørgsmålet, som er de molekylære mekanismer, der er ansvarlige for deres dysregulering. Desuden vil det være interessant at teste, om genetiske ændringer, der direkte berører generne for disputatser enzymer kan dokumenteres kræft.

Omvendt for mange andre DUBs (USP31, USP39, USP48, PSMD14, USP1, PSMD7 , STAMBP, USP16, USP24, COPS6, EIF3S5 og JOSD1) vores resultater repræsenterer, til vores bedste viden, den første rapport af ændringer i kræft. To af disse DUBs, PSMD7 og pSDM14, er del af proteasomet, og kan derfor være af direkte relevans for behandling, herunder patient lagdeling, i lyset af det faktum, at proteasominhibitoren bortezomib allerede er godkendt til behandling af myelomatose og kappecellelymfom [43], og at yderligere kliniske forsøg til behandling af faste tumorer og andre hæmatologiske maligniteter er i gang [44]. Især blev PSMD14 identificeret som et vigtigt DUB af 19S låg kompleks af proteasomet [45]. Dens aktivitet er afgørende for substrat deubiquitination under proteasomalaktivitet nedbrydning [46], og kan også spille en rolle i redigeringen af ​​polyubiquitinated substrater som et middel til at kontrollere nedbrydning, eventuelt i en proteasomalaktivitet-uafhængig måde [47], [48]. Desuden PSMD14 har vist sig at afubiquitinere transkriptionsfaktoren juni; dets overekspression bidrager i Jun stabilisering og aktivering af dens downstream målgener [49], og dermed gav moderat resistens over for kemoterapeutiske lægemidler [50]. Det vil derfor være af interesse at vurdere, om den mulige bidrag PSMD14 til human cancer sker gennem proteosomal-afhængige eller -uafhængige funktioner.

Den mulige relevans af DUB dysregulering menneskelige kræftformer er bedst værdsat inden for rammerne af tilgængelige viden om deres rolle i biokemiske kredsløbssystemer involveret i cellulær regulering. Mens vil være umuligt her en omfattende diskussion af de kendte funktioner af alle de dysregulerede DUBs identificeret i denne undersøgelse (se dog tabel S2 og [8], [18], [19] for seneste anmeldelser af de biokemiske funktioner DUBs impliceret i kræft ), vil vi gerne kort fremhæve nogle af de funktionelle egenskaber ved DUBs der blev udførligt valideret i nærværende undersøgelse (USP9X, UCHL1, USP1, USP10, USP11, og USP22). Disse DUBs er involveret i reguleringen af ​​cellefunktioner relevante for kræft, herunder signaltransduktionsveje, apoptose, transskription, regulering af kromatin og DNA reparation processer.

USP9X, UCHL1 og USP11 har været impliceret i reguleringen af signaltransduktionsveje. USP9X interagerer med β-catenin

in vitro

in vivo

[51], [52] og sandsynligvis medierer sin deubiquitination, og derved øge dets halveringstid [51]. UCHL1 kan være involveret i den samme vej, idet det danner endogene komplekser med β-catenin, stabiliserer det, og opregulerer β-catenin /TCF-afhængig transskription [53]. Desuden kan UCHL1 og β-catenin positivt regulere hinanden [53]. Virkningerne af USP9X, og muligvis af UCHL1, kunne derfor efterligner aktivering af Wnt signalvejen, som er kendt for at forårsage stabilisering β-catenin og translokation ind i kernen, og er blevet impliceret i en række humane cancere (for gennemgang se [ ,,,0],54] – [57]). USP9X kan også fungere som en regulator af TGF-β vej, en anden signalering kredsløb af stor relevans for kræft (revideret i [58]), som bevidnet af det faktum, at tabet af USP9X afskaffer flere TGF-β gen svar [59]. Mekanistisk, kan dette afhænger af evnen af ​​USP9X at aktivere Smad4 ved at fjerne dens monoubiquitination, hvilket igen forhindrer dannelsen af ​​effektor SMAD2 /Smad4 komplekset [59]. Endelig er USP11 involveret i reguleringen af ​​NF-KB-signalvejen [60], [61].

Der er beviser for, at USP9X og USP10 kan være involveret i celleoverlevelsesforløb. USP9X deubiquitinates og stabiliserer MCL-1, en pro-overlevelse BCL2 familiemedlem [33], hvis overekspression er forbundet med flere neoplastiske tilstande [62] – [64]. USP10, på den anden side, har vist sig at være ansvarlig for den deubiquitination af p53 i cytoplasmaet, så dens stabilisering og genindtræden ind i kernen. Faktisk nedregulering af USP10 nedsætter p53 stabilitet og øger kræft celledeling [65], således at projicere en rolle som en tumor suppressor. Men interessant nok, USP10 kan også fungere som et onkogen, ved at fremme cancer celleproliferation i celler, der huser mutant p53 [65], en begivenhed eventuelt sammen med, at nogle p53 mutanter udviser afvigende gain-of-function aktivitet, der er stabiliseret ved deubiquitination af USP10.

der er også evidens for en inddragelse af USP22 og USP1 i en række af nukleare hændelser, herunder organisering af kromatin og telomerer, og DNA-reparation, den undergravning af som kan føre til cellulær transformation. USP22 er nødvendig for passende fremadskriden gennem cellecyklussen, og det er en del af den menneskelige SAGA kompleks, en transkriptionel co-aktivator-kompleks. Inden SAGA, USP22 katalyserer deubiquitination af histoner 2A og 2B dermed modvirke heterochromatin lyddæmpning [66]. Desuden deubiquitinates TRF1, en komponent i telomer nukleoprotein kompleks, der fungerer som en inhibitor af telomerase [67] og dermed påvirke TRF1 stabilitet og telomer forlængelse [68]. Endelig USP1 deubiquitinates og inaktiverer to komponenter af DNA-reparationsmekanismer: FANCD2 (en komponent af Fanconi anæmi pathway) [4], [69] og PCNA [70]. Ubiquitinering af FANCD2 og PCNA er vigtig for deres roller i DNA-reparation [71], [72], tyder på, at undergravning af USP1 i humane kræftformer kan kollidere med transformationsbegivenheder gennem ændringer af DNA-reparation veje.

Endelig interactome af menneskelige DUBs er for nylig blevet rapporteret [73], som forbinder DUBs til diverse cellulære processer, herunder protein omsætning, transskription, RNA behandling, DNA-skader, og endoplasmatisk reticulum-associeret nedbrydning. Den DUB interactome giver grundlaget, hvorpå kan nu tilføjes yderligere lag af kompleksitet, såsom atlas af DUB ændringer i kræft rapporteret heri, til at bygge en reference kort for pleiotropisk inddragelse af DUBs i cellulær homeostase.

Materialer og metoder

Etik erklæring

skriftligt informeret samtykke til forskning brug af biologiske prøver blev opnået fra alle patienter, og forskningsprojektet blev godkendt af Institutional komitésystem. Nuværende medlemmer af IEO etiske komité: Luciano Martini (formand), direktør for Institut for Endokrinologi, Milano; Apolone Giovanni (næstformand), chef for Translationel og Outcome Research Laboratory og “Mario Negri” Institute, Milano; Bonardi Maria Santina, leder af Nursing service – Europæiske Institut for Onkologi, Milano; Cascinelli Natale, Scientific Director – National Cancer Institute, Milano; Gallus Giuseppe, direktør – Institut for Medicinsk Statistik – Milano; Gastaldi Stefano, Psykolog og psykoterapeut, Scientific direktør Attivecomeprima; Goldhirsch Aron, direktør for Institut for Medicin – Europæiske Institut for Onkologi, Milano; La Pietra Leonardo, Chief Medical Officer – Europæiske Institut for Onkologi, Milano; Loi Umberto, Export i juridiske procedurer, Monza; Martini Luciano (Presidente), direktør – Institut Endokrinologisk, Milano; Merzagora Francesca, formand for italienske Forum for Europa Donna, Milano; Omodeo Sale ‘Emanuela, direktør for Pharmaceutical service, Europæiske Institut for Onkologi, Milano; Pellegrini Maurizio, leder af den lokale Health District, Milano; Rotmensz Nicole, chef for Quality Control Unit, Europæiske Institut for Onkologi, Milano; Tomamichel Michele, direktør, Sottoceneri Sector Cantonal Sociopsychiatric Organisation, Lugano; Monsignor Vella Charles, bioethicist og teologen, S. Raffaele Hospital og Scientific Institute, Milano; Veronesi Umberto, videnskabelig direktør, Det Europæiske Institut for Onkologi, Milano

OBSERVATØRER:. Ciani Carlo, Chief Executive Officer, European Institute of Oncology, Milano; Della Porta Giuseppe, Forskning koordinator, Det Europæiske Institut for Onkologi, Milano; Michelini Stefano, administrerende direktør, Det Europæiske Institut for Onkologi, Milan

SECRETERIAT OFFICE:. Nonis Athanasius (hoved), kontrollerede kliniske studier Office, Det Europæiske Institut for Onkologi, Milano; Tamagni Daniela (Assistant), kontrollerede kliniske studier Office, Det Europæiske Institut for Onkologi, Milano.

Identifikation og udvælgelse af DUBs, cDNA templates og sonde forberedelse

Vi brugte Pfam (Pfam 22,0 juli 2007) [74], den InterPro (InterPro 16,0, august 2007, https://www.ebi.ac.uk/interpro/), og SMART databaser at hente alle proteiner indeholder et af de fem Ub-protease domæner. Efter at have fjernet overlappende sekvenser, vi identificeret 55 befordringspligtige virksomheder, 4 UCHs, 5 MJDs, 13 Otus og 12 JAMMs, som repræsenterede de 89 gener screenes på TMA’er (tabel S2).

EST kloner blev opnået fra vores in- hus Unigene klon samling eller fra billeder (https://www.imagenes.de/). Alle kloner blev sekvensen verificeret. BLAST søgninger blev udført for at identificere de mest specifikke ~300 bp regioner, som deles af det højeste antal udskrift varianter for hver enkelt gen, og riboprober blev syntetiseret som tidligere beskrevet [23].

Vævsprøver

for storstilet screening undersøgelse, formalin faste og paraffin indlejrede prøver blev leveret af Patologi departementerne Ospedale Maggiore (Novara), Presidio Ospedaliero (Vimercate), og Ospedale Sacco (Milano). Prøver blev opstillet på forskellige TMAs (tabel S1), fremstillet i det væsentlige som beskrevet tidligere [23], [25], [75]. Hver prøve var klædt i to eksemplarer (også for TMA’er udviklet til de udvidede analyser, se nedenfor). Nærmere oplysninger om TMA teknik er i tabel S1

For de udvidede analyser af repræsentative DUBs, vi brugte tre forskellige årgange:.

Lungekræft kohorte. Vi har designet lunge-specifikke TMA’er sammensat af 420 NSCLCs (244 adenocarcinomer og 176 planocellulært karcinom), der leveres af Det Europæiske Institut for Onkologi (Milano). Kliniske og patologiske egenskaber er angivet i Tabel S4.

melanom kohorte. Vi har designet en melanom-progression TMA består af 32 godartede læsioner (NEVI), 138 primære melanomer og 62 metastatiske melanomer leveret af Patologi departementerne Ospedale S. Paolo (Milano) og Det Europæiske Institut for Onkologi (Milano). Kliniske og patologiske karakteristika er i tabel S5.

mavekræft kohorte.