PLoS ONE: Fund af specifikke metastaser Relaterede N-glycan Ændringer i Epithelial kræft i æggestokkene baseret på kvantitativ Glycomics

Abstrakt

Generelt, de fleste af kræft i æggestokkene kan ikke registreres, før stor skala og fjernbetjening metastaser opstår, hvilket er den største årsag til høj dødelighed i ovariecancer. Derfor er det vigtigt at opdage metastase-relaterede biomarkører til detektering af kræft i æggestokkene i sin okkulte metastaser scenen. Ændret glycosylering er en universel træk ved malignitet og visse typer glykanstrukturer er velkendte markører til tumor progression. Således denne undersøgelse havde til formål at afsløre specifikke ændringer af

N

-glycans i secretome af metastatisk kræft i æggestokkene. Vi ansat en kvantitativ Glykobiologi tilgang baseret på metabolisk stabil isotop mærkning for at sammenligne forskellen

N

-glycosylation af secretome mellem en æggestokkræft cellelinje SKOV3 og dets høje metastatisk derivat SKOV3-ip. Interessant, blandt alt 17

N

-glycans identificeret,

N

-glycans med gennemskærende GIcNAc blev alle signifikant reduceret i SKOV3-ip i forhold til SKOV3. Denne ændring i gennemskærende GIcNAc glycoformer samt dens tilsvarende forening med kræft i æggestokkene metastatisk adfærd blev yderligere valideret på glycotransferase niveau med flere teknikker, herunder real-time PCR, western blotting, Transwell assay, lektin blotting og immunhistokemi analyse. Denne undersøgelse viste metastase-relaterede

N

-glycan ændringer i kræft i æggestokkene secretome

in vitro

for første gang, hvilket er en værdifuld kilde til biomarkør opdagelse så godt. Desuden

N

-glycans med gennemskærende GIcNAc kaste lys over påvisning af kræft i æggestokkene i begyndelsen af ​​peritoneal metastase fase, som følgelig kan forbedre prognosen for patienter med ovariecancer

Henvisning:. Zhang X, Wang Y, Qian Y, Wu X, Zhang Z, Liu X, et al. (2014) Fund af Specifik Metastase-Related

N

-Glycan Ændringer i Epithelial kræft i æggestokkene baseret på kvantitativ Glycomics. PLoS ONE 9 (2): e87978. doi: 10,1371 /journal.pone.0087978

Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA

Modtaget: September 2, 2013; Accepteret: 2 januar 2014; Publiceret: 6 feb 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Basic Research Program Kina (973 Program) (2012CB8221004, 2013CB910503), National High-tech R menneskelig MGAT5 fremad (5’GACCTGCAGTTCCTTCTTCG-3 ‘) og human MGAT5 omvendt (5’CCATGGCAGAAGTCCTGTTT-3′); human glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GADPH) fremad (5’-CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3 ‘) og human GAPDH reverse (5′-TGAGCGATGTGGCTCGGCT-3’). Menneskelig GADPH mRNA tjente som en endogen kontrol for normalisering. Real-time PCR-analyse blev udført i tre eksemplarer.

plasmider og Gene Overekspression

SKOV3-ip og SKOV3 celler blev transficeret ved hjælp af X-tremeGENE HP DNATransfection Reagent (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland ) med pcDNA3.1-MGAT3 eller pcDNA3.1-MGAT5 plasmider, henholdsvis (leveres af en forsker i vores laboratorium), i henhold til producentens anvisninger. Og pcDNA3.1-vektor blev anvendt som negativ kontrol. Ved 48 timer efter transfektion blev overekspression af MGAT3 og MGAT5 bekræftet ved Western blot-analyse.

Små interfererende RNA og Knockdown af MGAT3

SKOV3-celler blev transficeret med MGAT3 specifik siRNA Transfektion Reagent Kompleks, (Santa Cruz Biotech, Inc., sc-44.469), som blev fremstillet ifølge producentens protokol. Scrambled siRNA blev anvendt som negativ kontrol. Ved 48 timer efter transfektion blev cellelysaterne forberedes til western blot-analyse for at bestemme gen Knockdown virkningsfuldhed.

Western Blot og lectin-blot-analyse

For at opnå helcelleproteiner, cellerne blev opsamlet , vasket med phosphatpufferopløsning (PBS) og lyseres derefter i SDS-lysepuffer [50]. Totale proteinkoncentrationer blev bestemt ved BCA-assay (Pierce, Rockford, IL). Ens mængder af totale proteinlysater fra hver cellelinje blev adskilt ved 10% natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og derefter overført til PVDF-membraner (Roche Applied Science). jeg. Western blot-analyse: Efter blokering med 5% skummetmælk i Tris-bufret saltvand indeholdende 0,1% Tween 20 (TBST) i 2 timer ved stuetemperatur blev membranerne inkuberet natten over ved 4 ° C med monoklonalt muse-antistof mod MGAT3 (1/1000 fortyndet, Sigma) eller MGAT5 (1/1000 fortyndet, Sigma) og derefter et sekundært antistof ved stuetemperatur i 1 time. Efter vask blev membranerne detekteret ved forøget kemiluminescens (ECL) assay kit. ii. Lectin-blot-analyse: Efter blokering med 5% BSA i TBST blev membranerne inkuberet natten over ved 4 ° C med biotinyleret

Phaseolus vulgaris erythroagglutinin

(E-PHA) (1/5000 fortyndet, Vector Labs) eller

Phaseolus vulgaris leucoagglutinin Hotel (L-PHA) (1/5000 fortyndet, Vector Labs). Derefter blev membranerne vasket fire gange med TBST, efterfulgt af inkubering med peberrodsperoxidase streptavidin (Vector Labs) i 30 minutter ved stuetemperatur. Efterfølgende blev membranerne vasket fire gange med TBST og opdaget af ECL assay kit.

Transwell Migration Assay

For at evaluere den vandrende evne, celle migration blev udført ved hjælp af 24-brønd format transwell kamre ( 8 um pore filter, Corning, Canton, NY). Kort fortalt blev SKOV3-celler transficeret med MGAT3 specifikke siRNA eller MGAT5 plasmid, og SKOV3-ip-celler blev transficeret med MGAT3 plasmid til 36 t. Derefter blev cellerne trypsiniseret, opsamlet, talt og derefter suspenderet i serumfrit RPMI1640 medium. 2 × 10

4-celler i 100 pi serumfrit RPMI1640 medium platted til hver indsats af det øvre kammer. I mellemtiden blev 600 pi RPMI1640 medium indeholdende 10% FBS tilsat til hver nedre kammer. Efterfølgende blev cellerne inkuberet i 12 timer ved 37 ° C. Efter fjernelse af cellerne på den øvre membranoverfladen blev celler på bundoverfladen af ​​membranen fikseret og farvet med 0,1% krystalviolet i 30 minutter ved stuetemperatur. Derefter blev celler, der var passeret gennem filteret til det nedre kammer tælles mikroskopisk i 6 tilfældige områder pr filter. Antallet af celler, som gennemkøres membranen afslørede migreringsevnen af ​​de testede celler.

Immunhistokemi Analyse

I alt 24 kræft i æggestokkene væv blev fikseret i 4% formalin og indlejret i paraffin. Vævssnit blev først udsat for hematoxylin og eosin (H topdetektion metode: tærskel-25% centroid; tærskel offset: 0.500 mV.

m /z

værdier og intensiteter blev eksporteret som ASCII-filer og topintensiteter blev skaleret med den højeste top som 100%. Den relative kvantificering af fundne

N

-glycans var ifølge protokollerne tidligere rapporterede [42]. Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af GraphPad Prism (version 5). Alle forsøg blev udført mindst tre gange. Dataene blev udtrykt som middel ± standardfejl på middelværdien (SEM). Studerendes

t

-test blev anvendt til at bestemme betydningen af ​​forskelle mellem to grupper. Wilcoxon-test blev anvendt til at sammenligne immunhistokemiske data fra de to grupper. En

s

-værdi på mindre end 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant.

Resultater

Kvantitative /Sammenlignende Glycomics Analyse af Supernatant mellem SKOV3 og SKOV3-ip Cell

for at opdage metastase-relaterede

N

-glycan ændring i æggestokkene kræftcelle secretome, den samlede pulje af

N

-glycan blanding, der frigives af enzymet peptid

N

-glycosidase F fra secretome blanding af SKOV3 (amid-

15N-Gln mærket) og SKOV3-ip-celler (amid-

14N-Gln mærket), blev analyseret ved MALDI-QIT-TOF MS ( figur 2). I alt 17

N

-glycans blev identificeret, herunder høj mannose, hybrid, triantennær, tetra-antennære strukturer og gennemskærende GIcNAc glycoformer. Alle de identificerede

N

-glycans med foreslåede struktur blev vist i figur 2 og opsummeret i tabel 1.

N

-bundne glykaner fra en 01:01 blanding af SKOV3 -IP (Gin-14 mærket) og SKOV3 (Gin-15 mærket) supernatant. Strukturerne blev fortolket manuelt baseret på deres

m /z

værdier ifølge flere tidligere offentliggjorte litteratur [46], [47], GlycoWorkbench [48] samt Glycan Mass Spectral Database [49]. Gln-14 indikerer amid-

14N-Gln; Gln-15 indikerer amid-

15N-Gln. Grøn cirkel angiver mannose; gul cirkel angiver galactose; blå firkant angiver

N

-acetylglucosamine; rød trekant indikerer fucose.

Kvantitativ analyse af

N

-glycans fra secretome blanding af SKOV3 og SKOV3-ip celler var baseret på signalintensiteter. Intensitet nøgletal (SKOV3-ip /SKOV3) af 0,83 og 1,2 blev sat som tærsklen til at estimere ned- eller opregulering af

N

-glycan niveauer i SKOV3-ip celler, i sammenligning med SKOV3 celler eftersom den maksimale variationskoefficient (CV) (n = 9) var under 20% i denne undersøgelse [43]. Relativ kvantificering af alle opdaget

N

-glycans mellem SKOV3-ip og SKOV3 celler blev opsummeret i tabel 1. Resultaterne viste, at tre ud af fire højt mannoseindhold strukturer var opreguleret i SKOV3-ip celler.

N

-glycans indeholder hybrid, triantennær, og tetra-antennære strukturer med eller uden fucose var forhøjet i SKOV3-ip celler. Den tilsvarende tendens blev observeret i tre glycaner med komplekse biantennær strukturer. Blandt alle ændringen i

N

-glycans, alle

N

-glycans med gennemskærende GIcNAc viste sig at være tilsyneladende faldet i de SKOV3-ip celler, med deres SKOV3-IP /SKOV3 nøgletal der spænder fra 0,73 til 0,12, mens alle de β-1,6 GlcNAc-forgrenede

N

-glycans var forhøjet i SKOV3-ip celler. Blandt disse ændrede

N

-glycans, vi fokuseret på

N

-glycans med gennemskærende GlcNAc, dels fordi alle af dem faldt, og de var den mest indlysende ændret

N

-glycans. Desuden har en stigende mængde af beviser viste, at de gennemskærende glycaner kan påvirke tumorprogression og metastase [52] .De strukturer, der indeholder gennemskærende GIcNAc blev yderligere bekræftet ved tandem massespektrometri (MS /MS). Repræsentant tandem MS spektre af

m /z

2012,7 [M + Na]

+, og

m /z

2377,8 [M + Na]

+ blev vist i figur S1A -B.

det er bemærkelsesværdigt, sialinsyrer, typisk præsenteres som terminale monosaccharider i glycandelen af ​​mange glycoproteiner, spiller væsentlige roller i mange fysiologiske og patologiske processer. Sialylerede glykaner er labile og let at blive tabt under direkte massespektrometrisk analyse af derivatiserede

N

-glycans. Som permethylering kan stabilisere sialsyrerester ved at konvertere højpolær -OH og COO

– grupper af forskellige monosaccharider i upolær [38],

N

-glycans efter permethylering blev også analyseret. Resultaterne viste, at mere

N

-glycans med forskellig grad af sialylering blev observeret sammenligne til analyseresultaterne uden permethylering. Selvom signal af en

N

-glycan med gennemskærende GlcNAc kunne decentraliseres til flere signaler af

N

-glycans med forskellig sialyleringsgrad, udviklingen i ændring i alle de gennemskærende GlcNAc strukturer var samme uanset permethyleret eller ej (se figur S2). Signalet intensiteten af ​​den gennemskærende

N

-glycan uden permethylering (figur S2A,

m /z

2012,6 for eksempel) var højere end for permethyleret

N

-glycans på

m /z

2489,4,

m /z

2850,3 og

m /z

3211,4 indeholdende 0, 1 og 2 sialinsyrer (figur S2B). Det er muligvis fordi en del af den oprindelige gennemskærende signalintensitet (fig S2A) blev bidraget til de tilsvarende fragmenter af glycaner med samme struktur, mens indeholdende yderligere 1 og 2 sialinsyrer (Figur S2B). Endvidere glycan profiler med permethylering var mere komplekse (dvs., har flere toppe). Derved er det foreslået, at permethylering trin sandsynligvis kunne udelades i kvantitativt Glykobiologi analyse af disse neutrale

N

-glycans som er irrelative til sialinsyrer, såsom gennemskærende GIcNAc glycoform i denne undersøgelse.

Differentiel Ekspression af MGAT3 i SKOV3-ip og SKOV3 cellelinier

som gennemskærende GlcNAc rest blev syntetiseret ved specifik glycosytransferase (MGAT3), ændringen i

N

-glycans med gennemskærende GlcNAc kunne være korreleret med den tilsvarende ændring i MGAT3. Derfor blev real-time PCR-analyse udført for at sammenligne mRNA ekspressionsniveauer af MGAT3 mellem SKOV3 og SKOV3-ip cellelinjer. Resultaterne viste, at MGAT3 differentielt blev udtrykt mellem de to cellelinier. MRNA-niveauet af MGAT3 var signifikant højere i SKOV3-celler end i SKOV3-ip-celler (61-fold,

s Restaurant 0,001, figur 3A). Derefter ekspressionen af ​​MGAT3 i denne to cellelinjer blev yderligere vurderet ved proteinniveauet ved western blot-analyse. Den nedre overflod af MGAT3 blev observeret for SKOV3-ip-celler i modsætning til SKOV3-celler (figur 3B). Derfor faldt MGAT3 ekspression i både mRNA og protein niveauer i SKOV3-ip-celler var i overensstemmelse med faldet halverer GluNAc modifikation i SKOV3-ip cellesupernatant manifesteret ved kvantitativ Glykobiologi analyse. Salg

(A) mRNA ekspressionsniveauer af MGAT3 i SKOV3-ip og SKOV3 cellelinjer. MRNA-niveauer af MGAT3 blev normaliseret med GAPDH niveauer. Middel fold ændringer blev beregnet med 2

-ΔΔCt metode. (B) Protein ekspressionsniveauer af MGAT3 i SKOV3-ip og SKOV3 cellelinjer. Cellelysater blev isoleret ved 10% SDS-PAGE for western blotting under anvendelse af antistof mod MGAT3. Human beta-actin tjente som en endogen kontrol. 293T cellelinje blev anvendt som positiv kontrol. Data udtrykkes som den middel ± SEM. Hver analyse blev udført mindst tre gange. En

s

-værdi på mindre end 0,05 indikerer statistisk signifikans ved hjælp af Students

t

-test.

Effekter af MGAT3 om migration evne ovariecancerceller

over data viste, at niveauerne af MGAT3 og dens catalysate,

N

-glycans indeholder gennemskærende GlcNAc, var signifikant lavere i SKOV3-ip celler sammenlignet med i SKOV3 celler. Siden SKOV3-ip celler er de meget metastatiske derivater af SKOV3 celler, disse resultater foreslog en potentiel rolle MGAT3 og dens catalysate, halverer glycaner, på æggestokkene kræftcelle motilitet. For at teste dette, blev MGAT3 gen overudtrykt i SKOV3-ip-celler ved transfektion. Western blot analyse viste en signifikant stigning i MGAT3 ekspression efter transfektion, sammenlignet med SKOV3-ip-kontrolceller (figur 4A). Niveauet af gennemskærende glycaner blev også forhøjet i overensstemmelse hermed (figur 4B). For at bekræfte, om overekspression af MGAT3 påvirke migration evne, blev trans-brønd migration analyser udført. Som vist i figur 4C og 4D, migration evne i MGAT3 transficerede celler var signifikant nedsat til 52% af det i kontrolceller. I mellemtiden blev knockdown af MGAT3 i SKOV3-celler udført ved MGAT3 målretning siRNA transfektion. Western blot-analyse påviste effektive nedtrykning af MGAT3 ekspression i SKOV3 efter transfektion (figur 5A). Niveauet af gennemskærende glycaner blev nedreguleret i overensstemmelse hermed (figur 5B).