PLoS ONE: immunregulerende mekanismer bag Forebyggelse af Colitis-associerede Kolorektal Cancer af Probiotic Bacteria

Abstrakt

Baggrund

Inflammatorisk tarmsygdom (IBD) øger risikoen for tyktarmskræft. Probiotiske bakterier producerer immunregulatoriske metabolitter

in vitro

såsom konjugeret linolsyre (CLA), en polyumættet fedtsyre med potente anti-kræftfremkaldende. Denne undersøgelse havde til formål at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer bag effekten af ​​probiotiske bakterier i musemodeller af kræft.

Metodologi /vigtigste resultater

De immunmodulerende mekanismer VSL # 3 probiotiske bakterier og CLA blev undersøgt i musemodeller for inflammation-drevet kolorektal cancer. Colon prøver blev indsamlet til histopatologi, genekspression og flowcytometri analyser. Immuncelleundergrupper i mesenteriske lymfeknuder (MLN), milt og colon lamina propria-lymfocytter (LPL) blev fænotypisk og funktionelt karakteriseret. Mus behandlet med CLA eller VSL # 3 udvindes hurtigere fra den akutte inflammatoriske fase af sygdom og havde lavere sygdommens sværhedsgrad i den kroniske, tumorbærende fase af sygdommen. Adenom og adenocarcinom-dannelse blev også formindsket ved begge behandlinger. VSL # 3 øgede mRNA ekspression af TNF-α, angiostatin og PPAR γ henviser CLA faldt COX-2-niveauer. Desuden havde VSL # 3-behandlede mus øget IL-17-ekspression i MLN CD4 + T-celler og ophobning af treg LPL og hukommelse CD4 + T-celler.

Konklusioner /Betydning

Både CLA og VSL # 3 undertrykt colon carcinogenese, selvom VSL # 3 viste større anti-kræftfremkaldende og antiinflammatoriske aktiviteter end CLA. Mekanistisk, CLA moduleret udtryk for COX-2 niveauer i colon mucosa, mens VSL # 3 målrettet regulering slimhinde CD4 + T-celle responser

Henvisning:. Bassaganya-Riera J, Viladomiu M, Pedragosa M, De Simone C, Hontecillas R (2012) immunregulerende mekanismer Underliggende Forebyggelse af Colitis-associerede Kolorektal Cancer af probiotiske bakterier. PLoS ONE 7 (4): e34676. doi: 10,1371 /journal.pone.0034676

Redaktør: Georgina L. Hold, University of Aberdeen, England

Modtaget: Januar 20, 2012; Accepteret: 6 Marts 2012; Udgivet: 12 april, 2012 |

Copyright: © 2012 Bassaganya-Riera et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. Medforfatter Josep Bassaganya-Riera er en PLoS ONE redaktionelle bestyrelsesmedlem. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindeligt diagnosticeret kræft i USA [ ,,,0],1]. Det anslås 50.000 dødsfald tilskrives CRC rundt om i verden hvert år [2]. Sammen med de arvelige syndromer af familiær adenomatøs polypose og arvelige nonpolyposis, inflammatorisk tarmsygdom (IBD) er blandt de tre bedste betingelser højrisiko for CRC [3]. Blandt ulcerativ colitis (UC) patienter, en af ​​de to vigtigste manifestationer af IBD, den relative risiko for at udvikle CRC korrelerer med omfanget og varigheden af ​​sygdom [3], [4]. Hos patienter med IBD, denne risiko stiger med 0,5-1,0% årligt efter 8-10 år [5].

Den menneskelige tarm mikroflora, som indeholder omkring 100 trillioner mikrobielle organismer, spiller en afgørende rolle i at bevare vært sundhed , både i mavetarmkanalen og systemisk gennem absorption af metabolitter (f.eks vitaminer og kortkædede fedtsyrer) [6]. Nyere undersøgelser har vist, at specifikke bakteriestammer er impliceret i reguleringen af ​​den intestinale homeostase, leverer regulatoriske signaler til epitelet, slimhindeimmunsystemet og til den neuromuskulære aktivitet i tarmen [7], [8]. Desuden er nogle kommensale og patogene organismer af den humane enteriske microbiome er afgørende i patogenesen af ​​IBD og CRC. Derfor manipulere tarmen bakterielle sammensætning og lokalt metabolit-produktion ved hjælp af probiotiske bakterier er blevet undersøgt som en lovende vej for terapeutisk intervention mod CRC. Probiotika er levende mikrobielle fodertilskud som fordelagtigt indvirkning på værten sundhed. De er afhængige af at indføre særlige eksogene stammer i tarmen mikroflora [8], [9]. Disse stammer er ofte valgt til specifikke gavnlige aktiviteter, ligesom produktionen af ​​lipider, såsom konjugeret linolsyre (CLA) og konjugeret linolsyre isomerer (CLNA) [10], [11]. Disse lipider varierer i kemisk struktur fra korte fedtsyrer, såsom propionat, acetat og butyrat til polyumættede fedtsyrer (PUFA) og er involveret i regulering af apoptose og immunresponset [10], [12] – [14].

en screening af 36 forskellige Bifidobacterium stammer for deres evne til at producere CLA fra fri linolsyre og CLNA fra alfa-linolensyre (LNA) afslører, at fire

Bifidobacterium breve

stammer seks stammer (, en

B . bifidum

stamme og en

B. pseudolongum

stamme) er i stand til at producere forskellige CLA og CLNA isomerer

in vitro

[15]. Andre har vist, at probiotiske bakterier kan syntetisere CLA [16] – [18]. CLA-producerende bakteriestammer kan findes i en kommercielt tilgængelig probiotisk formulering kendt som VSL # 3. Dette produkt er sammensat af fire stammer af mælkesyrebakterier (

Lactobacillus casei

,

L. Plantarum

,

L. Bulgaricus

, og

L. Acidophilus

) , tre stammer af bifidobakterier (

Bifidobacterium longum

,

B. breve

,

og B. infantis

) og

Streptococcus thermophilus

. Vi har for nylig demonstreret, at VSL # 3 probiotiske bakterier producerer CLA lokalt som målretter makrofag peroxisomproliferatoraktiveret receptor (PPAR) y at undertrykke colitis [19]. Derudover kan VSL # 3 spiller en central rolle i at opretholde den intestinale mikrobielle balance ved at syntetisere antibakterielle stoffer som lantibiotika [20], og andre bakteriocin-lignende forbindelser [21]. Desuden er VSL # 3 behandling forbundet med en nedregulering af LPS-aktiverede IL-8-produktion og undertrykt sekretion af TNF-α og IFN-γ [22]. Disse immunregulatoriske handlinger er i overensstemmelse med aktivering af PPAR γ fra tarmen mikroflora efter VSL # 3 probiotiske behandling. Formålet med dette studie er at undersøge muligheden for VSL # 3 bakterier til at modulere slimhinder immunreaktioner og derved forbedre colon carcinogenese.

Materialer og metoder

Animal procedurer og eksperimentelle diæter

C57BL /6-vildtypemus (n = 60) blev anvendt til DSS-induceret CRC undersøgelse. I en opfølgende undersøgelse, vi også anvendt IL-10-deficiente (IL-10 – /-) og vildtype-mus i en 129 /SvEv baggrund (n = 60). For hvert forsøg blev mus fodret oprensede AIN-93g gnavere diæter (tabel S1) med eller uden 1% CLA i 24 dage før induktion af inflammation-relaterede kræft, hvor alle de krav, hvor opfyldt eller overskredet. CLA supplement administreret indeholdt en 50:50 blanding af

cis

-9,

trans

-11 CLA og

trans

-10,

cis

-12 isomerer (Clarinol, Loders Croklaan BV).

Etik Statement

Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af Virginia Tech Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) og opfyldt eller overskredet kravene i Public Health service /National Institutes of Health og dyreværnsloven.

oral behandling med probiotiske bakterier

for hvert forsøg, ca. halvdelen af ​​musene fik 0,5 ml af VSL # 3 probiotiske løsning dagligt ved orogastric tvangsfodring med kuglespids gavagenål. Den probiotiske opløsning blev frisk fremstillet dagligt i phosphatbufret saltvand (PBS) ved pH 7,1 i sterile betingelser til en endelig koncentration på 0,0072 g VSL # 3 /mL, hvilket svarer til 1,2 milliarder bakterier pr mus /dag, en dosis, der har vist effektivitet til at kolonisere colon og terminal ileum [23], [24]. Endvidere denne dosis er biologisk relevant, da den er baseret på et dagligt indtag på ca. 3.600 milliarder bakterier til et voksent menneske på 70 kg. VSL # 3 er en kommerciel probiotiske blanding af fire stammer af mælkesyrebakterier (

Lactobacillus casei

,

L. Plantarum

,

L. Bulgaricus

, og

L. acidophilus

), tre stammer af bifidobakterier (

Bifidobacterium longum, B. breve og B. infantis

) og

Streptococcus thermophilus

.

Tyktarmskræft induktion

En tidligere etableret protokol blev fulgt til kemisk fremkalde betændelse-drevet CRC [25], [26]. Vildtypemus blev provokeret med azoxymethan (10 mg /kg) i uge 6 af undersøgelsen, efterfulgt af en 2,0% dextran natriumsulfat (DSS) behandling i drikkevandet i 7 dage begyndende i uge 7. IL-10-deficiente 129 /SvEv mus blev udfordret med en enkelt dosis på 5 × 10

7 cfu

Helicobacter typhlonius

ved oral sonde til at accelerere kolon carcinogenese som tidligere vist [27]. Sygdomsaktivitet indekser og rektal blødning scoringer blev beregnet ved anvendelse af en modifikation af en tidligere offentliggjort sammensat score [28]. Mus blev aflivet på tidspunktet for tumordannelse, svarende til dag 68 (C57BL /6-stammen) eller dag 18 efter infektion med

H. typhlonius

(129 /SvEv stamme).

Histopatologi

colonic snit blev fikseret i 10% pufret neutral formalin, senere indlejret i paraffin, og derefter sektioneret (6 um) og farvet med H 0,05 blev anset for at være betydelig. Når modellen var betydelig, blev ANOVA efterfulgt af Fishers Beskyttet mindste signifikante forskel multipel sammenligning metode.

Resultater

VSL # 3 og CLA lindre sygdomsaktivitet i mus med CRC

i begge modeller, VSL # 3 og CLA behandlinger faldt sygdomsaktivitet scores forbundet med colitis-associerede CRC i sammenligning med den ubehandlede kontrolgruppe. I azoxymethan-induceret CRC model, mus behandlet med enten CLA eller VSL # 3 udvindes hurtigere fra den akutte inflammatoriske fase af sygdommen (dag 1-26) og havde lavere sygdommens sværhedsgrad i den kroniske, tumor-bærende fase af sygdommen (dag 63 -68). Samlet, VSL # 3 probiotiske bakterier behandling var mere effektivt end CLA i faldende inflammation og reducere sygdomsaktivitet i begge modeller (figur 1A og figur 2a). I overensstemmelse med disse kliniske resultater, VSL # 3 og CLA væsentligt lindres makroskopisk patologi i colon, milt og MLN i sammenligning med ubehandlede kontrolmus i azoxymethan inducerede CRC (Figur 1B-C). I IL10 – /- model, den probiotiske blanding VSL # 3, men ikke CLA faldt inflammationsrelaterede læsioner i MLN, colon og milt fra

H. typhlonius

inficerede mus i sammenligning med kontrolgruppen (Figur 2B-D).

C57BL /6J-mus (n = 60) blev behandlet med den VSL # 3 probiotiske (n = 20), CLA- suppleret (1 g /100 g) (n = 20) eller kontrol diæter (n = 20) i 32 dage og udfordret ip med azoxymethan (10 mg /kg) efterfulgt af 2% dextran natriumsulfat (DSS) i drikkevandet i 7 dage for at inducere colitis-associerede kolorektal cancer (CRC). Sygdommen aktivitet indeks blev en sammensat score afspejler kliniske tegn på sygdommen (dvs. perianal tilsmudsning, rektal blødning, diarré, og hårrejsning) vurderede dagligt for mus, der gennemgår DSS udfordring (A). Mus blev aflivet på dag 68. Colon og mesenteriske lymfeknuder (MLN) (B C) blev makroskopisk scoret for inflammation. Data er repræsenteret som middelværdi ± standardfejl. Points med en stjerne er signifikant forskellige sammenlignet med kontrolgruppen (

P

0,05).

Bakteriel-free 129 /SvEv og IL-10-genet mangelfuld (IL 10 – /-) 129 /SvEv mus i en 129 /SvEv baggrund (n = 60) blev behandlet med den VSL # 3 probiotiske (n = 20), CLA-suppleret (1 g /100 g) (n = 20) eller kontrol diæter (n = 20) i 32 dage, og derefter blev inficeret med

H. typhlonius

for at udvikle eksperimentel colorektal cancer associeret med colitis. Sygdommen aktivitet indeks, en sammensat score afspejler kliniske tegn på sygdommen, blev vurderet dagligt for mus, der gennemgår DSS udfordring (A). Colon, milt og mesenteriske lymfeknuder (MLN) (B-D) blev makroskopisk scoret for inflammation. Data er repræsenteret som middelværdi ± standardfejl. Points med en stjerne er signifikant forskellige sammenlignet med kontrolgruppen (

P

0,05).

VSL # 3 og CLA forhindre colon histologiske læsioner i mus med CRC

Hvad angår azoxymethan /DSS colitis-associerede CRC model, CLA behandling, men ikke VSL # 3 administration, nedsat leukocytinfiltration og colon mucosa-tykkelse (Figur 3 A B). Interessant, VSL # 3 var mere effektiv end CLA reducere leukocytinfiltration i mucosal tykkelse i IL-10 – /- mus inficeret med

H. typhlonius

(Figur 4 A B). Derudover begge VSL # 3 og CLA behandlinger formindsket adenom og adenocarcinom dannelse sammenlignet med kontrollen. Disse resultater var konsistente for begge CRC modeller (Figur 3 C 0,05).

Bakteriel-free 129 /SvEv og IL-10-genet mangelfuld (IL 10 – /-) 129 /SvEv mus i en 129 /SvEv baggrund (n = 60) blev behandlet med den VSL # 3 probiotiske (n = 20), CLA-suppleret (1 g /100 g) (n = 20) eller kontrol diæter (n = 20) i 32 dage, og derefter blev inficeret med

H. typhlonius

for at udvikle eksperimentel colorektal cancer associeret med colitis. Efter obduktion undergik alle prøver blindet histologisk undersøgelse og blev scoret 1-4 på mucosal fortykkelse (A), leukocytinfiltration (B), adenomer (C) og adenocarcinomer (D). Data er repræsenteret som middelværdi ± standardfejl. Points med en stjerne er signifikant forskellige sammenlignet med kontrolgruppen (

P

0,05).

VSL # 3 og CLA modulere udtryk for colon inflammatoriske og karcinogenicitet markører

Mus udfordret med azoxymethan og DSS blev aflivet i tumorbærende fase af sygdommen. Disse mus behandlet med enten CLA eller VSL # 3 viste en øget mRNA-ekspression af CD36 og PPAR γ. i tyktarmen (figur 5 A 0,05).

VSL # 3 og CLA graduere fænotype og cytokinproduktion af makrofager og CD4 + T celle-undergrupper i MLN og colon LP

de sunde mus, der modtog VSL # 3 havde større procentdele af IL-17-udtrykkende CD4 + -T-celler i MLN sammenlignet med den ubehandlede kontrolgruppe (figur 6A). Tilsvarende CLA behandling forøgede population af IL-17-udtrykkende CD4 + -T-celler i milten af ​​både raske og CRC-mus (figur 6B). Større procentdele af CD4

+ foxp3

+ og CD4

+ CD44

+ CD62L

+ LP T-celler, svarende til mucosale regulatoriske T-celler (Treg) og CD4

+ hukommelse T celler henholdsvis blev fundet i VSL # 3-behandlede mus (figur 6C 0,05).

Diskussion

Kronisk tarmbetændelse forekommer i IBD inducerer vedvarende skader og øget mucosal permeabilitet langs mavetarmkanalen, spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​colorectal cancer (CRC) [29]. Manipulation af tyktarmens bakterier med probiotika er blevet vist at være effektive i reguleringen af ​​tarmen homeostase dels gennem produktion af bakterielle metabolitter [30]. VSL # 3 probiotiske bakterier kan producere CLA lokalt i tarmen, en forbindelse, der ned-modulerer inflammatoriske reaktioner ved at aktivere PPAR γ [31]. Desuden CLA forhindrer eller bedrer eksperimentel IBD hos mus og svin [12], [13], [32]. Desuden har PPAR y agonister vist klinisk effekt mod human UC [33], [34]. For nylig demonstrerede vi, at den probiotiske blanding VSL # 3 undertrykker tarmbetændelse ved at producere CLA lokalt i tyktarmen og aktivere PPAR γ i makrofager [19]. Denne undersøgelse havde til formål at undersøge mekanismerne i CLA og VSL # 3 i musemodeller for colitis-associerede CRC.

Den kliniske respons i AOM /DSS modellen havde en bimodal fordeling, hvor den første top svarede til akut inflammation på grund af den DSS udfordring efterfulgt af en periode med klinisk helbredelse karakteriseret ved lavere kronisk inflammation. Den anden top af sygdom forekom på dag 48, svarende til tumordannelse. Dette mønster er konsistent med resultaterne af tidligere undersøgelser fra vores gruppe, der karakteriserede de anti-kræftfremkaldende egenskaber CLA [25]. CLA og VSL # 3 behandlede mus viste også lavere makroskopiske inflammationsrelaterede læsioner og væsentligt forbedret colon histopatologi i begge forsøgsmodeller. Alligevel mens VSL # 3 var forbindelsen, der forhindrede tumordannelse mest effektivt, det ikke forhindre leukocytinfiltration i forhold til de andre grupper i azoxymethan-induceret kolorektal cancer model, hvilket antyder en mulig rolle af infiltrerende leukocytter i de anti-kræftfremkaldende aktioner af VSL # 3. I en opfølgende undersøgelse, bruge en anden model af colitis-associerede colon carcinogenese, IL-10 – /- mus i en 129 /SvEv baggrund blev inficeret med

H. typhlonius

dermed fremskynde colon inflammation, at IL10 – /- udvikle spontant og fremme colon carcinogenese [27]. I denne model, både VSL # 3 og CLA lindres sygdommens sværhedsgrad, men kun den probiotiske blanding var effektivt til at reducere inflammationsrelaterede læsioner i MLN, milt og tyktarm. Denne sammenhæng af resultater i begge modeller viser, at effekten af ​​VSL # 3 i at genoprette slimhinde homeostase og formildende colitis-associerede CRC er ikke model-afhængig.

Vores genekspression analyser viste en opregulering af colon TNF-α i CLA og VSL # 3-behandlede mus sammenlignet med den ubehandlede kontrolgruppe, som kan være tegn på immunstimulering og øget epitel helbredende evner. Mest bemærkelsesværdigt, TNF-α udøver potente antitumorale virkninger ved at stimulere immunresponser, herunder opregulering af humane leukocyt antigen-antigener i tumor celleoverflader [35], forbedret cytotoksicitet [36] stimulering af cytotoksiske T-celler og naturlige dræberceller (NK) celler [37] – [40] samt epithelial healing [41]. Desuden viste CLA-behandlede mus en signifikant reduceret ekspression af cyclooxygenase-2 (COX-2), et enzym involveret i arachidonsyrekaskaden og prostaglandin-medieret inflammation. Tidligere undersøgelser har antydet de undertrykkende virkninger af CLA på colon carcinogenese skyldes ændringer i denne kaskade og i aktivering af PPAR γ begge mekanismer, der involverer inhibering af COX-2-ekspression og at inducere apoptose [42], [43]. Niveauerne af angiostatin, et proteolytisk fragment af plasminogen og en endogen inhibitor af angiogenese [44], var større i VSL # 3 gruppe sammenlignet med kontrolpatienter fodret mus, hvilket antyder, at anti-kræftfremkaldende virkninger af VSL # 3 kan medieres, delvis ved undertrykt angiogenese. Som vist i tidligere undersøgelser [45], [46], denne hæmmende adfærd angiostatin på angiogenese kunne indirekte forbundet med anti-kræftfremkaldende effekt. Vores resultater udvide resultaterne af en nylig rapport viser, at probiotiske VSL # 3 kan dæmpe kronisk betændelse i rotter, forsinke overgangen fra betændelse til dysplasi og kræft [47].

evne VSL # 3 og CLA til modulere immunreaktioner og forhindre CRC blev også vurderet ved at undersøge fordelingen af ​​immuncelleundergrupper på tyktarmens slimhinde og systemisk. VSL # 3 behandling øget de procentdele af IL-17-udtrykkende CD4 + -T-celler i den mucosale induktive anlæg (dvs., MLN) og Foxp3-udtrykkende CD4 + -T-celler i effektorstedet i mus med CRC, hvilket antyder en mulig rolle ved modulering af plasticitet mellem Th17 og treg i MLN og colon LP. Resultater fra en nylig undersøgelse identificeret segmenteret trådformede bakterier i tarmen kommensale mikrobiota som inducere af Th17 polarisering i tarmslimhinden [48]. Det er fristende at spekulere, at ændringer i sammensætningen af ​​tyktarmen microbiome udløst af probiotiske bakterier kan udøve lignende effekter. Afslutningsvis vores data demonstrerer evne CLA og VSL # 3 for at lindre inflammation-induceret kolorektal kræft gennem en mekanisme, der involverer modulering af slimhinde CD4 + T-celle polarisering og modulering af genekspression.

Støtte Information

Tabel S1.

Sammensætning af eksperimentelle diæter.

1 kg kost: 3 g nicotinsyre, 1,6 g calcium pantotenate, 0,7 g pyridoxin-HCI, 0,6 g thiamin HCI, 0,6 g riboflavin, 0,2 g folinsyre, 0,02 g D-biotin, 2,5 g vitamin B-12 ( 0,1% i mannitol), 15 gd, l-α tocopherylacetat (500 IE /g), 0,8 g vitamin A-palmitat (500.000 IU /g), 0,2 g cholecalciferol (500.000 IU /g), 0,075 g vitamin K (phylloquinone) og 974,705 g saccharose.

2 kg kost: 357 g calciumcarbonat, 196 g monobasisk kaliumphosphat, 70,78 g kaliumcitrat, 74 g natriumchlorid, 46,6 g kaliumsulfat, 24,3 g magnesiumoxid, 6,06 g ferricitrat, 1,65 g zinkcarbonat, 0,63 g mangan- carbonat, 0,31 g cupricarbonat, 0,01 g kalium iodat, 0,01025 g natriumselenat, 0,00795 g ammonium paramolybdate, 1,45 g natrium-meta-silicat, 0,275 g chrom kaliumsulfat, 0,0174 g lithiumchlorid, 0,0815 g borsyre, 0,0635 g natrium fluorid, 0,0318 g nikkelcarbonat, hydroxid, tetrahydrat, 0,0066 g ammonium vanadat, og 220,716 g saccharose.

3Antioxidant

doi:. 10,1371 /journal.pone.0034676.s001

(DOCX)