PLoS ONE: Nrf1 og Nrf2 transkriptionsfaktorer Regulere Androgen receptor Transaktivering i prostatakræft Cells

Abstrakt

På trods af androgen deprivation terapi (ADT), vedvarende androgen receptor (AR) signalering muliggør udvækst af kastrationsresistent prostatacancer (CRPC ). I prostatacancer (PSA) celler, kan ADT forbedre AR aktivitet gennem induktion af oxidativt stress. Heri, undersøgte vi roller Nrf1 og Nrf2, transkriptionsfaktorer, som regulerer antioxidant genekspression, om hormon-medieret AR transaktivering under anvendelse af en syngen

in vitro

model af androgenafhængige (LNCaP) og kastrationsresistent (C4-2B ) PCA celler. Dihydrotestosteron (DHT) stimulerede transaktivering af androgenet responselementet (ARE) var signifikant større i C4-2B celler end i LNCaP-celler. DHT-induceret AR transaktivering blev koblet med højere nuklear translokation af p65-Nrf1 i C4-2B celler, sammenlignet med LNCaP-celler. Omvendt DHT-stimulering undertrykt total Nrf2 niveauer i C4-2B celler, men forhøjede totale Nrf2 niveauer i LNCaP-celler. Interessant siRNA-medieret inaktivering af Nrf1 svækket AR transaktivering mens p65-Nrf1 overekspression forbedret AR transaktivering. Efterfølgende undersøgelser viste, at Nrf1 fysisk interagerer med AR og forbedrer AR DNA-bindende aktivitet, hvilket antyder, at p65-Nrf1 isoform er en potentiel AR coaktivator. I modsætning hertil Nrf2 undertrykte AR-medieret transaktivering ved at stimulere den nukleare akkumulering af p120-Nrf1 som undertrykte AR transaktivering. Kvantitativ RT-PCR undersøgelser yderligere valideret de induktive virkninger af p65-Nrf1 isoform på androgen regulerede gener, PSA og TMPRSS2. Derfor er vores fund implicerer differentierede roller Nrf1 og Nrf2 i regulering AR transaktivering i PCA celler. Vores resultater viser også, at DHT-stimuleret stigning i p65-Nrf1 og den samtidige undertrykkelse af både Nrf2 og p120-Nrf1 sidste ende letter AR transaktivering i CRPC celler

Henvisning:. Schultz MA, Hagan SS, Datta A, Zhang Y, Freeman ML, Sikka SC, et al. (2014) Nrf1 og Nrf2 Transskription faktorer regulerer Androgen receptor Transaktivering i prostatacancerceller. PLoS ONE 9 (1): e87204. doi: 10,1371 /journal.pone.0087204

Redaktør: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique fonctionnelle de Lyon, Frankrig

Modtaget: Februar 19, 2013; Accepteret: December 26, 2013; Udgivet: 22 Jan 2014

Copyright: © 2014 Schultz et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Disse undersøgelser blev støttet af midler fra det amerikanske forsvarsministerium; PC080811 (D.), PC081598 (AA), og National Institute of Health, T32-CA093240 (MF), og fra Louisiana Cancer Research Consortium (DM). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den anden. hyppigste årsag til kræft dødsfald i amerikanske mænd [1], og forhøjede androgen receptor (AR) signalering letter PCa vækst. Derfor blev androgen deprivation terapi (ADT) designet til at nedbryder systemiske androgen niveauer og dermed undertrykke AR signalering i hormon-afhængige PCA celler [2]. Men patienterne kun reagere på ADT i ca. 18 måneder på grund af udvælgelsen og udvækst af kastrationsresistent prostatacancer (CRPC) celler. Interessant, CRPC celler bevarer både AR udtryk og funktion [2], [3]. Derfor forstå mekanismerne i vedvarende AR funktion i CRPC celler trods ADT vil støtte i at udvikle terapeutiske strategier, der undertrykker PCa gentagelse.

Det er blevet foreslået, at resterende androgen produktion inden for tumor mikromiljø bidrager til vedvarende AR signalering [3 ]. Dihydrotestosteron (DHT) er et potent androgen, der stimulerer AR medieret transaktivering ved androgen responselementet (ARE), til stede på promotorer af talrige gener vigtige i PCa cellevækst [4]. Interessant er den klassiske AR transaktiveringsfunktion vej ofte forbigås i CRPC celler, hvor vedvarende AR funktion forekommer på trods lave androgen niveauer [5], [6]. Denne AR transaktivering i CRPC celler er blevet tilskrevet øget AR udtryk og fremme ekspressionen af ​​de enzymer, der omdanner androgener til DHT [3], [7]. De seneste beviser tyder også, at parallelle signalveje, der øger ekspression og aktivitet af AR coaktivatorer kan spille en væsentlig rolle i reguleringen af ​​AR aktivitet [3], [8]. Nogle af disse AR coaktivatorer kan ændre konformationen af ​​AR ligandbindende lomme, hvilket øger bindingsspecificiteten af ​​AR til steroidligander. Alternativt kan AR associere med forskellige cofaktorer og chaperoner, der letter dets nukleare lokalisering og er bindende kapacitet [9]. Derfor vil identifikationen af ​​AR cofaktorer forbedre vores forståelse af PCa progression til CRPC.

Undersøgelser har vist, at ADT kan fremkalde oxidativ stress og reaktive ilt arter (ROS) spiller en væsentlig rolle i PCa progression til kastration modstand [ ,,,0],10]. Kronisk oxidativ stress er blevet observeret i aggressive PCA-celler og rapporter har vist, at disse celler kan udnytte ROS inducerede antioxidant proteiner, der kan forbedre overlevelse og opretholde AR signalering [6], [11] – [13]. Faktisk er mange effektorer af ROS signaling der fungerer som AR coaktivatorer overudtrykt i PCa og deres ekspression kan reguleres ved hormon signalering [14] – [16]. Den antioxidant protein peroxiredoxin-1 (Prx-1) fungerer som en chaperone at øge hormon-signalering og androgen følsomhed via direkte interaktion med AR, hvilket øger dets nukleare lokalisering [14], [15]. Endvidere kan afbrydelse af androgen signalering (dvs. ADT) i prostata inducerer oxidativt stress ved at øge ekspressionen af ​​ROS producerer NADPH oxidaser (NOX) [16], [17]. Disse ændringer i ROS påvirke aktiviteten af ​​transkriptionsfaktorer, såsom Nrf1 og Nrf2 (NF-E2 relateret faktor 1 og 2), at der regulerer ekspressionen af ​​talrige antioxidant proteiner og NADPH oxidaser [18] – [20]. De resulterende ændringer i NOX og antioxidant protein ekspression kan være forbundet med øget tumor overlevelse [21] – [23]. Men selvom både Nrf1 og Nrf2 få væsentlig indvirkning på oxidativt stress signalering, deres direkte virkninger på AR-transaktivering er ikke tidligere blevet undersøgt.

Nrf1 og Nrf2 er Master regulatorer af oxidativ stress induceret genekspression [18], [ ,,,0],24] – [26]. De er cap-n-collar grundlæggende leucin zipper (CNC-bzip) transkriptionsfaktorer, der, som reaktion på forskellige former for oxidativt stress, kan regulere genekspression gennem det elektrofile respons element (EpRE). Under normale homeostatiske redoxbetingelser, er Nrf2 sekvestreret af Keap1 (Kelch-lignende ECH-associeret protein 1) i cytoplasmaet, hvor det negativt regulerer Nrf2 gennem ubiquitin medieret proteasomalaktivitet nedbrydning [26]. Ved ROS stimulering, Keap1 frigiver Nrf2 at tillade sit nukleare lokalisering og transaktivering via EpRE sekvenser. Men selv om meget opmærksomhed har været fokuseret på rollen som Nrf2 i kræft [25], undersøgelser på den rolle, Nrf1 er blevet alvorligt mangler.

I modsætning til Nrf2, det N-terminale domæne (NTD) af Nrf1 (TCF11), der forankrer Nrf1 til det endoplasmatiske reticulum (ER) membran og kernemembranen, regulerer Nrf1 aktivering og dens translokation til cellekernen [27] – [29]. Desuden kan det humane Nrf1 gen generere både fuld længde 120 kDa Nrf1 (p120-Nrf1) og flere trunkerede (36, 55, 65, og 95 kDa) isoformer af Nrf1 [30], [31]. Af disse mindre Nrf1 isoformer har N-terminal-afkortet 65 kDa isoform (p65-Nrf1) vist sig at besidde betydelige lovgivningsmæssige virkninger med hensyn til Nrf2 medieret transskription. Interessant nok kan håndhæves ekspression af p65-Nrf1 inhiberer Nrf2 medieret induktion af EpRE-regulerede gener [30]. Undersøgelser har også vist, at både Nrf1 og Nrf2 mægle ROS signalering [18], [30]. Således kan ROS signalering og cellulære homeostase ske via reguleringen af ​​en kritisk balance mellem Nrf1 og Nrf2 udtryk og aktivitet. Men deres rolle i AR transaktivering i PCA cellerne ikke er blevet undersøgt,

Flere undersøgelser har impliceret betydningen af ​​Nrf2 i PCa [32] -. [34]. Ekspressionen af ​​Nrf2 er negativt korreleret med Gleason scores i PCA patienter [32] og reducerede niveauer af Nrf2 er blevet forbundet med øget aggressivitet i TRAMP PCa musemodel [33], [34]. Interessant er det også blevet foreslået, at Nrf1 kan regulere Nrf2 udtryk gennem regulering af en EpRE beliggende i Nrf2 promoter region [35]. Men på trods evne Nrf1 at undertrykke Nrf2 medieret transskription [30], rolle Nrf1 i PCa progression er ukendt. Vores tidligere undersøgelser har vist, at CRPC cellelinie C4-2B har forhøjet ekspression af p65-Nrf1 og nedsat ekspression af Nrf2, sammenlignet med androgen afhængig LNCaP-celler og de ikke-tumorgene RWPE-1 og RWPE-2-celler [36] . Da både forbedret AR signalering og androgen deprivation kan inducere ROS udtryk, vi postulerede, at Nrf1 og Nrf2 kan spille en direkte rolle i reguleringen af ​​AR signalering i PCA celler [3], [10]. Derfor har vi undersøgt, om Nrf1 og Nrf2 forskelligt modulere AR transaktivering i androgenafhængige LNCaP celler og i deres androgen uafhængig sub-line, C4-2B.

Da LNCaP og C4-2B celler er syngene PCA linjer, vores resultater i disse cellelinjer viser, at Nrf1 og Nrf2 kan have betydelige roller i PCa progression gennem manifestation af CRPC fænotype. Vores resultater viste klart, at de modsatrettede funktioner Nrf2 og p65 og p120 isoformer af Nrf1 kan regulere DHT-induceret AR transaktivering i PCA celler. Vores undersøgelser implicere yderligere nye mekanismer, der sikrer Nrf1 og Nrf2 regulering modificeret i kastrationsresistent C4-2B cellelinje at lette forbedrede AR transaktivering.

Materialer og metoder

Cell Culture

LNCaP-celler blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC; Catalog # CRL-1740). Den C4-2B cellelinie er en knogle metastatisk sublinie afledt af LNCaP, og var en venlig gave fra Dr. Lelund Chung [37]. Begge cellelinier blev dyrket i RPMI-1640-medier fra Mediatech (Manassas, VA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) fra Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA) og 1% penicillin /streptomycin (Mediatech). DHT behandlinger blev udført i phenolrødtfrit RPMI medier (Mediatech) med 10% trækul strippet føtalt bovint serum (CS-FBS) fra Innovative forskningslaboratorier (Novi, Michigan). Celler blev trypsinbehandlet, udpladet og fik lov til at binde natten over i komplette medier, hvorefter medium blev ændret til CS-FBS indeholdende RPMI. Efter inkubation natten over i CS-FBS indeholdende medium blev celler eksponeret for DHT (0-10 nM) i CS-FBS medier og høstet på de angivne tidspunkter for at måle RNA, protein og reportergenekspression.

Reagenser

DHT blev opnået fra Steraloids (Wilton, VA). Nrf1 antistof blev opnået fra Proteintech Group (Chicago, IL). Antistoffer mod Nrf2, AR, og TATA-bindende protein (TBP) blev opnået fra Abcam (Cambridge, MA). Isotype IgG (ikke-specifik kontrol) og alle sekundære anti-humane antistoffer blev opnået fra Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Anti-V5-antistof blev opnået fra Invitrogen (Carlsbad, CA). AR-antistof anvendes til chip assays blev opnået fra Active Motif (Carlsbad, CA). Den Nrf1 specifikke siRNA og den ikke-specifikke kontrol (NC1) siRNA blev opnået fra Integrated DNA Technologies (Coralville, IA. Cat # HSC.RNAI N003204.12.1-3). Plasmider blev fremstillet af følgende kilder: p65-Nrf1 ekspressionsvektor (p65-Nrf1-V5His) var en elskværdig gave fra Dr. Chan [30], den p120-Nrf1-V5His ekspressionsvektoren blev opnået fra Dr. Zhang [38] og den psPSA-Luc reporter (ildflueluciferase) vektor blev opnået fra Dr. Abdel-Mageed laboratorium [39]. PRL-TK (Renilla luciferase) vektoren blev købt fra Promega (Madison, WI). Den Nrf2 ekspressionsvektor (pCMV6-Nrf2) blev indkøbt fra Origene (Rockville, MD) og pcDNA3.1 kontrol vektor blev købt hos Invitrogen (Carlsbad, CA).

Kvantitativ RT-PCR

efter behandling blev mRNA isoleret under anvendelse af Trizol-reagens ifølge producentens instruktioner (Invitrogen). CDNA’et blev fremstillet ved anvendelse af høj kapacitet Reverse Transcription Kit fra Applied Biosystems (Foster City, CA). RT-PCR-primere blev syntetiseret på Midland Certified Reagent Company (Midland, TX) og SYBR Green Master Mix blev indkøbt fra Applied Biosystems (Foster City, CA). De følgende primersekvenser anvendtes til kvantitativ RT-PCR:

AR

: 5′-GGTGAGCAGAGTGCCCTATC-3 ‘og 5′-GAAGACCTTGCAGCTTCCAC-3’;

GAPDH

: 5′-TCCCATCACCATCTTCCA-3 ‘og 5′-CATCACGCCACAGTTTCC-3’;

PSA:

5′-AGGCCTTCCCTGTACACCAA-3 ‘og 5′-GTCTTGGCCTGGTCATTTCC-3’; og

TMPRSS2

:5′-GTCCCCACTGTCTACGAGGT-3 ‘og 5′-CAGACGACGGGGTTGGAAG-3’. Fold ændringer i genekspression blev beregnet efter normalisering til deres tilsvarende GAPDH mRNA-niveauer.

Nuklear Protein Extraction

nukleare pellets til westerns blev isoleret ved hjælp af CER-I og CER-II udvinding buffere fra NE-PER Nuclear Extraction kit (Pierce, Rockford, IL). Kerner blev vasket med HBSS og nuklear protein blev ekstraheret med en brugerdefineret nuklear buffer protein lysis [50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 500 mM NaCl, 1% NP-40, 1% natrium-deoxycholat, 0,1% SDS, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) og 1 mM EDTA]. Nuklear protein blev kvantificeret under anvendelse af BCA-protein estimation kit fra Thermo Scientific (Rockford, IL).

immunblotting

Proteinprøver blev kogt i 01:01 volumen af ​​protein og påsætningsbuffer [100 mM Tris (pH 6,8), 25% glycerol, 2% SDS, 0,01% bromphenolblåt, 10% 2-mercaptoethanol] i fem minutter. Kerneproteiner (20-50 ug) blev elektroforesebehandlet på Tris-HCI PAGE geler og våd overført til nitrocellulosemembraner. Efter blokering med 5% mælk i TBST-buffer (TBS med 0,05% Tween-20) blev membranerne hybridiseret med de angivne antistoffer. Bånd blev derefter detekteret under anvendelse af Lumiglo kemiluminescerende substrat-system (KPL, Gaithersburg, MD). Båndintensiteter blev kvantificeret med Image-J Software (NIH) og værdier blev normaliseret til TBP proteinniveauer i deres respektive prøver.

transient transfektion og luciferaseassays

Celler blev podet i plader med 6 brønde natten over, før transfektion med Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) og de angivne vektorer. For luciferaseassays blev celler transficeret med enten den psPSA-

luc

reporterplasmid alene eller i kombination med lige store mængder af Nrf1 ekspressionsvektor (p65-Nrf1-V5-His eller p120-Nrf1-V5-His), eller Nrf2 ekspressionsvektor (pCMV6-Nrf2), eller en kontrol ekspressionsvektor (pcDNA3.1). At normalisere for transfektionseffektiviteten blev cellerne også co-transficeret med pRL-TK (Renilla luciferase) vektor. Western undersøgelser blev også udført med de angivne ekspressionsvektorer alene. Kort fortalt blev celler inkuberet natten over i transfektion opløsning (20 pi Lipofectamin, 400 ng luciferase vektor og /eller ekspressionsvektor, og 100 ng pRL-TK) i 2 ml serum /phenolrødt frie medier. Efter inkubation natten over blev mediet fjernet, og cellerne blev udsat for DHT (0, 1 eller 10 nM) i 24 timer i CS-FBS indeholdende phenolrødt frit RPMI. Celleekstrakter blev høstet og luciferase-niveauer blev bestemt ved anvendelse af dobbelt Luciferase Reporter Assay kit (Promega, Madison, WI). I hvert forsøg ildflueluciferase værdier (fra psPSA-luc) blev normaliseret til Renilla luciferase værdier (fra pRL-TK). Nuklear protein blev ekstraheret efter behandling og evalueret ved Western for ændringer i proteinekspression nukleare. I parallelle forsøg blev celler også transficeret med Nrf1 og Nrf2 ekspressionsvektorer alene for at overvåge DHT-induceret ekspression af to AR regulerede gener, PSA (prostataspecifikt antigen) og TMPRSS2 (transmembrane protease, serin 2).

siRNA Transfektion

lille interfererende RNA (siRNA) transfektioner blev udført under anvendelse Transfast reagens fra Promega (Madison, WI). Kort fortalt blev celler inkuberet natten over (-18 timer) i transfektion løsning, der bestod af Transfast reagens (2:01 fortynding) og 20 nM enten Nrf1 siRNA eller NC1 (kontrol) siRNA i serum og phenolrødt frit RPMI. For plasmid cotransfections blev celler samtidig transficeret med både siRNA og plasmid ved en 2:01 fortynding af Transfast reagens, som beskrevet i luciferase assay sektion. Efter natten over transfektion blev mediet fjernet, og cellerne blev udsat for de angivne behandlinger. Celler blev derefter høstet efter 24 timer og luciferaseassays blev udført. I parallelle prøver blev RNA og nuklear protein opnået at overvåge genekspression ved QRT-PCR og ved western.

Immunopræcipitation

For co-immunpræcipitering og immunblotting (co-IP /IB) undersøgelser, LNCaP og C4-2B celler blev behandlet med 0, 1, eller 10 nM DHT i 6 timer. Nukleare pellets blev isoleret ved anvendelse af en nuklear isolation buffer (10 mM HEPES, 10 mM KCI, 2 mM MgC

2, 100 pM EDTA, 500 pM DTT, 0,625% NP-40, proteasehæmmere, og phosphataseinhibitorer). Efter vask i PBS to gange, RIPA buffer (150 mM NaCl, 10 mM Tris (pH 8,0), 5 mM EDTA, 1% deoxycholat, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, proteaseinhibitor, og phosphataseinhibitorer) blev tilsat nukleare pellets og pellets blev sonikeret for at isolere kerneprotein. Protein blev præ-ryddet for 30 minutter med protein-G /protein-A agaroseperier (Calbiochem kat # IP10). AR-antistof (Abcam; ab74272) blev derefter tilsat til 100 ug kerneprotein i 400 pi RIPA-lysepuffer og inkuberet ved 4 ° C natten over. Proteinet-G /protein-A-agaroseperler blev derefter tilsat til protein og inkuberes i 2 timer. Efter inkubation blev perlerne vasket 3 gange i RIPA lysebuffer og lastning farvestof blev tilsat til prøven. Prøver blev derefter kogt i 5 min ved 95 ° C, påført på gelen, og immunblottet (IB) med de angivne antistoffer.

chromatin immunoprecipitation

I kromatin immunopræcipitation (chip) assays anvendte vi to forskellige kits, den Covaris (Woburn, MA) truChIP kromatin klipning kit med nonioniske buffer og Active Motif (Carlsbad, CA) chip-IT høj følsomhed kit. Analyserne blev udført ifølge producentens protokoller, med mindre modifikationer. Kort fortalt DHT behandlede (6 timer) LNCaP og C4-2B celler blev klippet ved anvendelse af Covaris truChIP kit under anvendelse af en E220 fokuseret-ultralydsapparat fra Covaris. Kromatin prøver blev fortyndet i chip-buffer fra Active Motif kit. Prøver blev derefter immunopræcipiteret (IP) med enten Nrf1 antistof (Proteintech Group) eller AR-antistof (Active Motif). Resten af ​​assayet blev udført ifølge de aktive motiv kit instruktioner. Er specifikke QRT-PCR blev udført på IP DNA ved anvendelse af primere for ARE-II sekvenser lokaliseret inden for PSA-promotoren (5′-CCACAAGATCTTTTT ATGATGACAG-3 ‘og 5′-GCTCATGGAGACTTCATCTAG-3’). Ændringer i forstærkede band intensiteter blev kvantificeret.

elektroforetiske mobilitet Shift Analyser

2

nd generation DIG Gel Shift kit fra Roche (Branford, CT) blev anvendt til EMSA studier. Androgenet responselement (ARE) og TCF11 og TCF11 /MafG (Nrf1 bindende) sekvenser [29] blev syntetiseret fra Midland Certified reagens selskab. Sekvenserne for hvert EMSA oligonukleotid er som følger:

TCF11

:5′-GTCATTT-3 ‘og 3′-AAATGAC-5’;

ER

: 5′-GATCCTTGCAGAACAGCAA GTGCTAGCTG-3 ‘og 3′-GAACGTCTTGTCGTTCACGATCGACCTAG-5’; og

TCF11

/

MafG

: 5′-CCCAAATGACAATGCGATTGA-3 ‘, 3′-TCAATCGCATTGTCATTTGGG-5’ (Genomatix Matlnspector). Kort fortalt blev kerneprotein ekstraheret fra celler behandlet med DHT i 6 timer og bindende reaktioner med DIG mærkede oligonukleotider blev udført. ER oligoer blev inkuberet med nuklear protein (10 ug) i 30 minutter, hvorefter prøvepåsætningsbuffer blev tilsat, og prøver blev elektroforesebehandlet på en 5% TBE PAGE gel (Bio-Rad, Hercules, CA). Prøverne blev derefter overført til en nylonmembran, inkuberet med blokeringsbuffer, udsat for et anti-DIG-antistof, vasket og udviklet ved anvendelse af ECL kemiluminescenssystemet, som tidligere beskrevet. For konkurrenceundersøgelser, kerneekstrakter blev præinkuberet med overskydende (50 gange) umærkede ER, TCF11 eller TCF11 /MafG oligoer i 30 minutter før DIG-mærkede ER oligoer blev tilsat til reaktionen. Til forsøg under anvendelse af antistoffer, til at konkurrere om Nrf1 binding blev kerneekstrakter præ-inkuberet med enten Nrf1 antistof eller med kanin IgG (ikke-specifik kontrol) i 30 minutter før DIG-mærkede ER oligoer blev tilsat til reaktionen. Elektroforese, overførsel og hybridisering blev udført som beskrevet ovenfor.

Statistical Analysis

Hver behandling betingelse bestod af 2-4 replikater og hvert eksperiment blev udført 2-5 gange. Relativ ekspression blev bestemt ved at sammenligne behandling værdier til kontrolværdier efter normalisering til lastning kontrol. Statistisk signifikans blev vurderet ved to-vejs ANOVA under anvendelse af GraphPad Prism software. Væsentlige ændringer fra kontroller er angivet med p-værdier for. 0,05

Resultater

AR transaktiveringsfunktion Niveauer er væsentligt højere i C4-2B Celler end i LNCaP Celler

Til sammenligne DHT-induceret AR transaktiveringsassays niveauer i LNCaP og C4-2B celler, vi udført luciferaseassays i psPSA-

luc

vektor transficerede celler (fig. 1A). Vi observerede, AR transaktivering var signifikant (p 0,001) højere i C4-2B celler end i LNCaP-celler. Efter DHT behandling, viste LNCaP-celler en dosisafhængig stigning i AR transaktivering (5 fold ved 1 nM og 21 gange ved 10 nM). I modsætning hertil C4-2B celler, blev en 100 ganges stigning iagttages selv ved 1 nM DHT (p 0,001) og en mere end 130-fold forøgelse (p 0,001). Sås efter udsættelse for 10 nM DHT (Fig 1A ). Vi har også udført immunoblotting undersøgelser for at bestemme nukleare AR niveauer under begge stimulerede og DHT-stimulerede betingelser (fig. 1B). I begge cellelinier, blev en 2-5 gange stigning i nukleare AR niveauer ses efter 24 timer DHT-stimulering. Trods lignende nukleare AR niveauer efter DHT behandling, viste C4-2B celler betydeligt højere AR transaktiveringsassays niveauer i forhold til LNCaP celler. Dette indikerede, at yderligere mekanismer, der forstærker DHT-stimuleret AR transaktivering er til stede i C4-2B celler.

(A). Cellerne blev cotransficeret med psPSA-

luc

pRL-TK (intern kontrol). Virkningen af ​​24 timer stimulering med enten 1 nM eller 10 nM DHT på fold ændringer i luciferaseaktivitet (ildflue /Renilla RLU) er vist (n = 3). DHT-induceret AR transaktivering er signifikant (***; p 0,001) højere i C4-2B celler sammenlignet med LNCaP-celler. (B). DHT-induceret AR kernelokalisering i LNCaP og C4-2B celler. Efter 24 timers DHT (0, 1 og 10 nM) stimulation (n = 4) vestlige immunblots viser ændringer i AR nukleare niveauer. Både C4-2B og LNCaP celler viste tilsvarende niveauer af nukleare AR følgende DHT-stimulering. (C). p65-Nrf1 og Nrf2 niveauer efter DHT-stimulering. Vestlige immunoblots viser nukleare p65-Nrf1 og Nrf2 niveauer efter 24 timers af DHT stimulation (n = 3). Forskelle i nuklear p65-Nrf1 og Nrf2 blev observeret i LNCaP og C4-2B celler. Fold ændringer og ± SEM værdier repræsenterer relative forskelle i ekspressionen af ​​AR, p65-Nrf1, og Nrf2. I begge (B) og (C), data blev normaliseret til TBP-niveauer i hver prøve.

DHT medieret regulering af p65-Nrf1 og Nrf2 Nuclear Lokalisering

Vi først bestemmes, hvis DHT behandling ændrer Nrf1 og Nrf2 kernelokalisering (fig. 1C). Nukleare niveauer af p65-Nrf1 blev differentielt påvirket i LNCaP og C4-2B celler. I C4-2B celler, DHT stimulation øget nukleare p65-Nrf1 niveauer, mens der i LNCaP celler DHT-stimulering ikke signifikant ændre nukleare p65-Nrf1 niveauer. Imidlertid blev Nrf2 nukleare lokalisering ikke signifikant ændret af DHT behandling i enten LNCaP eller C4-2B celler (Fig. 1C). Derfor undersøgte vi evnen af ​​p65-Nrf1 og Nrf2 at regulere AR transaktivering i både PCA cellelinier.

Modulation af p65-Nrf1 Expression væsentligt ændret DHT-induceret AR Transaktivering

Vi undersøgte, om ektopiske ændringer i Nrf1 niveauer kan påvirke AR transaktivering i DHT-stimulerede LNCaP og C4-2B celler (fig. 2). Da nuklear p65-Nrf1 er konstitutivt højere i C4-2B celler end i LNCaP celler [36], brugte vi siRNA at lukke munden på endogene Nrf1 niveauer i C4-2B celler (Fig 2A . 2B) og en V5-His drevet p65- Nrf1 ekspressionsvektor (p65Nrf1-V5-His) til at overudtrykke p65-Nrf1 i LNCaP-celler (fig 2C . 2D). Niveauerne af nukleare Nrf1 i siRNA transficerede C4-2B celler og niveauet for V5 fusionsproteiner i Nrf1 overeksprimeres LNCaP celler er vist i figurerne 2B og 2D, hhv. I C4-2B celler cotransficeret med psPSA-

luc

vektor, og med enten Nrf1 siRNA eller NC1 kontrol siRNA viste luciferaseassays at Nrf1 undertrykkelse signifikant (p 0,001) reducerer AR transaktivering (fig 2A.). I LNCaP-celler, luciferaseassays viste også, at p65-Nrf1 overekspression øger DHT-stimuleret AR-aktivitet ved ca. 2 gange ved 1 nM DHT og med ca. 4,4 gange ved 10 nM DHT (p 0,001) (figur 2C).. Disse resultater antydede, at p65-Nrf1 forbedrer AR transaktiveringsfunktion AR transaktivering i både PCA cellelinier.

(A) Effekt af Nrf1 knockdown på AR transaktivering i DHT-stimulerede C4-2B celler. Celler blev co-transficeret med psPSA-luc vektor og med enten Nrf1 siRNA eller kontrol siRNA (NC1). Fold ændringer i luciferaseaktivitet (ildflue /Renilla RLU) efter Nrf1 knockdown er vist (n = 3; p 0,01). (B) Nukleare p65-Nrf1 proteinniveauer efter siRNA medieret knockdown i C4-2B celler (n = 2). Data blev normaliseret til TBP niveauer. (C) Effekt af p65-Nrf1 overekspression på DHT-induceret AR transaktivering i LNCaP celler. Celler blev co-transficeret med psPSA-luc vektor og med enten kontrolvektoren (pcDNA3.1) eller p65-Nrf1 ekspressionsvektor (p65-Nrf1-V5-His). Fold er vist ændring i luciferaseaktivitet efter Nrf1 overekspression (n = 3; p 0,001). (D) Ændringer i nukleare V5 protein (tag) i pcDNA3.1 (kontrol) eller p65-Nrf1-V5-His transficerede LNCaP celler (n = 2). Fold ændringer repræsenterer relative (V5 /TBP) forskelle i Nrf1.

I parallelle undersøgelser, vi også målt udtryk for to AR regulerede gener, PSA og TMPRSS2, i celler transficeret med p65-Nrf1 udtryk vektor (. fig S1-A S1-B). Vores QRT-PCR-data viste klart, at p65-Nrf1 signifikant (p 0,01) øger både TMPRSS2 og PSA mRNA-niveauer i DHT-behandlede LNCaP celler. Dette tjente som en bekræftende bevis på, at p65-Nrf1 er en potentiel AR coaktivator.

Nrf2 Negativt Regulerer AR Transaktivering

Virkningerne af Nrf2 overekspression på AR transaktivering blev overvåget i både LNCaP og C4-2B celler (fig. 3). Nrf2 overekspression undertrykte signifikant DHT-stimuleret AR-aktivitet. (. Figur 3A) i LNCaP-celler, Nrf2 overekspression undertrykt AR transaktivering under både basal (50%; p 0,001) og DHT-stimulerede betingelser (60%; p 0,0001). Nrf2 overekspression reducerede også DHT-induceret AR transaktiveringsassays niveauer i C4-2B celler (Fig 3B.) Med ca. 33% ved 1 nM DHT og med 40% ved 10 nM DHT (p 0,05). Nuklear Nrf2 ekspression i transficerede LNCaP og C4-2B celler er vist over hver behandlingsbetingelser.

Virkningerne af Nrf2 overekspression på DHT-stimuleret AR-aktivitet blev overvåget i både LNCaP (A) og C4-2B (B) celler. Celler blev transficeret med psPSA-luc reporterplasmid, og med enten Nrf2 ekspressionsvektor (pCMV-Nrf2) eller kontrolvektoren (pcDNA3.1) og stimuleret med DHT (0-10 nM) i 24 timer (n = 5) . Signifikante forskelle i luciferaseaktivitet (ildflue /Renilla RLU) fra kontroller repræsenteret *; p 0,05, ***; p 0,001 og ****; p 0,0001. I både (A) og (B), paneler over søjlegraferne repræsenterer ændringer i nukleare Nrf2 niveauer efter transfektion med pCMV-Nrf2. I (C) og (D), effekter af Nrf2 overekspression om nukleare niveauer af AR i både ubehandlede og DHT (0, 1, 10 nM) behandlet LNCaP (C) og C4-2B (D) celler er vist. Data blev normaliseret til nukleare TBP niveauer. Fold ændringer og ± SEM værdier repræsenterer forskelle i nukleare AR niveauer sammenlignet med ubehandlede celler.

Dernæst virkningen af ​​Nrf2 overekspression om nukleare AR-niveauer blev målt i begge LNCaP-celler (fig. 3C) og C4-2B celler (fig. 3D). Interessant nok i DHT-behandlede LNCaP-celler, Nrf2 overekspression reduceret AR kernelokalisering med næsten 79%. Desværre fik Nrf2 overekspression ikke væsentligt ændrer nukleare AR niveauer i DHT-behandlede C4-2B celler. Disse fund indikerer, at Nrf2 kan være en potent negativ regulator af DHT-induceret AR transaktivering i begge PCA cellelinier. Men i LNCaP-celler, men ikke i C4-2B celler, denne undertrykkende virkning kan medieres via undertrykkelse af AR kernelokalisering.

Ændringer i Nrf1 og Nrf2 må ikke ændres AR Gene Expression eller AR Nuclear Localization

Vi næste vurderet, om ændringer i Nrf1 og Nrf2 overekspression påvirker AR genekspression og AR nukleare lokalisering (fig. S2). QRT-PCR undersøgelser viste, at hverken p65-Nrf1 overekspression i LNCaP-celler (Fig. S2-A) eller p65-Nrf1 knockdown i C4-2B celler (Fig. S2-B) ændret AR mRNA-niveauer, under enten basal eller DHT-stimuleret betingelser. Western immunodetektions undersøgelser viste, at DHT-induceret kernelokalisering af AR var upåvirket af enten p65-Nrf1 overekspression (fig. S2-C) eller Nrf1 knockdown (Fig. S2-D). Tilsvarende havde Nrf2 overekspression i DHT-behandlede LNCaP og C4-2B celler ikke påvirke AR genekspression (fig S2-E . S2-F). Således ikke Nrf1 ikke ændre AR transaktivering gennem regulering af enten AR genekspression eller AR nukleare lokalisering. Desuden undertrykkende effekter af Nrf2 ikke skyldes ændringer i AR genekspression.

protein-protein interaktioner mellem Nuclear Nrf1 og AR forekomme hos både LNCaP og C4-2B Celler

For at afgøre, om de Nrf1 proteiner (p65- og p120-) regulere AR funktion via direkte interaktion med nukleare AR protein, vi udførte AR immunopræcipitationer (IP) fra nukleare ekstrakter af ubehandlede og DHT-behandlede LNCaP og C4-2B celler (fig. 4A). IP proteiner blev derefter immunblottet (IB) til enten p65-Nrf1 eller p120-Nrf1. Co-IP /IB undersøgelser viste, at både p65-Nrf1 og p120-Nrf1 associeret med nukleare AR protein i både LNCaP og C4-2B celler. Men nuklear AR interagerede med p65-Nrf1 på et langt højere niveau end den observeret med p120-Nrf1.