PLoS ONE: Den MAPK Pathway Signals Telomerase Modulation i Reaktion på isothiocyanat-induceret DNA Skader på Human Liver Cancer Cells

Abstrakt

4-methylthiobutyl isothiocyanat (MTBITC), en alifatisk, svovlsyre forbindelse fra

Brassica

grøntsager, besidder

in vitro

in vivo

antitumoraktivitet. For nylig vist, vi den potente vækstinhiberende potentiale af DNA-ødelæggende middel MTBITC i human lever cancerceller. Her viser vi nu, at MTBITC ned regulerer telomerase som sensibiliserer celler til apoptose induktion. Dette medieres af MAPK-aktivering, men uafhængigt af produktionen af ​​reaktive oxygenspecies (ROS). Inden for en time, MTBITC induceret DNA-beskadigelse i cancerceller korrelerer til en forbigående stigning i hTERT mRNA-ekspression som derefter omdannet til telomerase suppression, tydelig på mRNA samt enzymaktivitet niveau. For at tydeliggøre rollen som MAPK for telomerase regulering, lever kræftceller blev forbehandlet med MAPK-specifikke hæmmere før MTBITC eksponering. Dette viste tydeligt, at forbigående stigning af hTERT mRNA-ekspression overvejende blev medieret af MAPK familiemedlem JNK. I modsætning hertil aktiveret ERK1 /2 og P38, men ikke JNK og signalerede, at telomerase ophævelse og deraf følgende apoptose induktion. DNA-beskadigelse ved MTBITC blev også kraftigt afskaffet ved MAPK-inhibering. Oxidativ stress, som analyseres af DCF fluorescens assay, elektron spin resonans spektroskopi og dannelse af 4-hydroxynonenal blev fundet som ikke relevant for denne proces. Desuden har N-acetylcystein forbehandling ikke påvirke MTBITC-induceret telomerase suppression eller depolarisering af den mitochondriemembranpotential som markør for apoptose. Vores data indebærer derfor, at ved DNA-skader ved MTBITC, MAPK er afgørende for telomerase regulering og deraf følgende vækst værdiforringelse i leveren tumorceller og denne detalje formentlig spiller en vigtig rolle i forståelsen af ​​potentielle kemoterapeutiske effekt af ITC

Henvisning.: Lamy E, Herz C, Lutz-Bonengel S, Hertrampf A, Márton MR, Mersch-Sundermann V (2013) Den MAPK Pathway Signals Telomerase Modulation i reaktion på isothiocyanat-induceret DNA Skader på human Liver Cancer Cells. PLoS ONE 8 (1): e53240. doi: 10,1371 /journal.pone.0053240

Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: Juli 2, 2012; Accepteret: November 27, 2012; Udgivet: 31 januar 2013

Copyright: © 2013 Lamy et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. E.L. er finansieret af en akademisk bevilling fra Den Europæiske Socialfond Fond og Ministeriet for Videnskab, Forskning og Arts Baden-Württemberg, Tyskland. M-R.M.. blev delvist finansieret til dette projekt ved Sektorudvalg operationelle program “Udvikling af menneskelige ressourcer 2007-2013” af det rumænske Arbejds-, Familie- og Socialministeriet gennem den økonomiske aftale POSDRU /88 /1,5 /S /60.203. Undersøgelsen blev delvist støttet af en bevilling fra Mattern Foundation, Tyskland. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Telomerase tilvejebringer et lovende mål for et

selektiv

terapeutisk fremgangsmåde af maligniteter ved, at 80 til 90% af cancerceller stabilt (gen) udtrykker dette enzym, mens den er undertrykt i de fleste normale somatiske væv [ ,,,0],1]. hTERT, den katalytiske underenhed af enzymet, er kendt for at udøve anti-apoptotiske virkninger og interagere med DNA beskadigelse respons pathway. Følgelig cancerceller er mere resistente over for kemoterapeutiske midler eller strålebehandling [2], [3], [4], [5].

isothiocyanater (ITC), naturligt forekommende sekundære plantestoffer bestanddele af familien

Brassicaceae,

er kendt for deres kemoforebyggende og -therapeutic handlinger både

in vitro

in vivo

[6], [7], [8]. En række undersøgelser rapporterede væksten undertrykke og apoptoseinducerende styrke af denne gruppe i cancerceller og undersøgte underliggende signalveje [9]. ITC er blevet vist at interferere med mange faktorer, der er ændret i cancerceller, såsom interaktion med Bcl-2-familien, men de har også vist sig at selektivt nedsætte HDAC-aktivitet [10]. For nylig ITC blev vist som potente telomerase-hæmmere under apoptose induktion i forskellige kræftceller [11], [12], [13], [14]. Sulforaphane (SFN), e. g. undertrykt telomerase under dens proliferation inhibering af MCF-7 samt MDA-MB-231 brystcancerceller [11]. Telomerase ophævelse af SFN eller phenylethyl ITC blev også korreleret med programmeret død i HeLa cervical samt PC-3 prostatacancerceller [13], [14]. SFN inhiberes endvidere telomerase i humane Hep3B liver cancerceller, hvilken parallelkoblede programmeret celledød [12]. Denne inhibering blev derefter foreslog at være medieret af produktion af reaktive oxygenarter (ROS). Andre undersøgelser har vist, så langt, at oxidativt stress og aktivering af mitogen-aktiveret (MAPK) signalvejen var involveret i drabet på kræftceller ved ITC [15]. Men data offentliggjort hidtil indebærer, at ROS afhængighed af celledød samt MAPK involvering kan være celle specifik.

I tidligere undersøgelser, vi allerede demonstreret effektiv vækst nedsat lever- kræftceller ved ITC [16]. Vi således sigte i nærværende undersøgelse at undersøge relevansen af ​​MAPK aktivering og oxidativt stress for celledød og telomerase regulering i humane lever kræftceller. Derfor brugte vi telomerase positive HCC cellelinier (HepG2, Huh7 og Hep3B) afviger i deres tumor suppressor p53 (TP53) status samt primære sunde humane hepatocytter, blottet for telomerase. Vore resultater bekræfter aktiveringen af ​​alle tre MAPK (JNK, ERK1 /2 og P38) ved MTBITC behandling uafhængig af TP53 eller malignitet status af cellerne. Vi kunne desuden vise, at væksten værdiforringelse samt ændringer i telomerase-niveau blev signaleret af MAPK men ikke relateret til ROS produktion. DNA-skader udløst af MTBITC blev hæmmet i celler, når MAPK blev specifikt blokeret.

Materialer og metoder

Kemi

N-acetylcystein (NAC), menadion, 2 ‘, 7 ‘dichlorofluorescein diacetat (DCF-DA), dexamethason, Tween 20, benzo [a] pyren (B (a) P og propidiumiodid (PI) er erhvervet fra Sigma Aldrich (Steinheim, Tyskland) DMSO (renhed . 99% ) var fra AppliChem (Darmstadt, Tyskland). β-mercaptoethanol og valinomycin blev købt fra Fluka (Buchs, Schweiz). Dulbeccos minimalt essentielt medium (DMEM), føtalt kalveserum (FCS), trypsin 10 × (25 mg /ml), trypsin-EDTA 10 × (5 mg /ml henholdsvis 2,2 mg /ml), L-glutamin og phosphatbufret saltvand (PBS, uden Ca og mg) var fra PAA Laboratories GmbH (Coelbe, Tyskland). penicillin-streptomycin (P /S) opløsning, RPMI-1640, 5,5 ‘, 6,6′-tetrachlor-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodid (JC-1), insulin-transferrin-selen (ITS) og SYBR guld 10.000 × var fra life Technologies Invitrogen (Darmstadt, Tyskland) ,. 4-hydroxynonenal (HNE) blev købt fra Cayman Europe (Tallinn, Estland). 4-methylthiobutyl isothiocyanat (MTBITC, erucin) blev syntetiseret ved Inst. of Organic Chemistry, University of Giessen, Tyskland, som beskrevet før [17].

p38 inhibitor SB203580, JNK inhibitor SP600125 og JNK inhibitor V blev købt fra Santa Cruz, (Californien, USA). Den ERK1 /2-inhibitoren U0126, p38-inhibitor SB202190 og ERK1 /2-inhibitor PB98059 blev opnået fra Cell Signalling (Boston, USA). De følgende primære antistoffer blev anvendt til immunoblotting: anti-p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr201, 1:2000), anti-p-JNK (Thr 183 /Tyr185, 1:2000, klon G9), anti-PC-Jun Ser73 og anti-p-p38 (Thr180 /Tyr182, 1:500) fra Cell Signalering, anti- 4-hydroxynonenal (1:250; klon 198.960) fra R Cell Quest Pro

© software og FlowJo software (Treestar Inc, Ashlandd, USA) blev anvendt til at kvantificere procentdelen af ​​apoptotiske celler i “sub-G1” eller “hypoploid” peak.

Caspase 3 /7 KLØVNINGSASSAY

Caspase 3/7 spaltning blev anvendt som specifik parameter for apoptose induktion. Dette blev bestemt i HepG2-celler ved hjælp af Caspase3 /7-Glo assay (Promega, Tyskland) ifølge producentens instruktioner.

Vurdering af mitokondriemembranen Potential (MMP)

Til påvisning af ændringer i MMP på enkelt celle niveau, blev den lipofile kation JC-1 anvendes. Behandlede prøver blev høstet ved trypsination, vasket to gange med PBS og resuspenderet i 1 ml dyrkningsmedium suppleret med proben JC-1 i en slutkoncentration på 2,5 ug /ml. Prøverne blev resuspenderet og inkuberet under celledyrkningsbetingelser i 30 minutter. Før analyse blev cellerne vasket to gange med kold PBS og analyseres derefter direkte af en FACSCalibur (BD, Heidelberg, Tyskland).

Påvisning af celleældning af ß-galactosidase Farvning

Ældning blev påvist ved hjælp af senescens ß-galactosidase-farvning kit (Cell Signaling Technology, Boston, USA) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Efter celle behandling med MTBITC eller kontrollerer billeder blev taget med et klart lys mikroskop (kompakt mikroskop systemet 8100E, Keyence, Osaka, Japan) med en objektiv Plan Apo 4 × /0,2 og en optisk forstørrelse på 4 × (Nikon, Japan).

Protein Analyse ved immunblotting

Proteiner blev analyseret ved immunoblotting efter en modificeret protokol af Burnette [22]. Proteinkoncentration blev bestemt som beskrevet af Bradford [23]. For immunoblotting blev 20 ug protein blandet med klar gjort SDS-holdige prøvebuffer, suppleret med 1% beta-mercaptoethanol. Elektroforese blev udført i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Laemmli [24]. Gelen blev derefter overført til en nitrocellulosemembran ved våd-blotting (0,7 mA /cm

2, 90 min.), Blokeret med 5% fedtfattig mælk i TBS /Tween 0,1% og inkuberet med primært antistof i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C, og efterfølgende peberrodsperoxidase (HRP) -mærket sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur, hver. Efter antistof inkubering blev proteinerne af interesse detekteres ved kemiluminescens teknik. Et digitalt billede af western blot blev fanget af gelen dokumentationssystem Molekylær Imager® ChemiDoc ™ XRS sytem (Bio-Rad, München, Tyskland). Størrelse tilnærmelser blev taget ved at sammenligne de farvede bånd til den for et protein standard indlæst under elektroforese. Fremgangsmåden blev gentaget for det strukturelle protein beta-actin. Mængden af ​​målprotein kunne derefter indekseret til det strukturelle protein til at styre mellem grupperne.

Telomerase Aktivitet Måling af TRAP-Assay

Telomerase-aktivitet blev påvist ved hjælp af TeloTAGGG ELISA Kit, kommercielt tilgængelig fra Roche (Mannheim, Tyskland). Analysen blev udført efter producentens anvisninger med mindre ændringer. For helt protein lysater blev celler lyseret ved hjælp af celle lytisk reagens fra Sigma Aldrich indeholdende 10 mM PSMF og 5 mM p-mercaptoethanol i 30 min ved 4 ° C. Proteinkoncentrationen blev bestemt efter fremgangsmåden beskrevet af Bradford [23] metode. For telomerase reaktionen blev et totalt reaktionsvolumen på 50 pi med lige store mængder af protein og 2 × TeloTAGGG reaktionsblanding inkuberet ved 25 ° C i 20 minutter efterfulgt af denaturering ved 94 ° C, 5 min, 30 cyklusser (ved 94 ° C i 30 s, ved 50 ° C i 30 s, og ved 72 ° C, 90 s). Endelig forlængelse blev udført ved 72 ° C, 10 min. Som negative kontroller et tilsvarende volumen lysis opløsning, nuclease frit vand og varmeinaktiveret DMSO behandlede prøve 0,1% (95 ° C i 5 min) blev anvendt. 5 pi eller 2,5 pi PCR-produkter blev anvendt til ELISA ifølge producentens protokol. 30 pi af PCR-produkterne blev fyldt med 1 × loading buffer på en TBE /12,5% polyacrylamidgel; elektroforese blev udført ved 50 V i 30 minutter og efterfølgende 180 V for 5-6 timer. Gelen blev farvet med 1 × SYBR guld /TBE-opløsning i 20 min og detekteret under UV-lys. For molekylvægt bestemmelse, blev 1 ug 50 bp DNA-stige (Fermentas, St. Leon-Rot, Tyskland), der anvendes.

Kvantitative Real Time-PCR af fuld længde hTERT Transcript

Total RNA blev isoleret med RNeasy mini Isolation kit fra Qiagen (Hilden, Tyskland) efterfulgt af et oprensningstrin ved hjælp af RNase-fri DNase kit fra Qiagen. Revers transkription af 1 ug totalt RNA fra hver prøve blev udført i 20 pi ved anvendelse af første streng cDNA syntesekit fra Fermentas. En 168 bp fragment af hTERT-cDNA blev amplificeret ved anvendelse af følgende oligonukleotider ved de angivne slutkoncentration: sense 5’GACACCATCCCCCAGGAĆ3 (50 nM) og antisense 5’TCGTGGAATGTTACGAGCAG3 (50 nM). Kvantitativ realtid (QRT -) – PCR-reaktionen blev udført i et totalt volumen på 25 pi indeholdende Maxima SYBR Green qPCR Master Mix 2 × (Fermentas), angivne koncentration af forward og reverse primer og 2,5 pi cDNA ved anvendelse 96-brønd 0,2 ml tyndvægget PCR-plader og MyIQ Real time PCR System (Bio-Rad, München, Tyskland). De QRT-PCR-betingelserne var: 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 10 s, 54 ° C i 60 s. Data blev indsamlet i forlængelse trin. Bagefter blev en smeltende kurve gennemføres for at kontrollere specificiteten af ​​primerparrene. For at normalisere de beløb, blev henvisningen gen PBDG med følgende oligonukleotider anvendt: sense 5’AGGATGGGCAACTGTACCTG3 (150 nM) og antisense 5’TCGTGGAATGTTACGAGCAG3 (150 nM). En 116 bp fragment blev produceret. Den sammenlignende ct metode blev anvendt til at beregne relative mængder af hTERT mRNA [25]. Hver QRT-PCR-reaktion blev udført i tre eksemplarer.

Påvisning af ROS Produktion af DCF-DA og Electron Spin Resonance Spectroscopy

For ROS påvisning ved hjælp af DCF-DA, MTBITC-eksponerede celler blev høstet, resuspenderet i frisk dyrkningsmedium og omgående inkuberet med DCF-DA ved en koncentration på 5 nM i 15 minutter. ved 37 ° C i mørke. Derefter blev DCF fluorescens målt med en FACSCalibur.

I ROS påvisning ved elektron-resonans (ESR) spektroskopi den høje celle permeable centrifugering sonde 1-hydroxy-3-methoxy-carbonyl-2,2,5,5 -tetramethylpyrolidine hydrochlorid (CMH, Noxygen Science Transfer Diagnostics GmbH, Elzach, Tyskland) og elektron spin resonans (ESR) spektroskopet E-Scan udstyret med temperatur og gas controller BioIII (Noxygen) blev anvendt. Klæbede voksende celler blev inkuberet i 1 til 6 h med MTBITC, 100 pM menadion eller 0,1% DMSO i dyrkningsmedium. Bagefter blev cellerne vasket en gang med Krebs-HEPES-buffer suppleret med 25 pM deferoxamin (DFO) og 5 uM diethyldithiocarbonate (DETC, Noxygen) og inkuberet med 100 pM CMH spin-sonde i Krebs-HEPES-buffer i 15 minutter ved 37 ° C. Supernatanter blev overført til nye reaktionsrør og holdt på is. ESR-spektre blev målt i 50 pi glaskapillarer. Efter instrument indstilling blev anvendt: mikrobølgeovn frekvens 9.772GHZ og magt 21,120 mW, modtager gain 1.00e + 003, fase 0,20 deg, harmonisk og modificeret amplitude 2,32 G, signal kanal konvertering 10.240 ms, tid konstante 40.960 ms og feje tid 5.24 s. Antallet af scanninger var 5 til 20.

flowcytometri og Deposition af enkeltceller

Enkelte celler (HepG2) blev deponeret i individuelle brønde i 96-brønds plader (Thermo Scientific, Bonn, Tyskland ) under anvendelse af en MoFlo cellesorteringsapparat (Dako, Glostrup, Danmark). Cellerne blev sorteret ved anvendelse af fremad (lav vinkel, FSC) versus sidespredning (90 ° -scatter, SSC) signaler til at skelne mellem levende og døde celler og nedbrudt materiale og området af forward scatter versus impulsbredde at skelne mellem enkelte celler og celler, der er knyttet til hinanden. Ingen celler blev placeret på række 12, og disse pletter blev brugt til 4 PCR positive og 4 negative kontroller, henholdsvis.

Behandling af cellerne med UV-bestråling

De udækkede plader med 96 brønde, der indeholder enkeltceller blev underkastet UV-bestråling i 10 minutter. anvendelse af en UV dekontamineringskammeret. Den UV-kilde var en 30 watt Osram bakteriedræbende lampe (UVC udstrålet effekt 200-280 nm 13,4 W). Effektiviteten af ​​UV-bestråling for at ødelægge dobbeltstrenget DNA blev analyseret ved at amplificere DNA-fragmenter med fire størrelser fra 143 bp til 1337 bp. Salg

mtDNA Amplification

Amplifikation af mtDNA fra behandlede og ubehandlede celler blev udført i plader med 96 brønde som modtaget fra enkelt celle deposition teknik. Til hver brønd 5 pi PCR Master-blanding indeholdende 1 × Advantage 2 PCR-buffer (Clontech, BD Biosciences, CA, USA), 0,1 pi Advantage 2 polymerase mix (Clontech), 200 uM af hver dNTP (Bioline, Luckenwalde, Tyskland) og 0,4 uM hver primer (F14816 /R16152, F16197 /R00293, F00314 /R00639 og F08294 /R08436, jf tabel 1) (Biomers, Ulm, Tyskland) tilsat. PCR-amplifikation blev udført på en PTC 200 thermocycler (MJ Research, Waltham, MA, USA) med følgende termiske cykliseringsbetingelser: 95 ° C i 2 min, 38 cyklusser af 95 ° C i 15 s, 56 ° C i 30 s , 72 ° C i 90 s, efterfulgt af en endelig ekstension fase ved 72 ° C i 10 min. Hele reaktionen blev visualiseret under standardiserede betingelser på en 2% agarosegel (50 ml agarose med 4 pi SybrSafe (Invitrogen Carlsbad, CA), elektroforese i 25 minutter ved 60 V, efterfulgt af udsættelse for UV-lys i 160 msek).

Dataanalyse

Resultater blev analyseret ved hjælp af Graphpad Prism 5 software (GraphPad software Inc., LaJolla, USA). Statistisk signifikans (p ≤ 0,05, p≤0.01) af MTBITC behandling på de undersøgte parametre i HCC celler blev beregnet mod opløsningsmidlet kontrol, 0,1% DMSO. For at bestemme betydningen af ​​MAPK specifik inhibering på de undersøgte endepunkter blev MTBITC-behandlede prøver beregnet over for den respektive inhibitor-behandlede modstykke under anvendelse af envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni-metode.

Resultater Salg

nDNA er beskadiget af MTBITC der udløser Transient hTERT mRNA ekspression

Vi først undersøgt skaderne af nDNA i HepG2 celler efter 25 uM MTBITC eksponering. Efter 1 time blev nDNA af MTBITC-behandlede celler væsentligt beskadiget, som bestemt ved comet assay (figur 1a). Dette blev korreleret med en hurtig respons af celler i form af forbigående hTERT-mRNA-ekspression som detekteret inden 1 time (figur 1b). hTERT mRNA-ekspression var tilbage til kontrolniveauer efter 6 timers udsættelse for MTBITC (figur 1b) og celle eksponering for ITC i mere end 6 timer resulterede i en væsentlig undertrykkelse af hTERT mRNA-transkription, hvilket også kunne observeres ved langvarig lav dosis eksponering (figure1b).

a) Celler blev eksponeret for 25 uM MTBITC eller opløsningsmidlet kontrol (0,1% DMSO) i 1 time og efterfølgende analyseret for deres DNA-beskadigelse ved hjælp af comet assay. Den% hale DNA blev anvendt for skader kvantificering. Søjler er gennemsnit ± SD, n = 3. Celler udsat for 100 uM benzo (a) pyren (B (a) P) i 1 time blev anvendt som positiv kontrol. b) Ekspression af fuldlængde hTERT mRNA efter udsættelse for MTBITC eller opløsningsmiddel kontrol i 1 time til 96 timer blev analyseret ved RT-PCR. PBDG blev anvendt i alle eksperimenter som henvisning gen. mRNA-ekspression blev beregnet i forhold til opløsningsmidlet kontrol; barer er gennemsnit ± SD (n = 3).

MTBITC Behandling Årsager Aktivering af MAPK Pathway

MAPK signaltransduktionsvej er fortrinsvis aktiveres som reaktion på miljømæssige og genotoksiske belastninger og indtager en central rolle i celleproliferation og overlevelse [26]. Vækst værdiforringelse af ITC er blevet tilskrevet aktiveringen af ​​MAPK-vejen i forskellige celle, inden [27]. Vi har derfor næste undersøgt respons MAPK i lever kræftceller til MTBTIC. Vi observerede, MTBITC behandling i alle tre cellelinier resulterede i betydelig aktivering af ERK1 /2 ved Thr202 /Tyr204, JNK ved Tyr183 /Tyr185 og P38 ved Thr180 /Tyr182 ved phosphorylering på en tids- (figur 2a), men også koncentrationsafhængig måde ( figur 2b). Interessant nok i raske humane hepatocytter blottet for telomerase, denne vej blev også aktiveret (figur 2c). For derefter at afgøre, om denne aktivering reflekteres af celle svækkelse, vi næste rettet levedygtigheden af ​​normale primære humane hepatocytter. Som vist i figur 2d, selv efter 72 h udsættelse for MTBITC, kunne påvises nogen negativ virkning, som bestemt ved mikroskopisk observation af cellemorfologi.

Celler blev lyseret, og totalt lysat underkastes immunblotting. a) HCC-celler blev behandlet med 25 pM MTBITC eller opløsningsmidlet kontrol (0,1% DMSO) for de angivne tidspunkter. HepG2-celler (B) eller humane hepatocytter (c) blev behandlet med MTBITC i 3 timer ved de angivne koncentrationer. Repræsentative blots er vist. Hver Blottet blev probet igen med anti-β-actin-antistof for at sikre lige protein loading. d) Primære normale humane hepatocytter blev ikke påvirket negativt af MTBITC, som tydeligt i repræsentative billeder, taget til fange af lysmikroskopi. SC: opløsningsmiddelkontrol = 0,1% DMSO. +, Positiv kontrol = 0,01% Triton X-100. Bar = 100 um. Alle paneler har samme forstørrelse.

Rolle MAPK i MTBITC-medieret Telomerase forordning

For at bestemme relevansen af ​​den observerede MAPK aktivering i telomerase modulation samt celleproliferation, vi forbehandlede HepG2 celler med JNK-inhibitor (SP600125 eller JNK-inhibitor V), P38 inhibitor (SB203580 eller SB202190), ERK1 /2-inhibitor (U0126 eller PB98059) eller en kombination, efterfulgt af behandling med MTBITC. Aktivering af MAPK gennem MTBITC blev næsten fuldstændig afskaffet ved præinkubation med inhibitorerne, som afbildet i figur 3a. Forbehandling af HepG2-celler med enten af ​​inhibitorerne – bortset JNK inhibitor V – undladt at påvirke MTBITC-udløst hTERT-mRNA-ekspression observeret efter 1 h signifikant (figur 3B). Interessant, en kombination af alle tre MAPK-inhibitorer (SP600125, SB203580, U0126 eller SB202190, JNK inhibitor V og U0126) reducerede MTBITC-udløst hTERT mRNA-ekspression elevation (figur 3b). Dette kan meget vel skyldes inhibering af JNK-aktivering, som enten forbehandling med SP600125 eller JNK-inhibitor V alene afskaffet hTERT mRNA-niveau enhancement (figur 3b). Endelig har vi bestemt relevansen af ​​MAPK for MTBITC-induceret telomeraseenzymaktivitet undertrykkelse. En koncentrationsafhængig nedregulering af enzymaktivitet var allerede tydelig efter 3 h udsættelse for MTBITC som vurderet af TRAP-ELISA (figur 3c). Dette kunne tydeligt afskaffet ved MAPK blokering. Desuden ved selektivt at blokere MAPK, kunne vi vise, at p38 samt ERK1 /2, men ikke JNK var i det mindste delvist ansvarlig for telomerase enzymhæmning af MTBITC som vurderet efter 24 timers eksponering (figur 3d).

For specifik inhibering af p38-aktivering, 10 uM SB203580 eller 20 uM SB202190, af JNK-aktivering, 5 uM SP600125 eller 20 uM JNK inhibitor V blev anvendt henholdsvis. 10 uM U0126 eller 40 pM PB98059 blev anvendt til ERK1 /2-inhibering. Celler blev forbehandlet med inhibitorerne og efterfølgende eksponering for MTBITC eller opløsningsmidlet kontrol (0,1% DMSO). a) Immunblotanalyse viser effektiv inhibering af målproteiner. β-actin blev anvendt som ladningskontrol b) forbehandlet celler blev analyseret for fuld længde hTERT mRNA-ekspression efter 1 time udsat for 25 uM MTBITC. PBDG blev anvendt som reference-genet. mRNA-ekspression blev beregnet i forhold til den tilsvarende opløsningsmiddel kontrol (n = 3). C + D) Pre-behandlede celler blev analyseret for telomeraseenzymaktivitet efter 3 h (D) eller 24 timer (e) MTBITC eksponering ved anvendelse af TRAP-ELISA-assay. Telomeraseaktivitet blev beregnet i forhold til den tilsvarende kontrol opløsningsmiddel; barer er gennemsnit ± SEM (n = 3). Hæmmere 3 ×:. Kombination af SB203580, SP600125 og U0126

Rolle MAPK i MTBITC-medieret vækst Dæmpning

I et næste skridt, vi søgte at afgøre, om MAPK også kunne redegøre for MTBITC-induceret cellecyklusstop i HepG2-celler. Men alle inhibitorer som særskilt komponent eller i kombination undladt at beskytte cellerne fra MTBITC-medieret G2 /M halt (figur 4a). Denne observation blev bekræftet ved anvendelse af en kombination af den anden inhibitor sæt (data ikke vist). Når man studerer apoptose ved subG1 DNA indholdsanalyse, kunne der ikke relevans MAPK for MTBITC-udløst celledød ses (figur 4b). kvantificering af apoptose i form af den mere specifikke caspase 3/7 spaltning afslørede imidlertid, at blokering af alle tre MAPK signifikant ophævet MTBITC-udløst celledød. Dette kunne tilskrives ERK1 /2-signalering, som inhibering af ERK1 /2-aktivering kraftigt afskaffet apoptose (figur 4b). For yderligere at etablere foreningen af ​​apoptose og DNA-skader med MAPK signalering, vi kvantificeret effekten af ​​MAPK inhibitorer på MTBITC-inducerede DNA-strengbrud. Da både blev HCC celler samt sunde hepatocytter aktiveres i deres MAPK signalering ved MTBITC, men kun kræftcellerne blev indsendt til apoptose, vi rejste spørgsmålet, om der kunne være en forskel i mængden af ​​DNA-skader mellem den normale og maligne celler. Som vist i figur 4c, DNA-strengbrud var meget lavere hos raske hepatocyes sammenlignet med HepG2-celler. Når celler blev derefter forbehandlet med en kombination af alle tre inhibitorer, blev skaden reduceres for at kontrollere niveauet (figur 4c).

forbehandlet HepG2 celler blev udsat for 25 uM MTBITC eller 0,1% DMSO i 24 h og derefter forberedt på en) DNA-indhold og b) subG1 DNA indholdsanalyse (markør for apoptose) ved anvendelse af flowcytometri og PI-farvning af DNA billederne skildrer repræsentative DNA-indhold histogrammer af HepG2-celler. c) Caspase 3/7 spaltning blev anvendt som specifik parameter for apoptose induktion. Caspase 3/7 aktivitet blev beregnet i forhold til den tilsvarende kontrol opløsningsmiddel; barer er gennemsnit ± SD (n = 3). d) DNA-skader i HepG2-celler eller primære humane hepatocytter blev vurderet efter 24 timers eksponering for MTBITC hjælp af comet assay. At sammenligne mellem de to celletyper blev DNA beskadigelse beregnet i forhold til opløsningsmidlet kontrol (SC, 0,1% DMSO). Barer er gennemsnit ± SD, n = 2. Inhibitors 3 ×:. Kombination af SB203580, SP600125 og U0126

ROS er ikke involveret i MTBITC-medieret Telomerase Modulation eller Growth Nedskrivninger

Nogle andre naturlige forbindelser er blevet foreslået for nylig at mægle telomerase undertrykkelse i kræftceller via ROS produktion [28], [29]. Desuden er en række af studier, der undersøger ITC i forbindelse med cancercellevækst suppression foreslået ROS produktion som opstrøms begivenhed for MAPK-aktivering og celledød og /eller vækststandsning [15]. I forbindelse med vores undersøgelse, vi derfor forsøgt at finde ud af, om ROS var involveret i telomerase modulering af MTBITC eller kunne virke som celledød effektorer. Intracellulær ROS i kontrol- og MTBITC-behandlede celler blev først vurderet ved flowcytometri efter farvning af vedhængende voksende HepG2-celler med H

2DCFDA. Inden for en times MTBITC-eksponering, kunne påvises nogen ændring i ROS niveau (data ikke vist).