PLoS ONE: Fenton Reaction Provokeret Kræft i vildtype Rotter rekapitulerer Genomisk Ændringer Observeret i Human Cancer

Abstrakt

Iron overbelastning er blevet forbundet med carcinogenese hos mennesker. Intraperitoneal indgivelse af ferri nitrilotriacetat initierer en Fenton-reaktionen i renale proksimale tubuli af gnavere, der i sidste ende fører til en høj forekomst af nyrecellecancer (RCC) efter gentagne behandlinger. Vi udførte høj opløsning microarray komparativ genomisk hybridisering til at identificere karakteristika i de genomiske profiler af denne oxidative stress-induceret rotte RCCS. Resultaterne afslørede omfattende store genomiske ændringer med en præference for deletioner. Sletninger og amplifikationer var talrige og undertiden fragmenteret, hvilket viser, at en Fenton reaktion er en årsag til sådanne genomiske forandringer

in vivo

. Frekvens plotte viste, at to af de mest almindeligt ændret loci svarede til en

CDKN2A

/

2b

sletning og en

Met

forstærkning. Tumor størrelser blev proportionalt forbundet med

Met

udtryk og /eller forstærkning, og klyngedannelse analyse bekræftede vores resultater. Derudover har vi udviklet en procedure for at sammenligne hele genomiske mønstre af kopi nummer ændringer blandt forskellige arter ud fra kromosomal syntenic forhold. Mønstre af rotte RCCS viste den stærkeste lighed med de menneskelige RCCS blandt fem typer af humane kræftformer, efterfulgt af menneskelig malignt mesotheliom, en jernophobning-associeret cancer. Derfor er en jern-afhængig Fenton kemisk reaktion forårsager store genomiske ændringer under carcinogenese, hvilket kan resultere i forskellige genomiske profiler. Baseret på egenskaberne af omfattende genom ændringer i human cancer, vores resultater tyder på, at denne kemiske reaktion kan spille en vigtig rolle under human carcinogenese

Henvisning:. Akatsuka S, Yamashita Y, Ohara H, Liu YT, Izumiya M Abe K, et al. (2012) Fenton Reaction Induceret Kræft i vildtype Rotter rekapitulerer Genomisk Ændringer Observeret i Human Cancer. PLoS ONE 7 (8): e43403. doi: 10,1371 /journal.pone.0043403

Redaktør: Kamaleshwar Singh, Texas Tech University, USA

Modtaget: 2. marts, 2012; Accepteret: 19 Juli 2012; Udgivet: August 29, 2012 |

Copyright: © Akatsuka et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Prinsesse Takamatsu Cancer Research Fund (10-24213); en Grant-in-Aid for Cancer Research fra Ministeriet for sundhed, arbejde og velfærd Japan; og en Grant-in Aid fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er en sygdom af akkumulerede genomiske forandringer, formentlig forårsaget af en systematisk proces, cellulær skade og reparation. Sygdomsfremkaldende midler til carcinogenese er mange, herunder γ-stråling, ultraviolet stråling, inflammation, kemikalier og jernophobning [1]. Genomiske data for en række forskellige humane cancere i øjeblikket analyseres enten med matrix-baseret komparativ genomisk hybridisering (CGH) [2] eller næste generation sekventering [3], [4]. Disse projekter udføres for at finde sygdomsfremkaldende genmutationer, der vil føre til identificering af nye kemikalier eller antistoffer rettet for interaktionerne mellem ansvarlige signalering molekyler. forventes, at disse bestræbelser på at resultere i udviklingen af ​​effektive lægemidler. Men kræft forebyggelse i hverdagen er lige så vigtig som terapi.

I den foreliggende undersøgelse, vi forsøgt at løse roller jern-medieret oxidativ stress under carcinogenese hjælp vifte-baserede CGH. Oxidativ stress konstitutivt forårsaget af metabolismen af ​​molekylært oxygen [5], men er primært reguleret af forskellige antioxidantsystemer. Men i en række forskellige patologiske tilstande, oxidativ stress belastninger overstiger antioxidant kapacitet [6]. Jern er den mest rigelige tungmetal i pattedyr, såsom gnavere og mennesker. Henviser jern er vigtigt for oxygen transport som en bestanddel af hæmoglobin, er overskydende jern blevet forbundet med carcinogenese [7], [8], formentlig gennem en Fenton reaktionen [9]. Ioniske former af jern er knap opløselige ved neutralt pH, men ferri nitrilotriacetat (Fe-NTA), en jern-chelat, er opløselig ved pH 7,4 og er en effektiv katalytisk agent for Fenton reaktionen [10]. I 1980’erne, vores gruppe fastslået, at gentagne intraperitoneale administrationer af Fe-NTA fremkalde en høj forekomst af renalcellecarcinom (RCC) hos gnavere [11], [12]. Senere viste vi, at den renale skade opstår gennem en Fenton-reaktion med en række hydroxylradikalscavengers-medieret kemiske produkter, såsom 8-hydroxy-2′-deoxyguanosin [13], [14] og 4-hydroxy-nonenal [15] , [16]. Det er fastslået, at en jern overbelastning i mange patologiske tilstande er forbundet med tilstedeværelsen af ​​katalytisk jern [17], [18].

Derfor ved at evaluere hele genomet af RCCS, vi kunne finde et generelt princip for genomiske forandringer under oxidativt-stressede forhold. Vi rapporteret en

CDKN2A /2b

sletning brug mikrosatellit analyse i denne model [19]. I denne undersøgelse vurderede vi hele genomet af Fe-NTA-inducerede rotte RCCS og deres cellelinier under anvendelse matrixbaserede CGHs. Desuden forvandlede vi data i en menneskelige genom gennem kromosomal syntenic forhold og analyseret foreningen.

Resultater

Genome-wide Views of DNA Copy Number Ændringer i Fe-NTA-induceret Rat RCCS

Femten rotte RCC DNA-prøver, som omfattede 13 primære tumor prøver og 2 cellelinje prøver, blev hybridiseret på Agilent oligonucleotid microarrays til CGH med 181.978 genomisk loci (GEO tiltrædelse: GSE36101). Sammenligning af forskellige matrixbaserede CGH-profiler på en kvantitativ måde er vanskelig. Et skift i den gennemsnitlige kopital er forårsaget af polyploidi og forurening af normale celler. Derfor har vi udviklet en statistisk metode, der anser disse faktorer for at estimere den kromosomale kopi nummer (Metoder S1). I dette papir, er matrix-baserede CGH profil data analyser baseret på de estimerede antal kopier ved hjælp af denne metode.

Array-baserede CGH profilering afslørede, at genomer af Fe-NTA-induceret rotte RCCS er ofte komplekse og har mange omfattende kromosomale ændringer (fig. 1A og S1). En hel genom frekvensanalyse med 15 prøver identificerede tilbagevendende regioner af en kopi nummer aberration i Fe-NTA-inducerede RCCS (fig. 1B). Kopier nummer afvigelser blev bestemt baseret på fordelingen af ​​de log2 forholdet værdier, der blev genberegnet med den estimerede antal kopier for et sæt af 13 primære tumorer og 2 cellelinjer (fig. S2). I denne fordeling, blev de tærskler, der repræsenterede gevinst og tab valgt på ± 0,377. En tærskel repræsenterer amplifikation blev valgt på 0,811 hvorimod en homozygot deletion (fuldstændigt tab) fik den position, hvor kopitallet blev estimeret som 0. Det mest karakteristiske globale funktion udækket af frekvensen analysen var en prædisposition til at miste en udstrakt bred region af kromosomer, især for kromosomer 3, 5, 6, 8, 9, 14, 15, 17 og 20. Den anden funktion var en hyppig forstærkning over en lang pericentromeric region i kromosom 4.

(a) repræsentative matrixbaserede CGH profiler fra to RCC tumorer. De røde linjer viser log2 forhold mellem den estimerede kopiantal over udledte cancer ploidi versus den genomiske position for alle CGH microarray prober. (B) frekvensfordelingen af ​​kopital aberrationer i hele rotte-genomet. De relative frekvenser af forstærkning (mørkerød), forstærkning (tomat), tab (grøn gul) og homozygot deletion (mørkegrøn) inden for 13 RCC tumorer og to RCC cellelinjer plottes ved hver genomisk position. To cancer-relaterede loci,

Met

CDKN2A

, der blev hyppigst ramt af kopi nummer aberration er angivet med pilene.

Hyppig Kromosomal Tab i Rat kromosom 5 og Homozygot Sletning på

CDKN2A /2b

Locus

kromosom 5 undergik en omfattende tab i kopi nummer, ikke er mindre end i andre kromosomer (fx kromosomer 6, 8 og 20 ) (fig. 1B). Da det vedrører omfattende tab, blev homozygote sletninger hyppigst observeret ved den

CDKN2A /2b

locus på kromosom 5 (fig. 2A). Denne almindeligt slettet region inkluderet to loci (

CDKN2A

Cdkn2b

) for tre forskellige tumorsuppressorgener (

p16

p19

i

CDKN2A

;

p15

i

Cdkn2b

) (fig 2B).. Nedlukning af

p16 /p19

p15

mRNA-ekspression blev bekræftet i de prøver, der indeholdt en homozygot deletion på

CDKN2A /2b

locus (fig. 2C og 2D) . I prøver med et hemizygote sletning på

CDKN2A

locus (dvs. FB32-4, FB28-7),

p16

p19

udtryk blev nedreguleret, formentlig fordi promotorområder af de resterende alleler blev methyleret. Men nogle af prøverne med enten et hemizygote eller ingen sletning (f.eks FB14-3, BF51-1, FB14-6, FB30-5 og FB33-7) viste en markant overekspression af

p16

P19

.

(A) søjlediagram repræsenterer regionerne kromosomal tab (grøn gul) og homozygot deletion (mørkegrøn) langs kromosom 5 for 13 RCC tumorer og to RCC cellelinjer. Den lodrette røde linje på baggrund angiver positionen af ​​

CDKN2A

locus. (B) Forstørret visning af søjlediagram centreret på

CDKN2A /2b

loci. De genomiske regioner af alle de RefSeq gener indgår i det viste område af kromosomet er afbildet som lodrette søjler på baggrunden. (C) Expression analyse af

CDKN2A Hotel (

p16

INK4a

og

P19

ARF

) i 13 RCC tumorer og to RCC cellelinjer, der bruger ægte -tid PCR med specifikke primerpar for hver forskellig transkript. Værdierne på

y

aksen angiver relative mRNA-ekspression niveau i forhold til et gennemsnit på dem i normale nyrer af tre kontrol rotter. (D) Expression analyse af

Cdkn2b Hotel (

p15

Ink4b

) i 13 RCC tumorer og to RCC cellelinier ved real-time PCR. Værdierne på

y

aksen angiver relative mRNA-ekspression niveau i forhold til et gennemsnit på dem i normale nyrer af tre kontrol rotter.

Hyppige Amplifikationer Over den Pericentromeric af kromosom 4 og forstærkning på

Met

Locus

over en lang del af det pericentromeric region i kromosom 4 blev hyppig kopi nummer forstærkning og forstærkning observeret (fig. 1B). Genomisk amplifikation og genekspression i de tilsvarende områder af kromosom 4 var hovedsagelig proportional (fig. S3). En bar plot af den forstærkede område langs pericentromeric region i kromosom 4 viste, at

Met

oncogen bosat i den mest almindelige overlappende genomisk sektion (fig. 3A). Den mest overlappende sektion med en længde på ca. 222 kb bestod af en amplificeret region i 11/15 prøver og indeholdt kun én RefSeq-kurateret gen (

Met

) (fig. 3B). Et større end 5 gange stigning i

Met

mRNA-ekspression blev observeret i 6 prøver blandt de 9 tumorer, som indeholdt et genomisk amplifikation af

Met

(fig. 3C).

(a) Søjlediagrammet viser amplifikationsprodukterne regioner langs en 65 Mb pericentrometic region af kromosom 4 i 13 RCC-tumorer og to RCC-cellelinier. Fire kvaliteter af forstærkning er angivet med bar farveovergange; jo mørkere rød, jo større amplitude. (B) en forstørrelse af søjlediagram ovenfor viser nærheden af ​​mest overlappende område. De genomiske regioner af alle de RefSeq gener indgår i det viste område af kromosomet er afbildet som lodrette streger i baggrunden. (C) Expression analyse af

Met

i 13 RCC tumorer og to RCC cellelinier ved real-time PCR. Værdierne på

y

aksen angiver relative mRNA-ekspression niveau i forhold til et gennemsnit på dem i normale nyrer af tre kontrol rotter.

Kollektivt, om kromosomafvigelser ved disse to kræft -relaterede loci, hver undersøgte carcinom herunder de to cellelinjer indeholdt enten

Met

forstærkning eller

CDKN2A /2b

sletning (tabel 1, fig. 2B og 3B). Andre almindelige genetiske ændringer er opsummeret i tabel S1 (20 fjernede gener, fælles på 2-4 RCC tumorer) og tabel S2 (340 opformerede gener, fælles i 2-9 RCC tumorer). Blandt dem,

Zbtb38

forstærkning blev bekræftet for overekspression (fig. S4).

Tumor Størrelse af Fe-NTA-induceret RCCS reguleres af genetiske træk

Vi undersøgt sammenhængen mellem genetiske ændringer og forskellige RCC træk herunder opsummeret i tabel 1. Blandt alle de relationer, undersøgte,

Met

udtryk og tumorstørrelse blev proportionalt forbundet (fig. 4A). Endvidere en hierarkisk klyngedannelse af tumorer baseret på hele mønstre af kromosomale forandringer afslørede, at en gruppe af store tumorer (dvs. FB7-7, FB30-5 og FB33-7) svarede til et særskilt klynge (fig. 4B). Derfor blev en tumor træk, størrelse på det tidspunkt tumoren var klinisk åbenlys, der er forbundet med hele systemet-baserede CGH-profiler.

(A)

Met

udtryk signifikant korreleret med tumorstørrelse . Pearsons korrelationskoefficient (r) og den tilsvarende P-værdi er skrevet på grunden området. (B) Hierarkisk klyngedannelse af RCC tumorer baseret på hele genomet mønstre af kopi nummer ændringer. De store størrelse tumorer udgør en særskilt klynge.

Sammenligning af Copy Number til ændringer Profiler i Cancer genomer mellem rotter og mennesker

For at bestemme det generelle princip om store genomiske forandringer i kræft tværs pattedyrarter, vi sammenlignet kræft genomer af rotter og mennesker som et helt spektrum af kromosomale forandringer. Først, vi forvandlede rotte-array-baserede CGH-profiler på menneskelige kromosomer ifølge en synteny mellem de to arter. Derefter sammenlignede vi hele mønstre baseret på estimerede kopi numre ved hjælp flerdimensionale data analysemetoder. Vi fandt, at Fe-NTA-induceret rotte RCC var mest ligner humane RCCS, efterfulgt af human malignt mesotheliom (fig. 5A og 5B).

(A) Farven plot repræsenterer en lighedsmatrix tværs rotte RCCS og forskellige humane cancere. RRCC, rotte nyrecellecarcinom; hPDAC, menneske pancreas duktalt adenokarcinom; hTALL, human T-celle akut lymfoblastisk leukæmi; hGBM, menneskelige glioblastom multiforme; hRCC, human renalcellecarcinom. (B) Numerisk resumé af ligheden matrix. Tallet i hver firkant angiver en gennemsnitlig værdi af lighed indeks (defineret mellem -1000 og 1000). Se materialer og metoder afsnit.

Diskussion

I denne undersøgelse rapporterer vi for første gang analyser af hele data fra matrix-baserede CGH anvendt på en Fenton kemi-induceret carcinogenese i en rotte nyre model [20]. Vi fandt, at oxidativ stress forårsager omfattende genomiske ændringer i cancer-genomet ved kromosomal niveau (fig. 1A). Det er velkendt, at et flertal af humane maligne solide tumorer besidder gevinster eller tab i talrige kromosomer [21], [22], og forstærkning kan være en egnet mål for cancer kemoterapi. Under den kræftfremkaldende proces af sådanne tumorer, er kromosomal ustabilitet menes at bidrage som en drivende faktor [23]. Blandt vildtype gnaver carcinogenese modeller, dog rapporterer nogle modeller med primære tumor prøver omfattende genetiske ændringer på grund af kromosomal ustabilitet [24], [25]. Strålingsinduceret murine malignt lymfom [26] og murine lunge adenocarcinom induceret af 4- (methylnitrosamino) -1- (3-pyridyl) -1-butanon, kræftfremkaldende stede i tobaksrøg [27], viste lidt flere grove kromosomafvigelser end de tilsvarende spontane tumorer, omend lav opløsning i rapporten (bakteriel kunstigt kromosom [BAC] vifte af ~6,500). Kendsgerningerne der styrer rotter udviser ingen RCCS [11], [12] og Fe-NTA-induceret rotte RCC model udviser en ækvivalens til menneskelige kræftformer i genomiske ændringer på kromosomal niveau kraftigt støtte tanken om, at denne carcinogenese model efterligner en faktiske kræftfremkaldende proces i disse mennesker, der mangler stærke kræft modtagelighed træk.

Omvendt mus med flere gensplejsede cancerassocierede gener viser genetisk ændring af denne art [28]. Vi mener, at disse eksperimenter svarer til en etableret mutator fænotype [29] og dermed til den kræftfremkaldende proces i mennesker, der har stærke kræft modtagelighed egenskaber såsom Li-Fraumeni syndrom (

p53

) [30] eller melanom Slægter (

p16

) [31]. Som en arvelig rotte RCC model, vi analyserede også RCCS i Eker rotter, der ikke udviser aggressive egenskaber, såsom metastaser [32], [33], [34]. Vi observerede, at disse RCCS viste null eller subtile genetiske ændringer (Fig. S5). Derfor oxidativ stress, herunder induceret på grund af overskydende jern, kunne være en af ​​årsagerne til den menneskelige nyre. Faktisk har mange epidemiologiske studier associeret jern- og stålindustri arbejdere med en øget RCC risiko [35].

En frekvens plot analyse viste to bemærkelsesværdige træk. Først viste kromosomafvigelser en præference for tab mod ploidi af hver kræft genom. Overvejende blev aberration repræsenteret af en deletion på enten en hel kromosomalt niveau (monosomi) eller på et segmentær niveau (fig. 1B). Den mest almindelige mål for tab var den

CDKN2A /2b

locus. Overvægten af ​​tab i profilen af ​​kromosomale ændringer kan tilskrives den tidlige fase af carcinogenese. Vi har tidligere vist, at celler med et hemizygote sletning ved

CDKN2A

vises så tidligt som et par uger efter initiering en Fe-NTA administration [36].

Vores nuværende analyse viste, at monoallelisk tab af kromosom 5 i sin helhed eller i en tilsvarende bred region er den største første begivenhed. Faktisk fandt vi kun ét tilfælde (6,7%) af et monoallelisk tab af en ekstremt smalt område (~350 kilobaser;. Figur 2A og 2B). Fe-NTA katalyserer dannelsen af ​​hydroxylradikaler gennem en Fenton reaktionen specifikt i lumina af renale proksimale tubuli, hvilket fører til degeneration og nekrose /apoptose af disse celler [37], [38]. Fordi nyrerne er en vitalt organ, der udfører urinstof udskillelse, reabsorption af værdifulde molekyler samt ionisk homeostase vedligeholdelse, regenerering fra de resterende rørformede celler intenst fremmes. Under kronisk oxidativ stress ved gentagne Fe-NTA administrationer, ville denne degeneration og regeneration proces fortsætte i måneder til år, hvilket øger risikoen for mitotiske begivenheder samtidigt med reparation af oxidativ DNA-beskadigelse. Vi mener, at denne oxidative stress forårsager unormal DNA-replikation og kromosomal missegregation, hvilket fører til fremkomsten af ​​aneuploide celler. Overraskende denne serie af begivenheder synes at forekomme i måneder, hvilket fører til en høj forekomst (-90%) af RCC i rotter inden for to år. Aneuploid celler sædvanligvis udviser fænotyper konsistente med øget energibehov og proteotoxic stress. Dog kan aneuploidi fremme tumorigenese under følgende to hypotetiske mekanismer: 1) aneuploidi kan forårsage en proliferativ fordel gennem tab af G1 /S overgang kontrol under betingelser, hvor normale euploid celler ikke deler [39] og 2) aneuploidi kan gå videre tumorigenese ved fremme genomisk ustabilitet, dermed øge udviklingsevne af tumorer [40]. Den hyppige sletning af

CDKN2A

/

2b

locus er observeret i rotter peritoneal lungehindekræft, en jernophobning-associeret tumor [41], fremkaldt enten af ​​en anden jern forbindelse (ferrisaccharat) [ ,,,0],42] eller ved asbest [43]. Disse fælles træk ved dyremodeller tyder på, at

CDKN2A

/

2b

er en hovedstol mål i jern-medieret carcinogenese. Det samme genetiske ændring er observeret i rotter lungehindekræft fremkaldt af multi-walled carbon nanorør [44], hvor jern involvering endnu ikke er etableret. Vi vil gerne tilføje her for biologiske betydning af vores resultater, at homozygot deletion af

CDKN2A /2B

ofte observeres i human lungehindekræft forbundet med asbest eksponering [45], [46].

Nogle af tumorer med en resterende

CDKN2A

/

2b

allel viste ekstremt høje ekspressionsniveauer af to produkter fra denne locus,

p16 /INK4a

p19 /Arf.

Dette er et aktuelt debatteret emne i human cancer [47]. Der er betydelig dokumentation for, at flere neoplasmer udviser betydelige P16 niveauer i cytoplasma [48]. Dette kan være et mislykket forsøg på at stoppe celledeling i tilfælde af nedstrøms

Rb

dysregulering [49], eller kan repræsentere en alternativ mekanisme til modulering uidentificerede veje. Vores data udviser -50% hemizygote sletning af

Rb

. Det kræver yderligere afklaring med epigenetisk analyse.

Den anden funktion bestemmes ved hjælp af frekvens plot analyse blev en høj forekomst af forstærkning langs et begrænset kromosomal region mod centromeren af ​​kromosom 4, peger på

Met

locus. En region, der spænder over 80 Mb fra centromeren af ​​rotte kromosom 4 er syntenic til humant kromosom 7. Forskellige humane cancere, såsom glioblastoma [50] og ikke-småcellet lungecancer [51], er rapporteret at huse amplifikationer i kromosom 7. Tyrosin kinase MET er en receptor for en hepatocytvækstfaktor og er beliggende opstrøms for

ras

i signaltransduktionsvejen, hvilket tjener som en fordel for celleproliferation [52]. Det er derfor tænkeligt, at tumorstørrelse proportionalt var forbundet med

Met

ekspressionsniveau (fig. 3C og 4A). Fordi vi dissekere dyret, så snart vi genkende tumoren, mener vi, at store og mellemstore tumorer er mere aggressive i naturen. Det er bemærkelsesværdigt, at tumorstørrelse også var relateret til genomet ændring mønster (fig. 4B), og var forbundet med amplifikation og overekspression af

Zbtb38

lokaliseret på kromosom 8 (fig. S4). ZBTB38 (CIBZ) undertrykker transskription af denatureret skabeloner [53], således formentlig regulerer epigenetiske mekanismer. Nedregulering af ZBTB38, et hidtil ukendt substrat af caspase-3, inducerer apoptose [54], og dette gen er lokaliseret i en prostatacancer modtagelighed locus [54]. Disse resultater bekræfter muligheden for tumorklassifikation hjælp matrix-baserede CGH.

Met

opstod evolutionært sent og er unik for pattedyr [52]; Den kunne herved være forbundet med den unikke forstærkning i hele genomet.

Genomisk amplifikation antages at ske via den brud-fusion-bro cyklus [55], [56], [57]. En Fenton reaktionen forårsager dobbeltstrenget DNA brud [10]. Vores resultater viste, at disse amplifikationer bestod af en blanding af bred-range low-level amplificeringer og fragmenterede, smalle højt niveau amplifikationer (fig. 3A). Dette tyder på en mekanisme af positiv feedback til amplifikation, startende fra bred vifte lavt niveau amplifikation. Vi har mistanke om en inddragelse af dobbelt-minutter, og en tilstedeværelse af modtagelige genomisk loci. Denne hypotese kræver yderligere undersøgelse. Det var interessant, at to tumor undertrykkende gener,

CAV1

[58], [59] og

ST7

[60], omgivet

Met

locus (fig. 3B) . Dette kan være grunden til, at

Met

locus var en fællesnævner for de rotte RCCS. Hele exome eller genomsekvensering kan endvidere afsløre nye resultater vedrørende punkt mutation og kromosomal translokation.

Endelig har vi sammenlignet de nuværende rotte resultater med tilsvarende humane tumorer ved at omdanne data baseret på kromosomal synteny (fig. 5A og 5B). Det var forventet, at den genomiske ændring af Fe-NTA-induceret rotte RCC var mest ligner humant RCC formentlig fordi målceller er de samme. Men overraskende, human mesotheliom var det næstmest lignende. Det er nu fastslået, at de fleste menneskelige mesotheliom resultater fra udsættelse for asbest, og den primære patogene proces involveret er jernophobning [8], [61]. Det samme mesodermal oprindelse tubulære celler og mesotelceller kan forårsage ligheden af ​​array-baserede CGH profiler. Endodermal tumor, såsom pancreatisk duktalt adenokarcinom (PDAC), og ektodermal tumor, såsom glioblastoma multiforme (GBM), udviste en signifikant forskel i genomiske profiler.

Som konklusion viste vi, at gentagen Fenton reaktioner i Wild- rotter typen induceret kræft, som er gengivet genomiske forandringer svarende til dem i humane kræftformer, hvilket tyder inddragelse af oxidativt stress som en vigtig faktor i den menneskelige carcinogenese. I denne nyre model, foretrukne ændringer var deletion;

CDKN2A /2B

sletning og

Met

forstærkning var de store mål gen ændringer. En sammenlignende interspecies analyse vil bidrage til at identificere kandidat kræftfremkaldende stoffer.

Materialer og metoder

Fe-NTA-induceret renalcellecarcinom Model

Fe-NTA-induceret carcinogenese eksperimenter var udføres ved hjælp af mandlige F1 hybrid rotter, der var en krydsning mellem Fischer 344 og Brown-Norge indavlede stammer (Charles River, Yokohama, Japan) som tidligere beskrevet [62]. Tretten RCC sager blev anvendt i denne undersøgelse, og den histologiske karakteren af ​​tumor blev bestemt ifølge den modificerede WHO klassificering som vi tidligere beskrevet [62]. Detaljerne er opsummeret i tabel 1. dyr eksperiment udvalg i Graduate School of Medicine, Kyoto University Graduate School of Medicine og Nagoya University Graduate School of Medicine godkendt denne undersøgelse. FRCC001 og FRCC562 ​​cellelinjer blev etableret fra primære Fe-NTA-inducerede RCCS som beskrevet tidligere [63].

Array-baserede Comparative Genomic hybridiseringsprofiler

Genomisk DNA fra tumorer og cellelinjer var isoleret med DNeasy (Qiagen, Valencia, CA). Array-baserede CGH blev udført med en Agilent 185 K rotte-genom CGH microarray (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) som tidligere beskrevet [64]. Tretten primære tumorer og to cellelinjer af Fe-NTA inducerede RCCS blev analyseret ved hjælp af henvisning DNA ekstraheret fra en normal nyre af en rotte fra Brown-Norge imbred stamme. En RCC prøve af en kvindelig Eker rotte [32] blev analyseret under anvendelse henvisning DNA ekstraheret fra en normal nyre fra en mandlig Eker rotte. To yderligere RCC prøver af mandlige Eker rotter blev analyseret med Rat Genome CGH Microarray 105A (G4436A, Agilent Technologies), ved hjælp af henvisning DNA ekstraheret fra en normal lever af en anden mandlig Eker rotte. De normaliserede matrixbaserede CGH data blev behandlet til frembringelse af en segmenteret profil ved cirkulære binære segmentering (CBS) [65] med en ændret signifikansniveau (alfa = 0,0001). Proceduren for databehandling til kopi nummer estimering er detaljeret beskrevet i Methods S1.

Kvantitativ RT-PCR analyse

Samlet RNA blev isoleret ved hjælp ISOGEN reagenser (Nippon Gene Co. Ltd., Tokyo, Japan ) ifølge fabrikantens protokol. cDNA blev syntetiseret under anvendelse af et RNA PCR kit ver. 3,0 (Takara Bio, Shiga, Japan) med vilkårlige primere. Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen, Carlsbad, CA) og en 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) blev anvendt til kvantitativ realtids-PCR-analyse. Rotte β-actin blev anvendt som en intern kontrol. De anvendte primere var som følger:

p16

INK4a

, 5′-aaacgccccgaacactttc-3 ‘og 5′-gttcgaatctgcaccatagga-3’;

P19

Arf

, 5′-accccaagtgagggttttct-3 ‘og 5′-agagctgccactttgacgtt-3’;

p15

Ink4b

, 5′-tccacaggctagagggaaaa-3 ‘og 5′-gtgcaggtgactccttggtt-3’;

Met

, 5′-ttaagcgagagcacgacaaat-3 ‘og 5′-ccacataggaaaacgcactgt-3’;

Zbtb38

, 5′-gtagctgctgctccaaatcc-3 ‘og 5′-cctgttgagggtggtgaact-3′; β-actin, 5’-tgtgttgtccctgtatgcctctg-3 ‘og 5′-atagatgggcacagtgtgggtg-3’.

Menneskelig data

Vi brugte human-array-baserede CGH data pancreas duktalt adenokarcinom (hPDAC) [ ,,,0],28], T-celle akut lymfoblastisk leukæmi (hTALL) [28], glioblastoma (hGBM) [66], mesotheliom cellelinie (HMM) [67] og nyrecellecancer (hRCC) [56]. De Agilent CGH-array-data for de tidligere fire typer af human cancer blev opnået fra NCBI s Gene Expression Omnibus (GEO) hjemmeside (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Geo tal for datasættene tiltrædelsesforhandlinger GSE7599 (hPDAC), GSE7603 (hTALL), GSE9177 (hGBM) og GSE22237 (HMM). Den menneskelige RCC data blev opnået gennem analyser med BAC mikroarrays (4.361 kloner) [68]. Vi definerede lighed indeks mellem de to array-baserede CGH profiler som følger. Først vi beregnet korrelationskoefficienten med log2 forhold mellem det forventede antal kopier over udledte kræft ploidi for de genomiske positioner, der svarer til alle de Agilent 44 K human CGH microarray sonder. Så vi ganges værdien med 1 × 10

3 efter ændring af absolutte værdi i sin kvadratroden.

Støtte oplysninger

figur S1.

Array-CGH profiler fra alle RCCS undersøgt. Røde linjer viser log2 forhold mellem anslået kopi nummer end udledes kræft ploidi versus genomisk position for alle CGH microarray sonder

doi:. 10,1371 /journal.pone.0043403.s001

(PDF)

Figur S2.

Fordeling af log2 forholdsværdier skønnede kopiantal for alle proberne i alle microarrays udføres.

doi: 10,1371 /journal.pone.0043403.s002

(PDF)

Figur S3.

Eksempel på global udtryk ændrer sig i takt med genomisk ændring. Forskelle i genom og transkriptom analyseres mellem to RCCS, FB7-7 have bred vifte forstærkning på kromosom 4 versus FB28-7 have nogen væsentlig genomisk ændring på kromosom 4. (A) Sky blå cirkel plot angiver forholdet mellem estimerede kopiantal baseret på vifte-baserede CGH (FB7-7

vs

FB28-7). Rød cirkel plot indikerer forholdet mellem normaliserede signaler på Affymetrix udtryk microarray (FB7-7

vs

FB28-7). (B) Ekspression forholdstallene midles langs kromosomet. Her rød cirkel plot indikerer gennemsnitlige værdi i 2-Mb vinduer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0043403.s003

(PDF)

Figur S4.

Zbtb38

mRNA-ekspression er påviseligt forbundet med dets kromosomal kopi nummer. (A) Array-CGH profiler af to RCC tumorer huser forstærkning i løbet af

Zbtb38

locus på kromosom 8. (B) Expression analyse af

Zbtb38

på 13 RCC tumorer ved real-time PCR. Værdierne af

y

aksen angiver den relative mRNA-ekspression niveau i forhold til et gennemsnit på dem i normale nyrer af tre kontrol rotter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0043403.s004

(PDF)

figur S5.

Array-CGH profiler af tre arvelig (Eker rotte) renale tumorer.