PLoS ONE: proteomiske Analyse af ovariecancerceller afslører dynamiske processer af protein Sekretion og afgivelse af Extra-Cellular Domains

Abstrakt

Baggrund

Belysning af repertoiret af udskilte og celleoverfladeproteiner af tumorceller er relevant for molekylær diagnostik, tumor billedbehandling og målrettede behandlinger. Vi har karakteriseret celleoverfladen proteomanalyse og proteinerne frigivet i den ekstra-cellulære miljø i tre æggestokkene kræft cellelinjer, CaOV3, OVCAR3 og ES2 og æggestokkene tumorceller beriget fra ascites væske.

Metode og Resultater

for at differentiere proteiner frigives til mediet fra protein bestanddele af medier anvendes til kultur, celler blev dyrket i tilstedeværelsen af ​​[

13C] -mærket lysin. En biotinylering tilgang blev anvendt til at indfange celleoverflade associerede proteiner. Vores generelle eksperimentelle strategi bestod af fraktionering af proteiner fra individuelle rum efterfulgt af proteolytisk spaltning og LC-MS /MS-analyse. I alt blev der nogle 6400 proteiner identificeret med høj tillid på tværs af alle prøver og fraktioner.

Konklusioner og betydning

Protein profiler af de cellelinjer havde betydelig lighed med de profiler af humane ovariecancerceller fra ascitesvæske og inkluderet proteinmarkører vides at være forbundet med kræft i æggestokkene. Proteomisk analyse indikerede omfattende udgydelse fra ekstracellulære domæner af proteiner udtrykt på celleoverfladen, og de bemærkelsesværdigt høje sekretionshastigheder for nogle proteiner (nanogram per million celler pr time). Celleoverfladen og udskilte proteiner identificeret ved dybdegående proteomisk profilering af kræft i æggestokkene celler kan give nye mål for diagnose og behandling

Henvisning:. Faca VM, Ventura AP, Fitzgibbon MP, Pereira-Faca SR, Pitteri SJ, Green AE, et al. (2008) proteomiske Analyse af ovariecancerceller afslører dynamiske processer af protein Sekretion og afgivelse af Extra-Cellular domæner. PLoS ONE 3 (6): e2425. doi: 10,1371 /journal.pone.0002425

Redaktør: Axel Imhof, universitetet i München og Center of Integrated Protein Science, Tyskland

Modtaget: Marts 24, 2008; Accepteret: 8. maj 2008; Udgivet: 18 Jun 2008

Copyright: © 2008 Faca et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af De Kanariske Foundation. Finansieringen organisation havde ikke nogen rolle i indsamling af data eller analyser, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er en af ​​de mest aggressive og dødelige epitelial kræft hos kvinder [1]. Der er fire store histologiske typer af epitelial ovariecancer: serøs, endometrioide, klar celle, og mucinøs, som afviger på både deres kliniske adfærd og molekylære karakteristika. Den serøs undertype er den mest almindeligt diagnosticeret og er ansvarlig for de fleste æggestokkene kræftdødsfald [1]. Øjeblikket er der ingen nøjagtige ikke-invasiv diagnostisk test for kræft i æggestokkene; de fleste patienter er diagnosticeret på et fremskredent stadium [2], præsenterer med metastaser og invasion af bughulen og ascites [3]. Derfor identifikation af proteiner, der rigeligt og overvejende udtrykt i kræft i æggestokkene præsenterer en værdifuld virksomhed og kan give tidlige spor af tilstedeværelsen af ​​kræft i æggestokkene, og /eller tegn på en molekylær undertype, der kunne hjælpe til at styre behandlingen.

identifikation af repertoiret af proteiner, der er spaltet fra celleoverfladen og proteiner, der ellers frigives til det ekstracellulære rum kan bidrage til vores forståelse af tumor adfærd, til identifikation af potentielle diagnostiske markører påvises i cirkulation og til potentiel billeddannelse og terapeutiske mål, der forbliver vises på celleoverfladen. Under metastase af kræft i æggestokkene, produktion af matrix-nedbrydende proteinaser ved tumorceller bidrager til sprængning af celleinteraktioner via en mekanisme kaste af adhæsionsmolekyler. Disse mekanismer er blevet påvist i æggestokkræft kontekst for ALCAM [4] og for epitelial cadherin (CDH1) [5].

Dybdegående, kvantitative proteomics tillader denne afgrænsning af proteiner udtrykkes i tumorceller og i sub- cellulære rum [6]. Adskillige proteom undersøgelser har analyseret æggestokkene tumorvæv [7], [8], cellelinier [9] – [11], ascitesvæske [12] og blod fra patienter med ovariecancer [13], [14]. Men er der stadig behov for systematisk karakterisere og sammenligne sæt proteiner, hvis placeringer gør dem særligt relevant for diagnose og behandling, især proteiner på celleoverfladen eller dem frigives i ekstra-cellulære miljø, og til at bestemme mekanismen og dynamik protein frigivelse i det ekstracellulære rum.

Vi karakteriseret tre æggestokkene adenocarcinom cellelinjer, OVCAR3, CaOV3 og ES2 samt ovariecancerceller beriget fra ascites væske med en grundig proteomisk analyse af hele cellelysater, den celleoverfladen proteomanalyse og proteiner frigives i den ekstra-cellulære rum. Detaljeret undersøgelse af dataene afslørede flere interessante biologiske fænomener, herunder omfattende afgivelse af ekstra-cellulære domæner for proteiner udtrykt på celleoverfladen og høje sekretionshastigheder af en undergruppe af proteiner. Dataene omfatter også en række proteinmarkører vides at være forbundet med kræft i æggestokkene. Den resulterende offentlige datasæt er en ressource for opdagelse af diagnostiske og terapeutiske mål og en rig kilde til information om fordelingen af ​​proteiner mellem cellens indre, celleoverfladen og det ekstracellulære rum.

Metoder

Kultur og isotopiske mærkning af ovariecancerceller

OVCAR3, Caov3 og ES2 celler blev dyrket i DMEM-medium (Invitrogen) indeholdende 0,1% af dialyseret føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen) og

13C-lysin i stedet for regelmæssig lysin, for 7 passager (1:2) ifølge standard SILAC protokollen [15]. Inkorporering af

13C Lys isotop oversteg 90% af det totale protein lysinindhold. Samme batch af celler blev anvendt til ekstraktion celleoverfladeproteiner og til analyse af konditionerede medier og helcellelysat proteiner. De secernerede proteiner blev opnået direkte fra cellen konditionerede medier efter 48 h dyrkning. Celler og debris blev fjernet ved centrifugering ved 5000 x g og filtrering gennem et 0,22 um filter. Totale ekstrakter af celler blev opnået ved sonikering af ca. 2 × 10

7 celler i 1 ml PBS indeholdende detergent octyl-glucosid (OG) (1% vægt /volumen) og proteasehæmmere (komplet proteaseinhibitorcocktail, Roche Diagnostics , Tyskland) efterfulgt af centrifugering ved 20.000 x g.

Tumorceller blev opnået fra 2,2 l ascitesvæske fra en patient med ovariecancer serøs adenocarcinom. Ascites prøver blev indsamlet under en IRB godkendt protokol. Efter centrifugering ved 2000 rpm i 5 minutter blev pelleten af ​​cellerne vasket 3 gange med PBS efterfulgt af centrifugering ved 2000 rpm i 10 min. En gradient af Percoll (30 til 60%) blev anvendt til at berige præparatet i celler afledt fra tumorer og fjerne forurenende mononukleære blodceller. Tumorceller omfattede -80% af levedygtige celler i den resulterende prøve, som vurderet ved mikroskopisk inspektion. Ascites celle konditionerede medier blev opnået efter 24 timers dyrkning i 0,1% bovint serumalbumin (BSA), uden tilsætning af føtalt bovint serum (FBS). Celler og debris blev fjernet ved centrifugering ved 5000 x g og filtrering gennem et 0,22 um filter.

Opsamling af celleoverfladeproteiner

Til isolering celleoverfladeproteiner fra de tre adhærente ovarian cancer cellelinjer, ~ 2 × 10

8 celler blev biotinyleret i dyrkningspladen efter omfattende PBS skylning, med 10 ml af 0,25 mg /ml sulfo-NHS-SS-biotin i PBS ved stuetemperatur (23-24 ° C) i 10 min. Det resterende biotinyleringsreagens blev standset med 10 mM lysin. Berigede tumorceller fra ascites blev vasket tre gange i PBS og biotinyleres i suspension (2,5 x 10

8cells /ml) med 0.48mg /ml sulfo-NHS-SS-biotin i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur (23- 24 ° C). Det resterende biotinyleringsreagens blev standset med 10 mM lysin i både cellelinie og ascites forberedelse. Protein ekstraktion blev udført i en opløsning indeholdende NP 40 detergent 2% (v /v) med celleødelæggelse ved sonikering efterfulgt af centrifugering ved 20.000 x g. Biotinylerede proteiner blev kromatografisk isoleret ved affinitetskromatografi under anvendelse af 1 ml ULTRALINK immobiliseret Neutravidin (Pierce) ifølge producentens instruktion. Proteiner bundet til søjlen blev udvundet ved reduktion af biotinyleringsreagens med 5 ml af en opløsning indeholdende 65 pmol af DTT og 1% octyl-glucosid (OG) detergent i 1 time ved 37 ° C. Eluerede proteiner blev efterfølgende alkyleres med 200 pmol iodacetamid ved stuetemperatur.

Fraktionering af celleekstrakter

Cell overflade, blev konditionerede medier og total ekstrakt fraktioneret ved omvendt fase-kromatografi under anvendelse af henholdsvis 500 ug , 1 mg og 1 mg totalt protein. Alle celleekstrakter blev reduceret og alkyleret med iodacetamid før kromatografi. Adskillelse blev udført i en POROS R1 /10-søjle (Applied Biosystems-4,6 × 50 mm) ved 2,7 ml /min under anvendelse af en lineær gradient af 10 til 80% organisk opløsningsmiddel løbet af 30 minutter løb. Anvendte opløsningsmiddelsystem var: vandigt opløsningsmiddel-5% acentonitrile /95% vand /0,1% af trifluoreddikesyre; organisk opløsningsmiddel-75% acetonitril /15% isopropanol /10% vand /0,095% trifluoreddikesyre. Fraktioner blev opsamlet ved en hastighed på 3 fraktioner /minut.

proteinidentifikation ved LC-MS /MS

Protein fordøjelse og identifikation ved LC-MS /MS blev udført som tidligere beskrevet [16] . Kort beskrevet hver en af ​​de omvendt fase-fraktioner blev individuelt spaltet in-opløsning fordøjelse med trypsin (400 ng /fraktion), og grupperet i 15 til 21 puljer for hver cellelinje og hvert rum (dvs. celleoverfladen, konditionerede medier og opløselig hele cellelysat) baseret på kromatografiske funktioner. Puljer blev individuelt analyseret ved LC-MS /MS i et LTQ-ORBITRAP massespektrometer (Thermo-Finnigan) koblet til et nanoflow kromatografi-system (Eksigent) under anvendelse af en 25 cm søjle (Picofrit 75 um ID, Nye mål, pakket i-hus med MagicC18 harpiks) i løbet en 90 minutters lineær gradient. Erhvervede data automatisk behandlet af Computational Proteomics Analysis System-CPAS [17]. Tandem massespektre blev søgt mod udgave 3.13 af den humane IPI databasen. En fast modifikation af 6.020129 masseenheder blev tilføjet til lysinrester for databasesøgning at tage højde for inkorporering af den tunge lysin isotop. For at estimere betydningen af ​​peptid og protein kampe, vi anvendte værktøj PeptideProphet [18] og ProteinProphet [19]. Identifikationer med en PeptideProphet sandsynlighed større end 0,75 blev udvalgt og indsendt til ProteinProphet. Sidstnævnte udleder et minimalt sæt af proteiner, der forklarer peptid beviser, at tildele en sandsynlighed for hvert protein baseret på de kombinerede peptid sandsynligheder. De afledte protein identifikationer blev filtreret ved en 1% fejlprocent baseret på sandsynligheden for, at det bedste match opnåede ville falde i fordelingen af ​​tilfældige database kampe [20]. Den spektrale optælling metoden [21] blev anvendt til at estimere protein berigelse for hvert rum. Det samlede antal spektrale tæller for hvert protein gruppe output ved ProteinProphet blev anvendt til semikvantitativ analyse. Hver datasæt blev normaliseret ved det samlede antal tællinger i hele eksperimentet. Berigningsfaktoren blev beregnet ved følgende udtryk: [(C

xp /Nf) +1] /(C

te p + 1), hvor C

x repræsenterer tællinger af hvert protein (p) i sub-proteom (sekretion eller celleoverfladen); Nf er normalisering faktor (forelagt i toppen af ​​tabel S1); C

te er tællingerne for det samme protein (p) observeret i den samlede ekstrakt af den respektive celle. Tilføjelsen af ​​en til tællingerne skulle tage hensyn til de proteiner, for hvilke der ikke observation blev foretaget i en af ​​de sub-proteomer og repræsenterer den mindste berigelse faktor for den pågældende protein.

Resultater

proteomiske Analyse af ovariecancerceller

en omfattende proteomprofilen af ​​OVCAR3, CaOV3 og ES2 cellelinier og ovariecancerceller fra ascites fra en patient med serøs ovariecancer blev udført. Den generelle eksperimentelle arbejdsgang bestod af intakt protein fraktionering efterfulgt af massespektrometrisk datafangst ved LC-MS /MS og dataanalyse, som beskrevet i figur 1. Samlet, vi udførte 215 LC-MS /MS sender, som svarer til mere end to millioner MS scanninger.

Total cellelysater.

En omvendt fase-kromatogram repræsenterer fraktionering af intakte proteiner i hele cellelysat af ES2 celler er præsenteret i figur 2. Samlet set analyse gav omkring 3.000 høj tillid protein identifikationer for hver celle population analyseres (Figur 3). Antallet af protein identifikationer fra total celleekstrakter til fælles mellem de tre cellelinier var 1179, og varierede fra 2011 til 2267 i to cellelinier (figur 3A). I gennemsnit blev 655 proteiner identificeres entydigt i én cellelinje. Foruden biologisk heterogenitet kunne en del af variationen i identificerede proteiner mellem cellelinier tilskrives massespektrometrisk undersampling af lav hyppighed proteiner.

Kromatogrammet viser profilen af ​​fraktionering af 1 mg helcellelysat. Vi samlet 18 fraktioner af denne prøve for yderligere identifikation protein ved LC-MS /MS. Den kompleksnedbrydende af prøverne forud LC-MS /MS-analyse af intakt protein fraktionering forbedrer signifikant identifikation af lav hyppighed proteiner [16]. Boksene under den kromatografiske profil angivne fraktionerne analyseres. Det faste mørke linje angiver gradienten anvendes i adskillelsen.

Venn diagrammer viser overlap mellem proteiner identificeret i forskellige cellepopulationer analyseres. A. Identifikation af hele cellelysater af de tre cellelinier analyseret. B. Proteiner identificeret i de tre sub-proteomer (helcellelysat, aircondition medier og celle overflade). C. Proteiner identificeret i tumorceller beriget fra ascites udviser 80% konkordans med proteiner identificeret i de tre æggestokkene kræftceller. D. Antal proteiner identificeret i hvert datasæt. Tabel S1 viser de proteiner identificeret i denne undersøgelse.

Cell overfladeproteiner.

Vi har påberåbt sig en strategi mærkning med lipid uigennemtrængeligt biotin at mærke og fange proteiner eksponeret på celleoverfladen af OVACAR3, CaOV3, ES2 cellelinier og ascites afledt tumorceller (figur 1). Fra cirka 2 × 10

8 celler opnåede vi nogle 500 ug biotinylerede proteiner, der repræsenterer ~1-2% af det totale celleprotein masse. Listen af ​​protein identifikationer er præsenteret i tabel S1.

Proteiner frigivet i mediet.

Cellen linjer blev dyrket i kultur medier, der indeholder tunge isotoper af lysin. Isotopanalyse mærkning af proteiner skulle skelne mellem proteiner frigivet fra voksende celler og proteiner iboende til suppleret medier. Efter 48 timer af kultur, koncentrationen af ​​proteiner steg fra 100 ug /ml til 225 ug /ml i det konditionerede medium af OVCAR3 celler. Fordi -15% af forudsagte humane tryptiske peptider med mere end 6 aminosyrer er identiske mellem humane proteiner og deres bovine modstykker, isotopisk mærkning af celleproteiner forefindes et middel til at differentiere humane proteiner udskilt af dyrkede celler fra bovine proteiner til stede i mediet. For ascites afledte celler, blev mediet opsamlet efter 24 timer af dyrkning i nærvær af 0,1% bovint serumalbumin (BSA). Ca. 1 mg af proteiner fra de konditionerede medier fra cellelinjer og cancerceller fra ascites blev fraktioneret under anvendelse af samme omvendt fase kromatografi måde som anvendt til helcellelysater, og individuelle fraktioner blev analyseret ved LC-MS /MS. For dyrkede cellelinier, proteiner, der udelukkende blev identificeret fra peptider uden mærkede lysinrester og som var identiske i sekvens mellem menneske og kvæg, blev tilskrevet dyrkningsmedium og blev ikke medtaget på listen over proteiner frigives fra cellerne.

den proteomprofilen af ​​ovariecancerceller føre til identifikation af 6,462 proteiner (figur 3D). Vi brugte strenge kriterier for protein identifikationer, overvejer kun gyldige disse proteiner med minimum ProteinProphet sandsynlighed grænse på 0,9. Til denne tærskel, den anslåede falsk identifikation er mindre end 1%. Dette datasæt repræsenterer det mest detaljerede og omfattende proteomisk undersøgelse af cellepopulationer for kræft i æggestokkene. Dybden af ​​analyse og dækning opnås på protein niveau i denne undersøgelse svarer til dybden af ​​analyse for at afdække udtrykte gener på RNA-niveau.

Protein fordeling mellem intracellulære, celleoverflade og ekstracellulære rum

En sammenlignende analyse af proteiner i forskellige rum muliggør vurdering af omfanget af berigelse af proteiner på celleoverfladen og i det ekstracellulære rum. Vi har påberåbt sig den spektrale optælling metoden [21] for at estimere protein berigelse for hvert rum. Efter normalisering til det samlede antal spektrale tællinger, proteiner med større antal tællinger i et rum (celleoverflade eller konditioneret medium) sammenlignet med totale cellelysater blev betragtet beriget i dette rum (figur 3). De tilsvarende berigelsesfaktorer observeret for alle proteiner identificeret er vist i tabel S1.

Proteiner tilskrives de tre cellulære rum blev analyseret med opfindsomheden Pathways Analysis (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com), og med algoritmer til forudsigelse af transmembrane alpha-helix domæner (TMHMM) [22], og for tilstedeværelsen af ​​signalpeptider (SignalP) [23] (figur 4A). Denne analyse viste betydelig overensstemmelse mellem demonstreret placering baseret på vores proteomprofilen og forudsigelser fra database analyse. Denne konkordans var særlig tydeligt for de øverste 10% beriget proteiner, når kontrast til de 10% mindst beriget proteiner (figur 4B og 4C), støtter den strategi udnyttet til at analysere specifikke rum. Det betydelige antal proteiner kommenteret som nukleare eller cytoplasmatisk og til stede blandt de identifikationer i både de konditionerede medier og celleoverflade sub-proteomer er bemærkelsesværdigt. I et vist omfang kan forekomsten af ​​disse overvejende intracellulære proteiner skyldes cellelyse siden omkring 1% af cellerne i kultur blev estimeret til at være døde baseret på trypanblåt-farvning. Der er imidlertid forudgående evidens for forekomsten af ​​cytoplasmatiske proteiner bundet til den ekstracellulære membran, især i cancer [24], [25].

A. Den cellulære lokalisering klassifikation anvendt en kombination af anmærkninger fra Ingenuity Pathway Analysis software og beregningsmæssige forudsigelse af transmembrane alfa-helix (TMHMM) og signalpeptider (SignalP). B. og C. Sammenligning af de øverste 10% beriget proteiner i konditionerede medier eller celleoverfladen (B og C) med den mindste beriget 10% demonstrerer stærk overensstemmelse mellem forudsagt cellulære placering og den specifikke sub-proteom analyseret.

Proteiner udskilt af cellerne, forventes at diffundere gennem væv og indtast cirkulation. Derfor i modsætning til intracellulære proteiner, kan secernerede proteiner være mere tilbøjelige måles i plasma. Vi sammenlignede æggestokkene celleprotein profiles som rum med proteiner, der er anført i Human Plasma Peptid Atlas [26]. Af de samlede 6,462 proteiner identificeret i denne undersøgelse, 2341 (36%) forekom i Human Plasma peptid Atlas (tabel S1). De 100 proteiner, der blev beriget med konditionerede medier for hver af de cellepopulationer analyseres, blev mere stærkt repræsenteret i peptidet Atlas (65 til 78%) sammenlignet med den samlede 36% repræsentation. Disse resultater antyder, at udskilte proteiner er mere rigelige i plasma, at ikke-secernerede proteiner.

Ligheder mellem cellelinier og ascites tumorceller

De tre cellelinier i denne undersøgelse repræsenterer godt karakteriseret

in vitro

modeller for ovariecancer. OVCAR3 og CaOV3 er afledt fra human serøs ovarie adenocarcinom [27], [28] og ES2 er afledt fra klart cellecarcinom [29]. Forskelle i histologi er parallelt med forskelle i protein profiler, som afspejles i clustering analyse ved hjælp af de spektrale tæller som foranstaltninger af protein overflod (Figur S1). Det fremgår af bemærkningerne, at de udskilles og overfladevand sub-proteomer af ES2 er væsentligt forskellige fra dem af de to andre cellelinjer analyseres.

De tumorceller beriget fra ascites vi analyserede blev afledt fra en patient med serøs æggestokkene adenocarcinom. Firs procent af de identificerede proteiner i ascites tumorceller blev også identificeret i en eller flere af de cellelinier (figur 3C). Som angivet i figur S1, mønstre for patientens tumorceller isoleret fra ascites har større lighed med CaOV3 og OVCAR3 end med ES2.

En anden måde at redegøre for ligheder kan stole på observation af proteiner allerede er kendt for at være forbundet med sygdommen. Adskillige kallikreiner har tidligere været forbundet med serøs ovarie adenocarcinom [30]. KLK6, KLK7 og KLK 9 var rigeligt i det konditionerede medium fra ascites afledt tumorceller, OVCAR3 og CaOV3, men ikke i ES2 celle konditionerede medier (tabel S2). Disse observationer antyder igen større ligheder mellem den serøse adeonocarcinoma cellelinier OVCAR3 og CaOV3 og tumorafledte celler samt forskellene i forhold til klare celleafledt ES2 cellelinie.

Der blev observeret en række forskelle mellem ascites afledte celler og cellelinier. Nogle proteiner blev udelukkende detekteret og beriget på overfladen eller i dyrkningsmedier af ascites afledt tumorceller. Disse omfatter proteiner såsom ABP1 (amilorid-følsomme amin oxidase) og MMP7 (og matrix mettaloprotease 7), udskrifter for hvilke der især rigelige i forskellige undertyper af kræft i æggestokkene og andre kodet af mRNA med høje ekspressionsniveauer i specifikke histologiske typer af ovariecancer (tabel S3). At bemærke er, at flere af proteinerne udelukkende beriget med tumorceller fra ascites har meget lav væv ekspression i normalt ovarie [31] (Tabel S3). Disse proteiner muligvis stammer fra leukocytter og mesothelial celler, der ville have været co-oprenset fra ascitesvæsken.

afgivelse af overfladen membranproteiner i den ekstra-cellulære rum

Til støtte for vores eksperimentelle og analytisk tilgang, fandt vi, at en væsentlig andel af proteiner kommenteret som membranproteiner blev identificeret i dyrkningsmedium, der repræsenterer mere end 25% af alle identificerede proteiner som for eksempel i OVCAR3 og ascites afledt tumorceller (figur 4a). Flere af disse proteiner blev signifikant beriget både på celleoverfladen og i dyrkningsmediet (Tabel S4). Analyse af peptider identificeret indikerede, at for det meste blev disse peptider afledt af ekstracellulære domæner af celleoverfladeproteiner som vist i figur 5A, hvilket tyder ektodomæne udgydelse.

A. Identifikation af peptider der spænder over ekstracellulære domæner af transmembrane proteiner påvist i de konditionerede medier, i overensstemmelse med en udgydelse proces. CDH1 (epithelial cadherin) illustrerer godt denne proces, eftersom peptider, der spænder over kun det ekstracellulære domæne observeres i konditionerede medier mens blev påvist peptider der spænder over både intracellulære og ekstracellulære regioner på overfladen af ​​OVCAR3 og ascitesceller. Røde spor indikerer ekstracellulære domæner og blå spor indikerer intracellulære domæner. Transmembrane regioner er angivet i de gule bokse. Mørke felter angiver peptider identificeret. B. Western blotting af CDH1 anvendelse af et specifikt antistof mod det intracellulære domæne (muse-anti-E-cadherin-klon 36, # 610.181, BD Biosciences) demonstrerer spaltning af den fulde længde CDH1. Der var ingen peptider afledt af det intracellulære domæne i konditioneret medie.

Epithelial cadherin (CDH1) illustrerer tydeligt udgydelse processen, da sekvens dækning af det ekstracellulære domæne er fremherskende i den udskilte fraktion, hvorimod peptid dækning spanning cellulære domæner både intra- og ekstra blev observeret for proteinet isoleres fra fraktion celleoverfladen. Vi sammenlignede massespektrometri baseret resultater med western blot-analyse af ovarie cellelinje og ascites-afledte tumorceller. Intakte former af CDH1 blev observeret i helcellelysater, sammen med lavere molekylære fragmenter, der indeholder det intracellulære domæne. Men i ascitesceller er der en overvægt af lavmolekylære fragmenter indeholdende kun det intracellulære domæne både totalt celleekstrakt og celleoverfladen, hvilket indikerer, at frigørelsen processen er mere omfattende i tumorceller end i cellelinjer. Former af CDH1 indeholdende det intracellulære domæne blev ikke påvist i de konditionerede medier af disse celler (figur 5B). Processen med at udgyde af CDH1 er for nylig blevet beskrevet for kræft i æggestokkene celler [5], til støtte for vore massespektrometri baseret undersøgelser. Af note er den observation i vores undersøgelse af yderligere proteiner fra cadherin familie af adhæsionsmolekyler i konditionerede medier, såsom neurale cadherin (CDH2), calsyntenin-1 (CLSTN1), alcadein beta (CLSTN3), desmoglein-1 (DSG1) og desmoglein-2 (DSG2). Baseret på Ingenuity Pathway Analyse annotation, er de fleste af disse membranproteiner identificerede beriget i de konditionerede medier i forbindelse med processerne for celleadhæsion og cellevandring (tabel S4). Fremgangsmåden for spaltning og afgivelse ikke er ensartet for alle proteiner, som vi har observeret en signifikant antal proteiner beriget i fraktion celleoverfladen, der ikke påvises i celledyrkningsmediet (tabel S4).

Protein sekretionshastigheder

Analyse proteiner frigives til mediet ved dyrkede celler er en attraktiv strategi for at identificere potentielle cirkulerende markører. Potentialet for detektion af forøgede niveauer af et protein i omløb afhænger til dels af hastigheden, hvormed proteinet frigives til det ekstracellulære rum og i sidste ende blodet rummet ved tumoren i forhold til andre væv. På listen af ​​proteiner mest beriget i dyrkningsmedier forhold til helcellelysater var to væv metalloproteaseinhibitorer (TIMP 1 og TIMP2) (Tabel S2). Disse proteiner har direkte diagnostik potentiale i ovariecancer [32].

Vi vurderede berigelse faktor for TIMP1 ved Western blot analyse (figur 6a). TIMP1 forekom overvejende udskilt rum i alle cellelinjer, konsistent med forudsigelser baseret på spektral tælling. Vi udførte også en tidsforløbet måling af TIMP1 og TIMP2 koncentration i det konditionerede medium til at estimere sekretionshastighed af disse proteiner for alle tre cellelinier (figur 6b). TIMP1 viste sig at have en lav sekretion sats i OVCAR3 celler i forhold til andre cellelinier, hvilket er konsistent med vores Western blot-analyse. Vi beregnede sekretionshastigheder af TIMP1 og TIMP2 at være af størrelsesordenen nanogram af protein per million celler, per time. Baseret på en sekretion på 3 ng TIMP1 per million celler pr time og uden at tage hensyn nedbrydningshastigheden og clearance i serum, vil det tage omkring 10

8-10

9 tumorceller og flere dage med output til at ændre niveauerne af TIMP1, der forekommer i normalt humant serum, som er 87-524 ng /ml.

A. Western blot viser tilstedeværelsen af ​​TIMP1 kun i de konditionerede medier af alle de 4 ovariecancerceller. OVCAR3 udtrykt signifikant mindre TIMP1 i sammenligning med de andre celler. Samme masse af protein (5 ug) blev påsat i hver bane af gelen til denne analyse. std svarer til rekombinant TIMP1 anvendt som en standard kontrol; TE svarer til helcellelysat; SE til konditioneret medium; og SU’en til celle overfladeproteiner. B. sekretion rate måling af TIMP1 og TIMP2 anvendte kommercielle ELISA kits (R & D-systemer). Konditionerede medier blev fortyndet 1:15 og 1:60 til analyse af TIMP1 og TIMP2 hhv. Den sekretion sats blev estimeret baseret på hældningen af ​​kurven ved lineære tidspunkter.

Diskussion

Vi præsenterer her en dybtgående proteomisk analyse af æggestokkene kræft cellelinjer og æggestokkræft tumorceller, herunder separate analyser af celleoverfladen og secernerede proteiner. Undersøgelsen var baseret på intakt protein fraktionering efterfulgt af trypsin og LC-MS /MS [16], [33], så følsom påvisning af lav hyppighed proteiner. Alt i alt, genereret vi en omfattende profil af proteiner, der består af mere end 6.500 unikke identifikationer med en fejlrate på mindre end 1%. En nylig undersøgelse af ascites væske bestående af proteiner fra blandede populationer af celler [12] identificerede 2.737 proteiner. 2.307 (84%) af proteinerne rapporteret i denne undersøgelse var omgivet blandt proteiner identificeret i vores undersøgelse.

Anvendelsen af ​​spektrale tællinger som et mål for overflod kombineret med sammenligninger af proteiner, der findes i celleoverfladen eller ekstracellulære rum og i helcellelysat profiler, tillod identifikation af proteiner beriget med bestemte rum. Peptid optælling giver overflod skøn, som korrelerer rimeligt godt med dem, som andre metoder [34]. I vores undersøgelse har vi også observeret en god korrelation mellem estimater af overflod af væv inhibitor af metalloproteinase 1 (TIMP1) og epithelial cadherin (CDH1) baseret på spektral optælling og vurdering baseret på Western blot-analyse. Isotopmærkning med SILAC [15] også tilvejebragt et effektivt middel til at skelne proteiner i konditionerede medier, der frigives fra dyrkede celler fra proteiner bidrager med bovint serum i dyrkningsmediet.

Vores analyser har givet indsigt i bidraget fra overflade protein kaste og slip for at proteinet sammensætningen af ​​den ekstra-cellulære rum. Proteiner højt beriget i dyrkningsmedier udgør en potentiel kilde til cirkulerende markører for ovariecancer. Transkripter svarende til nogle af disse proteiner (fx KLK6, 7 og 9) er relativt rigelige i ovarietumorer forhold til de fleste normale væv [35]. Der er allerede tegn på forekomst af de fleste af disse proteiner i normalt humant plasma. Af de 60 proteiner listet i Tabel S2, 48 (80%) var til stede i humant plasma Peptid Atlas [26].