PLoS ONE: Pathway Konsekvenserne af Aberrant Global Methylering i binyrebark Cancer

Abstrakt

Kontekst

Adrenokortikal karcinomer (ACC) er en sjælden tumor type med et dårligt fem års overlevelse og begrænset behandling optioner.

Målsætning

Forståelse af den molekylære patogenese af denne sygdom er blevet hjulpet på vej af genomiske analyser fremhæve ændringer i TP53, Wnt, og IGF signalveje. Yderligere udredning er nødvendig for at afsløre terapeutisk handlingsrettede mål i ACC.

Design

I denne undersøgelse blev der globalt DNA methylering niveauer vurderes af Infinium HumanMethylation450 BeadChip Array på 18 ACC tumorer og 6 normale adrenale væv . En ny, ikke-lineær korrelation tilgang,

den diskretisering metoden

vurderede forholdet mellem DNA methylering /genekspression tværs ACC tumorer.

Resultater

Denne sammenhæng analyse viste epigenetiske regulering af gener, der vides at modulere TP53, WNT, og IGF-signalering samt inaktivering af tumor suppressor MARCKS, der tidligere urapporteret i ACC.

konklusioner Salg

DNA-methylering kan regulere gener vides at spille en rolle i ACC patogenese samt kendte tumorsuppressorer

Henvisning:. Legendre CR, Demeure MJ, Whitsett TG, Gooden GC, Bussey KJ, Jung S, et al. (2016) Pathway Konsekvenserne af Aberrant Global Methylering i adrenocortikale Cancer. PLoS ONE 11 (3): e0150629. doi: 10,1371 /journal.pone.0150629

Redaktør: Jorg Tost, CEA – Institut de Genomique, FRANCE

Modtaget: 28. maj 2015; Accepteret: 17 februar 2016; Udgivet: 10 marts 2016

Copyright: © 2016 Legendre et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Udtrykket data behandlet i denne publikation er deponeret i NCBI s Gene Expression Omnibus og er tilgængelige via GEO Series tiltrædelse nummer GSE19776 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE19776). De methylering data diskuteres i denne publikation er deponeret i NCBI s Gene Expression Omnibus og er tilgængelige via GEO Series tiltrædelse nummer GSE77871 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE77871 )

Finansiering:. forfatterne vil gerne anerkende støtte fra forskningsfonden ATAC og Kirstens Legacy Fund. Forskning rapporteret i denne publikation blev understøttet af en generøs filantropisk bidrag fra Mr. Ray Thurston. Finansiering støtte blev også leveret af Virginia G. Piper Charitable Trust (TGW og BS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Adrenokortikal karcinomer (ACC) er sjældne neoplasmer, der tegner sig for op til 0,2% af kræftdødsfald. Den anslåede forekomst af sygdommen er 0,7 til 2,0 tilfælde pr million personer om året [1, 2]. Denne sygdom normalt rammer voksne i deres 40-50’erne, men kan også ses hos børn, typisk med en Tumor Protein p53 (

TP53

) kønscellelinie mutation [3]. Den eneste helbredende behandling er kirurgisk fjernelse af en lokaliseret tumor; Mange patienter har metastatisk sygdom på tidspunktet for diagnose, hvilket yderligere begrænser deres terapeutiske muligheder [4, 5]. I en undersøgelse ser på næsten 4000 tilfælde af ACC mellem 1985 og 2005, Bilimoria

et al

. rapporterede 26,5% præsenteret med nodal metastase og 11,3% præsenteret med fjernmetastaser, hvilket fører til en fem-års overlevelse på 11,5% i forhold til 55,1% uden fjernmetastaser [4]. Svarprocenten på generelt accepterede first-line kemoterapi bestående af etoposid, doxibucin, cisplatin og mitotan er kun 23% [6], hvilket gør det klart, at der er et presserende behov for nye behandlingsformer.

Genomisk analyser er at belyse den molekylære patogenese ACC og udsætter potentielle terapeutiske mål. De bedst undersøgte og konsekvent observeret genomiske aberrationer involverer

TP53

tumorsuppressorgen, insulin-lignende vækstfaktor type 2 (

IGF2

) signalering, og Vingeløse-Type MMTV integrationsposition familie (

WNT

) vej. Flere undersøgelser har klart fastslået en rolle for afvigende TP53 funktion, selvom den rapporterede mutation sats for

TP53

i sporadisk voksne ACC er kun ca. 16-27% [7-9]. Overekspression af

er IGF2

ses i mindst 95% af ACC tumorprøver studerede [10], hvilket fik kliniske forsøg beskæftiger Insulin-lignende vækstfaktor 1 receptor (IGF1R) hæmmere [11]. WNT pathway signalering er også afvigende, med aktiverende somatiske mutationer af β-catenin-gen set med en lignende frekvens på ca. 30% i både benigne og maligne tumorer binyrebark [12]. Mens genomiske analyser har afdækket pathway forstyrrelser i ACC, har klinisk handlingsrettede mål været undvigende, fører en til at konkludere, at der er behov for en dybere forståelse af ACC tumorigenese.

Undersøgelse af epigenetiske ændringer i ACC er forankringen interesse. Globale methylering analyser har vist, at der findes forskellige methyleringsmønstre at skelne ACC fra godartede tumorer og /eller normal adrenal væv [13, 14]. Rechache

et al

. har vist, at metastatiske ACC tumorer viste et klart methyleringsmønster sammenlignet med normale binyre- og primær ACC tumorer og maligne prøver demonstrerede global hypometylering [14]. Barreau

et al

. identificeret en CpG ø methylator fænotype (CIMP) i ACC forbundet med dårlig patient overlevelse [15]. Disse globale methylering analyser foreslået hypermethylering af tumorsuppressorer såsom cyklin-afhængige kinase inhibitor 2A (

CDKN2A

), Slettet i Lung og Esophageal Cancer 1 (

DLEC1

), eller

N- myc

Nedstrøms-Reguleret Gene familiemedlem 2 (

NDRG2

) som en mekanisme for reduceret mRNA-ekspression observeret i ACC tumorer i forhold til adenomer eller normal adrenal væv. For nylig, en integreret genomisk karakterisering identificeret to distinkte molekylære undergrupper i ACC: C1A og C1B [7]. Den C1A undergruppe korreleret med en dårlig patient prognose, øget hyppighed af driver genetiske mutationer, distinkt mRNA og miRNA klynger, og havde en klar sammenhæng med CIMP. Således har methylering analyser identificeret undergrupper af ACC tumorer med differential prognose og foreslog molekylære forandringer, der kan bidrage til ACC patogenese; selv, det fulde omfang af de gener og pathways moduleret ved methylering i ACC er fortsat ukendt.

I dette arbejde, vi søgte at korrelere DNA methylering ændringer med udtryk profiler i et sæt af ACC (n = 18 [17 tumorer , 1 levermetastaser ACC_150]) og normal adrenal (n = 6) prøver for bedre at forstå, hvordan methylering kan resultere i afvigende gen og pathway-ekspression observeret i ACC. Vores undersøgelse anvender en ikke-lineær korrelation tilgang benævnt

diskretiseringen metode

[16] for at vurdere DNA methylering /genekspression relationer inden veje, og afslører potentielle epigenetisk regulering af gener involveret i TP53, WNT, IGF2, og tumorsuppressorgen signalering og /eller stabilitet. Mens andre undersøgelser har rapporteret DNA methylering ændringer i ACC i fortiden, vores undersøgelse er forskellige i den måde, hvorpå vi beskriver DNA methylering /genekspression foreninger til at identificere epigenetisk regulerede veje med kendt betydning for ACC.

Materialer og Metoder

kliniske prøver

De kliniske prøver, der anvendes i denne analyse repræsenterer en delmængde af prøverne tidligere beskrevet [8]. I korte træk blev et sæt ACC flash frosne tumorer og normale binyrerne indsamlet på Mayo Clinic (Rochester, Minnesota), University Hospital Essen (Essen, Tyskland), University of Calgary (Alberta, Canada), og Scottsdale Healthcare (Scottsdale , Arizona), samt doneret direkte af patienterne gennem deres indstillinger samfund pleje; alle prøver blev opnået under passende etiske procedurer og skriftligt informeret patient samtykke på de respektive institutioner. Normale binyrerne blev opsamlet på tidspunktet for kirurgi for en anden indikation, typisk resektion af en tumor i nyren. Den adrenal blev tages samlet, og cortex blev macrodissected fra medulla bedst muligt. Forskning materialer til denne undersøgelse blev opnået under protokoller godkendt af vestlige Institutional Review Board (WIRB # 20.051.769). Diagnosen ACC blev bekræftet ved gennemgang af patologi rapport, og i de fleste tilfælde, ved fornyet undersøgelse af de histopatologiske lysbilleder af en erfaren endokrine patolog.

genekspressionsprofilering

mRNA udtryk og statistisk analyse af ACC og normale væv er tidligere beskrevet [8]. Kort beskrevet blev RNA ekstraheret fra 100 mg prøver af ACC tumorer og normale væv adrenal, amplificeret og revers transkriberet under anvendelse af MessageAmp II Biotin Enhanced Kit (Ambion Life Technologies Corp, Carlsbad, CA). Biotin-mærket cRNA blev syntetiseret ifølge deres standardprotokol, efterfulgt af oprensning via leveret cRNA Filterpatroner. Mærket cRNA var fragmenteret og hybridiseret til Affymetrix U133 Plus 2 humane genom arrays efter den standard Affymetrix protokol (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA). Scanning og vask blev afsluttet den fluidik Stations FS450 og GeneChip

® Scanner 3000 med Workstation.

Array kvalitet til ACC og de normale prøver blev vurderet ved hjælp af Affy QCReport pakken i BioConductor og R statistiske sprog ; alle arrays bestået kvalitetskontrol målinger. Alle efterfølgende data normalisering og statistisk analyse blev udført ved hjælp GenePattern (Broad Institute, www.broadinstitute.org) [17]. Expression array-data blev normaliseret ved gcRMA med fraktil normalisering, og baggrund subtraktion efter brug af Expression File Creator [18]. Data blev derefter floored på 5,5 ved hjælp Forbehandl Dataset, og filtreret for at fjerne 1) prober med mere end 35 floored værdier og /eller 2) sonder, hvor alle værdier fra den ene portion blev floored mens værdierne fra anden partiet ikke var. Yderligere batch effekter blev minimeret ved brug kamp med den parametriske løsning [19]. Udtrykket data diskuteres i denne publikation er deponeret i NCBI s Gene Expression Omnibus og er tilgængelige via GEO Series tiltrædelse nummer GSE19776 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE19776 ).

DNA methylering Analyse

Global DNA methylering blev evalueret ved brug af Infinium

® HumanMethylation450

® BeadChip Array. (Illumina, San Diego, CA). Kort fortalt 1 ug hver DNA-prøve undergik bisulfit konvertering ved hjælp af EZ DNA-methylering Kit (Zymo Research, Irvine, CA) i overensstemmelse med producentens anbefaling til Illumina Infinium analysen. Bisulfit-behandlede DNA blev derefter hybridiseret til arrays ifølge fabrikantens protokol. Vi brugte GenomeStudio V2011.1 (Illumina) for methylering af data samling og erhvervelse. Methylering niveauer for hver CpG-rest præsenteres som ß værdier, estimering af forholdet mellem den methylerede signal intensitet over summen af ​​de methylerede og ikke-methylerede intensiteter ved hvert locus. Den gennemsnitlige ß værdi rapporterer en methylering signal i intervallet fra 0 til 1, der repræsenterer helt umethylerede til fuldstændig denatureret værdier hhv. Methylering data forbehandlet i R ved hjælp af Illumina Methvlerinq Analyzer (IMA) pakke [20]. Data, forbehandling inkluderet korrektion baggrund, sonde skalering at balancere Infinium I og II sonder, fraktil normalisering, og logit transformation. En logit transformation konverterer ellers heteroscedastic beta værdier (afgrænset af 0 og 1) til M værdier efter en Gaussisk fordeling. Derudover detection p-værdier 0,05 i 25% af prøverne, sonder på X- og Y-kromosomer, og prober beliggende inden for 10 bp af formodede SNP’er blev fjernet. Differential methyleringsanalyse på logit-transformerede værdier blev udført for at sammenligne 18 ACC tumorer til 6 normale adrenale prøver i IMA. Wilcox rank test blev udført mellem ACC og normale prøver og p-værdier blev korrigeret ved at beregne den falske opdagelse sats af Benjamini-Hochberg metoden. Sonder med justerede

p-værdier

0,05 og delta β værdier ≥0.2 eller ≤-0,2 blev betragtet som statistisk signifikant og differentielt methylerede. De methylering data diskuteres i denne publikation er deponeret i NCBI s Gene Expression Omnibus og er tilgængelige via GEO Series tiltrædelse nummer GSE77871 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE77871 ).

Korrelere DNA methylering til Gene Expression af diskretisering Method

Vi brugte vores nyligt rapporterede ikke-lineære

diskretisering metode

ved at kategorisere prøver i forskellige grupper baseret på sonde methylering niveauer for at identificere DNA methylering /ekspressions korrelationer [16]. Genekspression data var tilgængelige for 14 af de 18 prøver analyseret for methylering ændringer. For hver methylering probe blev de 14 ACC prøver adskilt i

hypermethylerede

(M) eller

hypomethylated Salg (U) grupper baseret på graden af ​​methylering afviger fra de gennemsnitlige methylering niveauer af 6 normal adrenal prøver. Prøver med methylering niveauer

μ

(betyde methylering niveau af normale prøver) blev klassificeret i

M

gruppe og prøver med methylering niveauer

μ

blev klassificeret som U for den givne CpG locus forhørt af sonden. Hver probe i methylering array med en genekspression sonde på Affymetrix U133 Plus 2 humane genom Grupperingen blev analyseret. Differential genekspression analyse, sammenligning prøver, der blev kategoriseret som M og U, blev udført med en

t

-test uden at påtage lige varians (Matlab software, www.mathworks.com). Hvis et gen forskelligt blev udtrykt (FDR-korrigerede

p-værdi

0,05) mellem prøverne i M og U-grupper, blev CpG methylering anset korreleret til udtryk af dette gen. En negativ korrelation blev defineret som retningen af ​​forandringer for udtryk og methylering i modsatte retninger (fx hypermethyleringsassocierede og tab af udtryk, eller vice versa). En positiv korrelation opstod, da retningen af ​​ændringen var den samme mellem methylering og udtryk (f.eks hypermethylering og positivt udtryk, eller hypometylering og reduceret ekspression).

For at validere vores resultater rapporteret i S2 tabel vi brugte RNAseq og methylering data fra 78 ACC prøver genereret af TCGA. Niveau 3 RNAseq data (TPM-værdier) og methylering beta værdier blev hentet fra TCGA Data Portal (https://tcga-data.nci.nih.gov). RNAseq data blev log2 forvandlet: log2 (TPM + 1), før yderligere analyse. På niveau 3 TCGA methylering data, blev nogle værdier målt som “NA”, og disse værdier blev fjernet under differential analyse. Vi også ikke de methylering sonder med 2 prøver i enten hypo- eller hyper-gruppe i analysen. Valideringen analyse blev udført ved at teste, hvis de samme methylering sonder rapporteret i S2 tabel havde også sammenhæng med genekspression i TCGA ACC datasæt, når du bruger diskretisering metoden. I den nuværende manuskript, vi ændret diskretisering metode først beskrevet i Jung

et al

. [16] for at afspejle det lille antal prøver. I denne modificerede fremgangsmåde, vi diskretiseres prøver baseret på, om en prøve var hypoglykæmi eller hypermethyleret sammenlignet med ikke-neoplastisk adrenal væv. Til dette blev en delta beta værdi for hver probe beregnet for hver tumors methylering data, når sammenlignet med gennemsnittet af de methylering data fra den ikke-neoplastiske adrenal væv. I denne binære diskretisering blev en tumorprøve anses hypomethylated eller hypermethyleret når dens delta-beta-værdi var negativ eller positiv, sammenlignet med normalt væv. Da der var tilstrækkelige prøver i TCGA datasæt, vi også udført diskretisering efter den oprindelige metode beskrevet (benævnt her som tredelt diskretisering) af Jung

et al

. [16]. Når prøverne blev grupperet i U og M-grupper ved enten binære eller ternære diskretisering, var udtryk værdier af gener med tilsvarende methylering prober testes for differentiel ekspression under anvendelse af Welch t-test.

Pathway Analyse

genet liste af interesse blev uploadet i IPA (Opfindsomhed

® Systems, Redwood City, CA) og Core Analysis arbejdsgangen blev kørt med standardparametre. Core Analysis giver en vurdering af væsentligt ændrede veje, molekylære netværk og biologiske processer, der er repræsenteret i prøverne ‘gen listen.

Resultater

Global methylering Opskrifter i ACC versus Normal Adrenal

for at vurdere globale DNA methylering mønstre i ACC tumorer, brugte vi 450K-methylering platform til at sammenligne 18 ACC tumorer med 6 normale binyrerne prøver. Samlet set analyse viste 1291 differentielt methylerede CpG loci (DML) omfatter 629 unikke gener (S1 tabel). Beta værdier blev brugt til at generere box plots til at repræsentere den samlede methylering niveauer på tværs af DML for ACC og normal. Median samlet methylering var lidt lavere i ACC (β = 0,51) end i normale binyre (β = 0,67) (Fig 1A), hvilket indikerer hypometylering i ACC (p-værdi 0,0001). Individuelle prøve box plots af DML demonstrerede en mere homogen fordeling af methylering værdier i normale adrenale prøver i forhold til ACC, som viste varierende grader af methylering mellem prøver (figur 1B). Af alle DML, blev 475 hypermethyleret og 816 blev hypomethylated. Næste vi undersøgte fordelingen af ​​DML tværs kromosomer, der afbilder fordelingen af ​​hypo- og hyper-DML efter normalisering til kromosom længde (tabel 1). Ifølge analysen kromosomerne 5, 7, 12, og 19 havde den mest hypomethylated loci og kromosomerne 11, 17, og 19 havde den mest hypermethyleret loci, med kromosomer 7, 12, og 19, der har den mest samlede DML.

A) Box plot viser generelt lavere median β værdi methylering niveauer for 1291 forskelligt methylerede sonder. B) Kassegrafer viser beta værdier på 1291 differentielt methylerede loci for hver enkelt prøve (6 normal og 18 ACC prøver).

Næste undersøgte vi regionale og funktionelle CpG fordeling af DML i ACC . Funktionel fordeling angår CpG position til: transcription start sites (TSS -200 til -1500 bp), 5 ‘utranslaterede region (UTR), exon 1 til kodning gener, og gen-organer. Samlet set størstedelen af ​​prober ( 50%) var beliggende i gen-organer, efterfulgt af ~ 15% af prober beliggende inden 1500 bp opstrøms for TSS, med en meget lignende fordeling mellem hyper- og hypo DML (Fig 2A)

A) lagkagediagrammer demonstrerer frekvensen med hvilken hyper eller hypomethylated loci er fordelt efter deres funktionelle position, herunder afstand fra transskriptionsstartstedet (TSS). B) Hyppigheden af ​​DML at være beliggende i et CpG øer, kyster, hylder eller åbent hav. Neighborhood sammenhæng er en indikation af nærhed til en CpG ø.

Regional fordeling af DML blev vurderet på grundlag af deres nærhed til den nærmeste CpG øen. Ud over øer, kyster er 0-2 kb fra CpG øer, hylder er 2-4 kb væk, og åbne havområder er isoleret loci uden en betegnelse. Ved sammenligning af ACC prøver til normale prøver, identificerede vi størstedelen af ​​DML (55,7%) var i åbent hav, efterfulgt af øer (21%), bredden (15,8%) og hylder (7,5%). Desuden bemærker vi, at størstedelen af ​​hypermethyleret loci (50,3%) var placeret i CpG øer i forhold til flertallet af hypomethylated loci beliggende i det åbne hav (77%) (fig 2B). I modsætning hertil af alt hypomethylated loci, blev den mindste andel (3,92%) fundet i øer, og den mindste procentdel af hypermethyleret prober (4,42%) blev fundet i hylder.

Vi næste udført ukontrollerede clustering analyse (euklidiske afstand , Komplet hierarkiske clustering metoder) af DML og demonstrerede en klar adskillelse af normale og ACC prøver med tegn på gen-klynger, der fortrinsvis hyper eller hypomethylated i ACC (Fig 3). Blandt generne mest hypermethyleret i ACC var den

EPHX3

Meis

gener, med 20% og 9,2% af mulige genprober påvirkes (Fig 4). Repræsentative gener i hypomethylated klynger er

ADCY2

TMEM132D

gener, der ramte 16,2% og 18,5% af prober (Fig 4).

Clustering analyse viste adskillelse af ACC og normale prøver. Prøver er på den vandrette akse: normale prøver vises med en gul bar og ACC prøver vist med en blå bjælke

EPHX3

og

Meis

gener. er signifikant hypermethyleret i ACC sammenlignet med

TMEM132D

og

ADCY2

som er signifikant hypomethylated.

Identifikation af Methylering-Expression sammenhænge Brug af Diskretisering Method

i en separat analyse undersøgte vi methylering-udtryk korrelationer ved hjælp af en ikke-lineær tilgang: benævnt

diskretisering metode

. Denne metode bygger på den kendsgerning, at kræft prøver kan kategoriseres i to grupper efter deres relative methylering niveauer for hver probe på methylering array, der gør det muligt at blive opdaget et større antal sammenhænge end ved sammenligninger anvender lineære metoder. Prøverne blev enten anset

hypermethylerede

(M) eller

hypomethylated Hotel (U) i forhold til en reference (gennemsnit methylering niveauer fra normale prøver i denne undersøgelse) og statistisk signifikante genekspression forskelle mellem prøver i

M

U

grupper vil foreslå en methylering-udtryk korrelation i et givet locus. Ved at anvende denne binære diskretisering metode, vi identificeret 763 unikke CpG loci (550 unikke gener) med methylering-udtryk sammenhænge. I gennemsnit var der 9 prøver i

M

gruppe og 5 prøver i

U

gruppe. Der var 319 loci med positive korrelationer og 444 loci med negative korrelationer. Alle CpG methylering /udtryk korrelationer fra denne opdagelse kohorte er vist i S2 tabel.

For at validere resultaterne af den aktuelle undersøgelse i en uafhængig kohorte af prøver, downloadet vi RNA-seq udtryk data og matchende DNA methylering data fra TCGA portal for 78 ACC prøver. Denne stikprøve ikke kun tilladt os at teste sammenhænge ved hjælp af vores ændrede binære diskretisering metode, men også mulighed for at udnytte den ternære metode så godt. På grund af fraværende /manglende data i TCGA sættet, 468 sonder var tilgængelige for binær test af koordineret udtryk. Derudover nogle prober havde tilstrækkelige klassestørrelse (M og U), hvilket giver 433 prober for ternære gruppering ud af 763 unikke prober rapporteret i S2 tabel. I binær gruppering, 164/468 (35%) sonder (S3 tabel) viste signifikant sammenhæng (p-værdi 0,05) med tilsvarende genekspression værdier, og ternære gruppering 154/433 (35,6%) prober (S4 tabel) viste signifikant sammenhæng (p-værdi 0,05)

Ændringer i TP53 og WNT signalveje

for at identificere biologiske begreber beriget med S2 tabel, vi begge visuelt listen for at identificere indlysende. mønstre og vi forelagde gen listen til Core Analysis workflow i IPA (Opfindsomt

® Systems). Væsentlige fund blev sorteret baseret på p-værdier til at identificere de mest karakteristiske kategorier, som repræsenterer epigenetisk regulerede gener i ACC. Kort resumé, de væsentligste sygdomme og lidelser, der er forbundet med generne i S2 tabel var Kræft med 471 gener, der er repræsenteret fra vores liste (S5 tabel). De 5 øverste molekylære og cellulære funktioner var Cellular Vækst og spredning, Cell Morfologi, Cellular Assembly og Organisation, Cellular Funktion og vedligeholdelse, og celledød og overlevelse (S6 tabel).

Brug af diskretisering metode, vi identificeret en antal gener med methylering-udtryk korrelationer vides at være involveret i kræft, eller specifikt ACC patogenese. Alle de gener, vi påpege nedenfor blev beriget i Ingenuity Pathway Analyse under en af ​​de kategorier, der er nævnt ovenfor. Deres vej forening, og uanset om de er blevet valideret bemærkes på hver af tabellerne nedenfor. Blandt denne liste af korrelerede gener er regulatorer af TP53 vej, såsom:

SETD7

,

DYRK2

,

CCDC8

,

UBE2D1

,

RBM5

,

NDRG1

DUSP7

(tabel 2, figur 5 og 6, S2-S4 Tables). I hvert eksempel prøver med lav methylering havde statistisk signifikante højere niveauer af genekspression og prøver med høj methylering havde lavere niveauer af genekspression.

DUSP7

,

NDRG1

,

SETD7

, og

UBE2D1

blev observeret til at være under-udtrykt i en uafhængig datasæt sammenligner ACC mRNA udtryk for normal binyrer, med under-udtryk enig med den observerede hypermethylering /under-udtryk korrelation [21].

for hvert gen, den øverste heatmap repræsenterer log2 methylering værdier for 14 ACC prøver hver normaliseret til gennemsnittet af 6 normale adrenale prøver. Log2 methylering nøgletal 0 repræsenterer hypermethylering og 0 repræsenterer hypometylering. Den nederste zonekort viser udtryk for z-transformerede ekspressionsniveauer, hvor en værdi 0 angiver ingen udtryk ændring i forhold til gennemsnittet udtryk niveau på 14 ACC prøver. Tre gener med negative korrelationer blev udvalgt til visualisering:

CCDC8

(TP53 vejen),

TBX3

(WNT vej), og

PAX8

(anden kendt kræft-gen, der er involveret i invasion og migration). Prøver med højere methylering (fersken-maroon) havde lavere udtryk (grøn). Prøver med lavere methylering (blå) havde højere ekspression (rød). Kun korrelerede methylering loci og udtryk sonder er vist, og prøverne er sorteret efter deres diskretisering klassificering af M eller U for hvert gen.

For hvert gen, den øverste zonekort repræsenterer log2 methylering værdier ( beta) for 78 TCGA ACC prøver hver normaliseret til gennemsnittet af 6 TGEN normale adrenale prøver. Log2 methylering nøgletal 0 (rød) repræsenterer hypermethylering og 0 (blå) repræsenterer hypometylering. Den nedre Heatmap viser genekspression af tilsvarende TCGA ACC prøver, log2 (TPM + 1). De samme tre gener anvendes til TGEN ACC undersøgelse (discovery) blev anvendt til visualisering:

CCDC8

(TP53 vejen),

TBX3

(WNT vej), og

PAX8

( anden kendt cancer-gen, der er involveret i invasion og migration). Prøver med højere methylering (rød) havde en lavere ekspression (grøn). Prøver med lavere methylering (blå) havde højere ekspression (rød). Kun korrelerede methylering loci og udtryk sonder er vist, og prøverne er organiseret af ligheden methylering mønstre mellem prøver for hvert gen. Som vist, alle tre gener viser samme negative korrelation mellem methylering status og genekspression som TGEN ACC prøver

Vi identificerede også methylering /udtryk korrelationer i 4 Wnt signalering gener.; dette er en anden vej er kendt for at være forbundet med ACC tumorigenese (tabel 3, S2-S4 Tables). Prøver viser højere methylering af

PRDM5

DKK3

, som begge antagonister af WNT signalering, var ledsaget af tab af mRNA-ekspression og vice versa. Omvendt

TBX3

(en WNT target-gen) blev hypomethylated og overudtrykt; disse korrelationer blev observeret i både de oprindelige og TCGA datasæt (fig 5 og 6).

WNT3

(WNT ligand) var methyleret og underexpressed i 11 prøver og umethyleret og overudtrykt i 3 prøver. Tab af

DKK3

mRNA ekspression blev valideret på en uafhængig, offentligt tilgængelige datasæt sammenligne ACC til normal adrenal væv [21].

Andre cancerrelateret gen Ændringer

transskription faktor

PAX8

, vist sig at være hypermethyleret ved andre tumorer, stort set vist en negativ korrelation til genekspression, hvor hypermethylering korreleret med reduceret udtryk (tabel 4, fig 5 og 6, S2-S4 Tables ). Negativ methylering /blev også fundet udtryk korrelationer for

HDAC4

(en chromatin modifier),

ErbB3

(en kendt onkogen), samt

MARCKS

CXCR4

; gener vides at inducere tumor celle invasion og terapeutisk modstand ved andre tumorer (tabel 4, S2-S4 Tables). Rolle IGF2 og IGF signalering som et onkogent driver i ACC er også godt beskrevet. Vores data viser en betydelig methylering /udtryk korrelation for

IGF2

gen. Én probe (cg04057455) placeret i genet krop korreleret positivt med to genekspression prober (S2 Table). Den anden probe (cg08986368) placeret i et CpG island korreleret negativt med én genekspression probe. Slutresultatet blev øget udtryk for prøver med CpG ø hypometylering eller gen krop hypermethylering, hvilket er i overensstemmelse med de forventede effekter af methylering på genekspression.

Diskussion

Formålet med aktuelle undersøgelse var at analysere globale DNA methyleringsmønstre i ACC tumorer sammenlignet med normale adrenal væv og til at korrelere DNA methylering ændringer med mRNA-ekspression. Vores undersøgelse viste global hypometylering i ACC i forhold til normal adrenal væv. Global genomisk hypomethylering er blevet observeret på tværs af forskellige cancer celletyper [22, 23], herunder maligne binyretumorer sammenlignet med godartede eller normal adrenal væv [14]. I overensstemmelse med tidligere global methylering analyser, herunder ACC, hypometylering var hyppigst i ‘åbent hav «, væk fra CpG øer, og hypermethyleringsassocierede begivenheder fandt sted oftest i CpG øer [15].

For at identificere signifikante korrelationer mellem methylering og genekspression i ACC blev en diskretisering metode benyttes. Denne ikke-lineære fremgangsmåde til identifikation af sammenhænge er mere følsom end lineær metoder, fordi den bygger på delmængder af prøver med modsatrettede tendenser methylering [16]. Med denne metode identificerede vi 550 gener med betydelig negativ eller positiv korrelation mellem methylering og genekspression. Generne identificeret ved hjælp af denne metode indblande veje vides at være foruroliget i ACC som TP53, WNT, og IGF2 signalering. Desuden klassisk tumor suppressor, andre cancerrelateret, og hidtil ukendte gener, der ikke tidligere er impliceret i ACC blev også identificeret.

TP53

tumor suppressor er muteret i mere end 50% af alle tumorer. Genetiske ændringer i

TP53

, herunder mutationer (16%) [7] og epigenetisk inaktivering (sjældent set) [24], forekommer i en lavere procentdel af ACC tumorer. Vores seneste arbejde i ACC viste signifikant differentiel ekspression af gener involveret i TP53 kanonisk signalering [8].