PLoS ONE: synergistisk kombination af gemcitabin og Dietary Molecule fremkalder apoptose i bugspytkirtelkræftceller og nedregulerer PKM2 Expression

Abstrakt

Gemcitabin, et effektivt middel i behandlingen af ​​kræft i bugspytkirtlen, har gennemgået fiaskoer i mange tilfælde efter flere cyklusser af behandlingen på grund af fremkomsten af ​​resistens. Kombination af kosten forbindelser med klinisk validerede narkotika har vist sig som en effektiv terapeutisk tilgang til behandling af pancreas tumorer, refraktære over for gemcitabin behandling. For at optimere en eventuel synergistisk kombination af gemcitabin (GCB) med kosten molekyler, Betuilnic syre (BA) og Thymoquinone (TQ), stand-alone IC

50 dosis GCB, BA og TQ blev beregnet for kræft i bugspytkirtlen cellelinjer . Fast IC

50 dosis forholdet mellem kosten molekyler i kombination med reduceret IC

50 dosis GCB blev testet på GCB resistent PANC-1 og følsomme MIA PaCa-2 celler til synergi, additiv respons og antagonisme, hjælp CalcuSyn. Kombinationsindeks (CI) viste, at forbehandling af BA og TQ sammen med GCB synergistisk inhiberede cancercelleproliferation i

in vitro

eksperimenter. Pyruvatkinase (PK) M2 isoform, en lovende mål involveret i kræft celle metabolisme, viste nedregulering i tilstedeværelse af TQ eller BA i kombination med GCB. GCB med BA handlede fortrinsvis på tumor mitokondrier og udløste mitokondrie permeabilitet overgang. Pre-eksponering af cellelinierne, MIA PaCa-2 og PANC-1, at TQ i kombination med GCB induceret apoptose. Således er effektiviteten af ​​BA eller TQ i kombination med GCB inhibere celleproliferation, inducere apoptose og nedregulere ekspressionen af ​​PKM2, afspejler løfte i bugspytkirtelkræft behandling

Henvisning:. Pandita A, Kumar B, Manvati S, Vaishnavi S, Singh SK, Bamezai RNK (2014) synergistisk kombination af gemcitabin og Dietary Molecule fremkalder apoptose i bugspytkirtelkræftceller og nedregulerer PKM2 Expression. PLoS ONE 9 (9): e107154. doi: 10,1371 /journal.pone.0107154

Redaktør: Ajay Pratap Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, USA

Modtaget: 24. maj 2014; Accepteret: August 13, 2014; Udgivet: 8 September, 2014

Copyright: © 2014 Pandita et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:.. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Indledning

forsøg er blevet madeto forbedre effektiviteten af ​​klinisk validerede lægemidler i kombination regime til at forbedre deres reaktion i retning ildfaste tumorer, herunder pancreascancer [1]. Udover 5-fluoruracil, Gemcitabin (GCB), et udbredt kemoterapeutiske stof for kræft i bugspytkirtlen, har vist fejl efter flere cyklusser af behandlingen på grund af fremkomsten af ​​resistens [2], [3]. Behandling pancreas tumorer, der er refraktære over for gemcitabin terapi er en udfordring for onkologer. Indsatsen, som i andre kræftformer, at målrette de centrale processer, såsom kræftfremkaldende stofskifte, celledeling, differentiering, apoptose, i bugspytkirtlen udvikling af kræft, har skabt interesse i kosten fytokemikalier for potentielle kræft kemoforebyggelse. Et mekanistisk forbindelse mellem kost og kræft i bugspytkirtlen kommer fra dens kendt længe indbyrdes [4]. En sådan kosten middel, som kan anvendes i kombination med GCB til behandling af kræft i bugspytkirtlen, er Betulinsyre (BA), en naturligt forekommende penta-cyklisk-triterpen med en række biologiske aktiviteter, herunder kraftige antitumoregenskaber [5]. BA er indeholdt i den ydre bark af forskellige planter hele planteriget, herunder hårde-gøet birketræer [6], med antiinflammatoriske, antivirale og antineoplastiske aktiviteter [7]. Anticanceraktivitet af BA er blevet forbundet til dets evne til direkte at udløse mitokondriel membranpermeabilisering, en central begivenhed i den apoptotiske proces, hæve håb at omgå modstandsdygtigheden over for konventionelle kemoterapeutiske midler [6]. Thymoquinone (TQ), en anden potentiel anticancer-nutraceutical middel, er en bioaktiv forbindelse stammer fra sorte frø (

sortkommen

) olie. I folklore medicin, er forbruget af TQ frø blevet forbundet med forskellige terapeutiske fordele i bronkial astma, dysenteri, hovedpine, gastrointestinale problemer, eksem, hypertension og fedme [8]. I forbindelse med cancer, er TQ rapporteret at udvise anti-proliferative virkninger på cellelinjer, der er afledt af bryst-, tyktarms-, ovarie, strubehoved, lunge, myeloblastisk leukæmi og osteosarkom [9] – [15]; og anti-metastase effekt i humanpancreatic cancer. Det er blevet vist at undertrykke migration og invasion af PANC-1-celler på en dosis-afhængig måde [16] og nedregulere NF-kappa B og MMP-9-ekspression. Tidligere undersøgelser har også vist den biologiske aktivitet af thymoquinone (TQ) i bugspytkirtelkræftceller

in vitro

. Dette har afsløret sin kemo-sensibiliserende virkning efter den forudgående udsættelse af celler for TQ (25 pmol /l) i 48 timer, efterfulgt af gemcitabin eller oxaliplatin, hvilket resulterer i 60% til 80% vækstinhibering i sammenligning med 15% til 25% . af hæmning med gemcitabin eller oxaliplatinalone [17]

Kræftceller, overvejende afhængig af omprogrammering af deres metaboliske behov, forbruge mere glukose og producere en stor mængde laktat selv i et godt oxygenized miljø; den proces betegnet som aerob glykolyse eller “Warburg-effekten” [18], [19]. Mens normale differentierede celler maksimere ATP produktion af mitokondrie oxidative fosforylering af glukose under normoxiske betingelser, kræftceller genererer langt mindre ATP fra glucose ved aerob glykolyse. Trods mindre effektiv i ATP-produktion, glykolyse er en langt hurtigere proces i cancerceller [20], [21]. Her pyruvatkinase (PK) katalyserer det sidste reaktion med overførsel af en højenergi-phosphatgruppen fra phospho-enolpyruvate (PEP) til ADP, der producerer ATP og pyruvat som reduceres til lactat af lactatdehydrogenase (LDH) i cytosolen. Pyruvatkinase (PK) består af fire isoformer, hvoraf PKM2 udtrykker overvejende cancerceller [22]. Disse er: kolon [23], renal celle [24], lunge [25] og andre. PKM2 har vist sig at fungere som en markør for: nyrecellecancer (RCC) [26], [27], testikelkræft [28], brystcancer [29], urologiske tumorer [30], lungecarcinom, cervical cancer, og gastrointestinale tumorer [31]; og med en eventuel påvisning i afføring fra patienter med gastrisk og kolorektale cancere [32]. I seneste tid har massespektrometri yderligere demonstreret en overvejende forekomst af PKM2 i:. RCC, blærecarcinom, hepatocellulært carcinom, colorektal cancer, lungecancer, og follikulært skjoldbruskkirtel adenom [33]

I denne undersøgelse undersøgte vi effekten af ​​BA eller TQ med GCB, selvstændigt og i kombination, på humane adenocarcinom celler, MIA PaCa-2 og PANC-1, at inducere celledød. Underliggende mekanisme af deres indsats, navnlig med hensyn til PKM2 ekspression og aktivitet og mitokondriel permeabilitet overgang blev vurderet.

Materialer og metoder

cellelinier, vedligeholdelse og reagenser

Menneskelig pancreas cancercellelinjer PANC-1 og MIA PaCa-2 blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Celler blev dyrket i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 atmosfære. Glutamin, HEPES eller natriumpyruvat kosttilskud, blev tilsat for at opretholde ordentlig cellevækst. Betulinsyre (BA), Thymoquinone (TQ), gemcitabin (GCB), dimethylthiazol-2-yl-2, 5-diphenyl-tetrazolium-bromid (MTT), Rodhamine-123 (Rh-123), propidiumiodid (PI) og andre kemikalier (Sigma Chemical Co, USA); sammen med Annexin-V-FITC apoptosis afsløring kit (Cayman Chemical Company), antistoffer mod: Pro-caspase-3, beta-actin, PKM2, poly-ADP-ribose-polymerase (PARP) (Cell Signaling), blev anskaffet og anvendt i undersøgelsen.

Behandling profil og Cellelevedygtighed assay

PANC-1 og MIA PaCa-2-celler blev dyrket i T-75 kolber. Efter 80% sammenflydning, blev cellerne trypsiniseret og centrifugeret ved 100 x g i 5 min. Cellepelleten blev suspenderet i DMEM-medium; og 2 × 10

5 celler /brønd dispenseres i Nunclon-96-brønd fladbundede plader til at fastgøre i 24 timer. Celler blev udsat for forskellige koncentrationer af BA, TQ og GCB, alene og i kombinationer. I kombination eksperimenter blev cellerne først behandlet og sensibiliseret med BA eller TQ i 24 timer, efterfulgt af udsættelse for GCB for næste 24 timer og inkuberet i CO

2 inkubator ved 37 ° C. For celleviabilitetstest, MTT-opløsning (20 pi 2,5 mg /ml i DMEM) blev sat til hver brønd, og dyrkningsplader forsigtigt omrørt, efterfulgt af inkubation i CO

2 inkubator ved 37 ° C i 3 timer. Supernatanten blev aspireret, og MTT-formazon krystaller opløst i 150 pi DMSO. Plader blev igen inkuberet ved 37 ° C og omrørt i 10 minutter på en pladeryster. Absorbansen af ​​DMSO opløst MTT-formazon krystaller blev målt ved 570 nm. Kemo-følsomhed værdier blev udtrykt som% cellelevedygtighed af lægemiddelkoncentration, der inhiberede 50% cellevækst; og IC

50 værdier beregnet fra koncentration-effekt-forhold, ved hjælp af Graph Pad prisme Version 5.00.

Analyse af kombinerede lægemiddelvirkninger

Drug synergi blev bestemt ved isobologrammet og combination- indeks metoder, der stammer fra medianen effekt princippet om Chou og Talalay [34], ved hjælp af CalcuSyn software (Biosoft, Version 2.1). Data fra de væksthæmmende forsøgene blev anvendt til at udføre disse analyser. Isobologrammet metode er en grafisk repræsentation af den farmakologiske interaktion; og er dannet ved at vælge en ønsket fraktioneret påvirket celledrab (Fa). En lige linie blev trukket til at forbinde Fa plottede punkter mod eksperimentelt anvendte fast forhold kombinationer af lægemiddel (GCB) og kosten molekyle (BA eller TQ) på X- og Y-akserne for at generere isobologrammer. Kombination datapunkter, der faldt på linjen repræsenterede en additiv lægemiddelinteraktion; henviser til, at datapunkter, der var under eller over linjen repræsenterede synergi eller antagonisme, hhv. Kombinationen-indeks (Cl), en numerisk værdi blev beregnet ved formlen [35]: Hvor, C

A, X og C

B, x, var koncentrationerne af lægemiddel A anddrug B, der anvendes i kombination for at opnå x% lægemiddelvirkning. IC

x, A og IC

x, B var koncentrationerne af de enkelte agenter til at opnå den samme effekt.

Kombinationen-index (CI) metode er en matematisk og kvantitativ repræsentation af et to -drug farmakologiske interaktion. Ved hjælp af data fra væksthæmmende eksperimenter og edb-software, blev CI-værdier genereret over en vifte af Fa-niveauer 0,05-0,90 (5% -90% væksthæmning). En CI af en angivet en additiv virkning mellem de to agenter, mens et CI 1 eller CI 1 angivet, synergi eller antagonisme, henholdsvis.

Flowcytometrisk analyse til påvisning af apoptose

1 × 10

5 celler /ml /brønd af MIA PaCa-2 og PANC-1 var behandlet med BA, TQ, og GCB alene og i kombination i 48 timer. Celler blev vasket og farvet med Annexin-V-FITC antistof og PI, som pr fabrikantens anvisninger. Flowcytometrisk punktdiagram assay blev udført, og celler scannet for fluorescensintensitet i FL-1 (FITC) og FL-2 (PI) kanaler. Fraktionen af ​​cellepopulationen i forskellige kvadranter blev analyseret under anvendelse kvadrant statistikker. Celler i nederste højre kvadrant, repræsenteret apoptose; og i øverste højre kvadrant, nekrose eller post apoptotisk nekrose [36].

Måling af mitokondrie membranpotentiale

1 × 10

5 celler /ml /brønd af MIA PaCa-2 og PANC-1-celler blev behandlet med BA, TQ, og GCB alene og i kombination i 12-brønds plade i 48 timer. I den sidste 1 time inkubation, før ophør af eksponering blev cellerne farvet med rhodamin-123 (5 ug /ml). Celler blev vasket i PBS og centrifugeret ved 100 x g i 5 minutter og suspenderet i PBS. For at detektere ændringer i mitokondrie trans-membran potentiale (ψ), som følge af mitokondrie perturbation, blev et fald i fluorescensintensitet analyseret flow-cytometrisk på FL-1channel [37].

Udarbejdelse af helcellelysat og immunoblotting

Celler, (2 × 10

6/6 ml medium /60 mm vævskulturplade) påvirkes BA, TQ, og GCB alene og i kombination efter 48 timers behandling blev høstet ved trypsinisering og vasket med PBS.The pellet opnåede lyseret med iskold lysepuffer (50 mM Tris pH 8,0, 150 mMNaCl, 5 mM EDTA, 1% v /v Nonidet P-40, 1 mM PMSF og 1% (vol /vol) proteaseinhibitorcocktail) og holdt i 30 minutter på is med mellemliggende aflytning efter hvert 5 minut. Lysaterne blev centrifugeret ved 12000 g i 10 minutter ved 4 ° C og supernatanten opsamles til immunoblotting [38]. Den således indsamlede supernatant blev kvantificeret ved anvendelse af bicinchoninsyre-assay (BCA assay) kit fra Thermo Scientific. Til Western blot-analyse blev 50 ug totalt protein opløst på SDS-PAGE ved 60 V og derefter electro overført til PVDF-membran natten over ved 4 ° C under en 30 V strøm. Ikke-specifik proteinbinding blev blokeret med 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand indeholdende 0,1% Tween-20 (TBST), i 1 time ved stuetemperatur. Blottene blev probet med respektive primære mus /kanin /gede-anti humane antistoffer i 2 timer og vasket tre gange med TBST. Blottene blev derefter inkuberet med peberrodsperoxidase konjugeret sekundære antistoffer i 1 time, vasket igen tre gange med TBST og signaler detekteres, anvendelse af ECL plus kemi-luminescens kit på en røntgenfilm [38].

PKM2 aktivitetsassay

PKM2 aktivitet blev målt spektrofotometrisk (UV-1800, Shimadzu, Japan) under anvendelse af NADH /lactat dehydrogenase (LDH) koblet assay som tidligere beskrevet [39].

Statistiske analyse

data af forsøgene udført i tre eksemplarer blev udtrykt som middelværdi +/- SD, medmindre andet er angivet. Der blev foretaget sammenligninger mellem kontrol og behandlede grupper, ved hjælp af One-way ANOVA (Dunnett eller Tukey) og P-værdier. 0,01 blev betragtet som signifikante

Resultater

In vitro

kombinationsundersøgelser af gemcitabin med betulinsyre og thymoquinone

kemo-følsomhed i bugspytkirtelkræft cellelinjer, MIA PaCa-2 og PANC-1, mod narkotika GCB og kosten molekyler, BA eller TQ, blev afspejlet i cellevækst hæmning, beregnet af IC

50 (50% væksthæmning) ved 48 timer; og sammenlignet i første omgang med værdierne opnået i en kontrol cellelinie, FR2. IC

50 værdier, der opnås uafhængig behandling i de tre cellelinjer, MIA Paca-2, PANC-1 og FR2, er tilvejebragt i detaljer i tabel 1 (BA: 25 ± 0,9 pM, 23,5 ± 3,5 pM, 50 ± 1 uM; TQ 36 ± 0,28 uM, 23 ± 2 pM og 77 ± 2 pM; GCB 1 ± 0,66 uM, 5,5 ± 2,5 uM og 0,025 uM). Resultater blev analyseret med ensrettet ANNOVA-Dunnett viser en signifikant (p-værdi 0,01) effekt blandt behandles, på en dosisafhængig måde (figur 1). Baseret på disse resultater, blev et fast lægemiddel-forhold er valgt (GCB: BA eller GCB: TQ) over et område af lægemiddelkoncentrationer og anvendes i yderligere eksperimenter (figur 2). Kombination-indeks (Cl) blev anvendt til at analysere og bekræft synergisme observeret efter forbehandling af celler med kosten molekyle, efterfulgt af udsættelse for GCB i 48 timer (GCB: BA og GCB: TQ). De Cl-værdier, der giver et kvantitativt mål for graden af ​​interaktion, blev beregnet under anvendelse CalcuSyn software, ved Fa værdier på 0,50, 0,75, og 0,90 (Tabel 2). Isobologrammer konstrueret til disse værdier, svarende til 50%, 75% og 90% vækstinhibering, begge for MIA PaCa-2 og PANC-1-celler (figur 3) og Fa-CI plot, er tilvejebragt som figur S1. Tabel 3 viser de CI værdier ved Fa af 0,50-0,90 for kosten molekyler (BA eller TK) og stof (GCB). En sammenligning af monoterapi (BA, GCB, TQ) med kombination (CI

(GCB: BA) og CI

(GCB: TQ)) viste en signifikant forskel på p-værdi 0,01. ED-værdier i isolobologram for MIA PaCa-2 og PANC-1 nævnes i tabel S1. I MIA PaCa-2 celler, sensibiliseret med BA og fulgt med GCB eksponering, CI

(GCB: BA) værdier opnået ved doser (6.25:0.082 og 25:0.33) var 0,519, 0,889. Med TQ, CI

(GCB: TQ) ved doser (4.5:0.082; 9:0.15 og 36:0.66) viste værdierne af 0,721, 1,050, 0,681. Men i PANC-1 CI

, (GCB: BA) på (5:1.3 og 20:5.2) doser viste 0,766, 0,429 og med TQ CI

(GCB: TQ) ved doser (6.25:1.3 og 25:5.3), værdierne var 0,736, 0,371. CI værdier af 1; 0,5 og 1, repræsenteret synergisme stærk synergisme og antagonistisk virkning hhv. Synergien blev observeret over et bredt område af koncentrationer i begge de undersøgte pancreas tumorcellelinier. Synergistisk kombination af lægemidler, dvs. CI (kombination indeks) CI

(GCB: BA) (25 + 0,33) og CI

(GCB: TQ) (36 + 0,66) i MIA PaCa-2cell linje og CI

(GCB: BA) (20 + 5,25) og CI

(GCB: TQ) (25 + 5,25) i PANC-1, der repræsenterer Fa-værdi 0,75 (viser 75% inhibering), blev anvendt i resten af ​​assays . Men den normale cellelinie anvendt i undersøgelsen (FR2), til sammenligning som kontrol, viste, inhibering ved Fa-værdi på 0,75 0,90. Vores resultater viste, at virkningen af ​​kosten molekyler (BA eller TK) i de normale celler blev observeret ved en høj koncentration; mens kun en minimal dosis af GCB var påkrævet til inhibering af celleproliferation. I tilfælde af kombinationsundersøgelser, den samlede eksponering af gemcitabin til kræftcellerne var kun for 24 timer.

IC

50

værdi blev beregnet på

Menneskelig bugspytkirtel adenocarcinom

cellelinjer (A) MIA PaCa-2 (B) PANC-1 og (C) Normal cellelinje FR2: til individuel behandling af gemcitabin, Thymoquinone og betulinsyre i 48 timer (** betydelig som compaired at styre ved p-værdi. 0,01, n = 3) i-mellem de tre cellelinjer

(A) MIA PaCa-2 og (B) PANC-1 celler blev udsat for graduerede koncentrationer af betulinsyre, Thymoquinone eller gemcitabin enten alene eller i kombination med en fast dosisforhold betulinsyre vs. gemcitabin og Thymoquinone vs. Gemcitabin i 48 timer. (Gemcitabin

der eksponering i 24 timer kun i tilfælde af kombination), gemcitabin (firkanter),

betulinsyre og Thymoquinone

(cirkel) Gemcitabin + betulinsyre og Gemcitabin + Thymoquinone (trekant). (Mono terapi ( BA, GCB, TQ) Versus Kombinationer (CI

(GCB: BA), CI

(GCB: TQ).) (** signifikant forskel ved p-værdi 0,01, n = 3)

(a og B) Viser isolobolograms analyse af kombinationen af ​​gemcitabin, betulinsyre eller Thymoquinone i, (a) MIA Paca-2-celler med fast stof mellem 1:0.01 af GCB : BA og GCB: TQ

(B) PANC-1 celler med et fast stof mellem 1:0.2 af GCB: BA og GCB: TQ. De individuelle doser af gemcitabin, Betulinsyre og Thymoquinone, at opnå 90% (lige linje) vækstinhibering (Fa = 0,90), 75% (bindestreg linje) vækstinhibering (Fa = 0,75), og 50% (krydser) vækstinhibering ( fa = 0,50) blev plottet på x- og y-akserne. Kombination index (CI) værdier beregnet ved hjælp CalcuSyn software er repræsenteret ved punkter ovenfor (indicating- antagonisme mellem narkotika) eller under linierne (indicating- synergi). (X symbol) ED50, (plustegn) ED75 og (åben stiplede cirkel) ED90 (Monoterapi (BA, GCB, TQ) versus kombinationer (CI

(GCB: BA), CI

(GCB: TQ)) (***, signifikant forskel ved p-værdi 0,001, n = 3).

Vejviser

Tab af mitokondrie membranpotentiale

BA eller TQ forbehandlede MIA PaCa-2 og PANC-1-celler sammen med GCB i kombination og uafhængigt, når analyseret for Rh-123-optagelse ved flow cytometery, vises et tab på 11% og 17% mitochondriemembran Potential (MMP) i MIA Paca-2-celler behandlet med 0,33 uM og 0,66 uM GCB henholdsvis Mens i kombination, CI

(BA: GCB)., var thedecrease 77% sammenlignet med kontrollen (p-værdi 0,001) (figur . 4A) Men PANC-1 celler, som er relativt resistent over for GCB sammenlignet med MIA PaCa-2, viste et fald på 74% med BA alene og i kombination, CI

(GCB: BA), var nedgangen op to46%, sammenlignet med kontrollen (p-værdi 0,001). behandlingen med den individuelle dosis af GCB dvs. 5,25 uM, viste et fald på op til 13% (figur 4B). TQ alene eller i kombination med GCB viste ikke nogen ændring i MMP i både cellelinier. Tilsyneladende, BA equi-potent målrettet mitokondrie funktioner end TQ og GCB, i begge celletyper. I de ubehandlede kontrolceller, næsten alle celler var bio-energetisk aktiv, som det fremgår af høj Rh-123 fluorescens

(A) MIA PaCa-2:. Betulinsyre

alene og i kombination CI

(GCB: BA) med gemcitabin induceret tab af mitochondriemembranpotential (ψ), som ikke observeres i Thymoquinone og Gemcitabin hverken alene eller i kombination CI

(GCB: TQ). Celler blev farvet med rhodamin-123 (5 mg /ml) i 1 time og analyseret i FL-1 kanal af flowcytometer. Data i alle tal er repræsentative for en af ​​tre lignende eksperimenter. (B) Lignende undersøgelser blev udført i PANC-1-cellelinien, Betulinsyre alene inducerer mere tab af mitokondriemembran end i kombination med gemcitabin CI

(GCB: BA) også uden tab af mitokondrie membran blev observeret ved behandling med Thymoquinone og gemcitabin alene eller i kombination CI

(GCB: TQ) i 48 timer (kontrol vers Monoterapi (BA, TQ, GCB) og Kontrol vers Kombinationer (CI

(GCB:. BA), CI

( GCB: TQ)), (***, signifikant forskel ved p-værdi 0,001, n = 3)

Flowcytometrisk analyse- scoring af apoptotiske celler, behandlet med BA, TQ. og GCB, alene og i kombination

Den forbedrede cytotoksicitet af BA eller TQ forbehandling induceret apoptose var et spørgsmål, der skal besvares. BA eller TK forbehandlede celler sammen med GCB, i kombination og individuelt, produceret dosis afhængig stigning i apoptotisk og post apoptotisk cellepopulation i begge pancreas cancer cellelinjer, MIA PaCa-2 og PANC-1. i MIA PaCa-2, uafhængig behandling med BA (25 uM), TQ (36 uM) og GCB (0,33 uM og 0,66 uM) resulterede i 7%, 5%, 1% og 2% på apoptose hhv. I kombination, CI

(GCB: BA), produceret 11% og CI

(GCB: TQ) frembragte 6% (p-værdi 0,001) apoptose, whencompared at styre (figur 5A). Tilsvarende i PANC1 cellelinie, BA (20 uM), TQ (25 uM) og GCB (5,25 uM), individuelt producerede 9%, 8%, 7% på apoptose hhv. Mens i kombination, CI

(GCB: BA), og CI

(GCB: TQ), den steg til 11% og 12% (p-værdi 0,001), henholdsvis i forhold til kontrol (figur 5B) . I kombination behandling var der en stigning i hastigheden af ​​apoptose i både cellelinierne. BA produceret mere apoptotisk virkning individuelt og i kombination med GCB end GCB og TQ alene eller TQ i kombination med GCB i MIA PaCa-2; mens, blev revers observeret i PANC-1-celler.

(A) MIA PaCa-2-celler (1 x 10

5) blev inkuberet med angivne koncentrationer af Betulinsyre, Thymoquinone og gemcitabin

alene og i kombination CI

(GCB: BA), og CI

(GCB: TQ) for

48 timer og analyseret for annexinV-FITC /PI farvning til at bestemme apoptotisk cellepopulationer som beskrevet i Materialer og metoder afdeling. (B) Lignende undersøgelser blev udført med i Panc-1-celler efter behandling med angivne doser af Betulinsyre, Thymoquinone og gemcitabin alene og i kombination CI

(GCB: BA), og CI

(GCB: TQ) for 48 timer (kontrol versus monoterapi (BA, TQ, GCB) og kontrol versus kombinationer (CI

(GCB:. BA), og CI

(GCB: TQ)), (***, signifikant forskel på p-værdi 0,001, n = 3)

PKM2 udtryk og aktivitet

BA eller TQ forbehandling med en synergistisk dosis af Fa 0,75 sammen med GCB i kombination. (CI

GCB: BA og CI

GCB: TQ). i 48 timer i begge bugspytkirtelkræft cellelinjer, MIA PaCa-2 og PANC-1, viste et fald inPKM2 proteinniveau (figur 6A og B) Mens ved Fa 0.5 dvs. celler forbehandlet med BA (5 uM) og TQ (6,25 uM) i kombination med GCB (1,3 uM) i 48 timer, et fald blev observeret i Pro-Caspase-3-ekspression og PARP, uden nogen virkning på PKM2 ekspression, bortset fra en moderat fald i ekspression i PKM2 med TQ (figur 6C). aktiviteten af ​​PKM2 viste imidlertid en stigning inuntreated MIA PaCa-2-celler og et fald i de behandlede celler med BA (25 uM) , TQ (36 uM) og GCB (0,33 uM og 0,66 uM); som forstærkes i kombination (CI

GCB: BA og CI

GCB: TQ) (figur 7A). Mens i tilfælde af Panc-1-celler, de således opnåede resultater var omvendt i un-behandlede celler, som udviste en nedsat aktivitet af PKM2 og en stigning i aktiviteten i de behandlede celler alene eller i kombination (figur 7B).

(A) MIA PaCa-2 og (B) PANC-1 synergieffekter doser ved Fa 0,75 af betulinsyre og Thymoquinone blev anvendt alene og i kombination CI

(GCB: BA) og CI

(GCB: TQ) med Gemcitabin

fra blots blev det observeret, at der var et fald i udtryk for PKM2 når de behandles i kombination doser.. (C) PANC1 cellelinje doser ved Fa 0,5 af betulinsyre, Thymoquinone og Gemcitabin blev anvendt alene og i kombination, og fra blottene vi observeret, at der var et fald i Pro-Caspase-3 efterfulgt af fald i PARP og et mindre fald er observeret i Thymoquinone behandlet i PKM2.

(A) MIA PaCa-2 celler behandlet med betulinsyre, Thymoquinone og Gemcitabin alene og i kombination, CI

(GCB : BA) og

CI

(GCB: TQ) på 48 timer. Et fald i aktiviteten i behandlede celler efterfulgt med

mere

falde

i kombination (er), CI

(GCB: BA)

og CI

(GCB: TQ),

i forhold til blev observeret kontrol

(B)

i PANC-1 cellelinje omvendt var observeret. Kontrol versus monoterapi (BA, TQ, GCB) og kontrol versus kombinationer (CI

(GCB: BA) CI

(GCB: TQ)), (***, signifikant forskel ved p-værdi 0,001, n = 3)

diskussion

pancreas tumorer, der er refraktære over for Gemcitabin terapi udgør en udfordring for onkologer. Terapier, der i dag anvendes til behandling af kræft i bugspytkirtlen har vist skuffende effekt; og erhvervelse af resistens under kemoterapi er en stor udfordring. Således nye strategier har brug for at blive sat på plads for at udvikle nye kemo-forebyggende og /eller kemo-terapeutiske midler, der ville forbedre det kliniske resultat af denne sygdom. Voksende beviser opfordrer til brug af kosten molekyler og tilskud i kosten til at forøge respons af standard cancer kemoterapeutika. Tidligere har flavonoider blevet rapporteret at inaktivere ofte deregulerede veje, såsom Akt og NF-KB, inden for bugspytkirtelkræft, der bidrager til cellevækst, metastase og kemo modstand. Genistein, et diætetisk forbindelse, har vist sig at øge antitumoraktiviteten af ​​erlotinib og gemcitabin i eksperimentelle systemer af pancreascancer [40]. Tidligere er det også blevet påvist, at Garcinol, et kosten molekyle, synergistisk med gemcitabin til at hæmme celledeling og inducerer apoptose i MIA PaCa-2 celler med betydelig modulation af vigtige cancer regulatorer, herunder

PARP

,

VEGF

,

MMP’er

,

IL’er

, caspaser, og

NF-KB

[

41

]. Curcumin, et kosten komponent, sensibiliserer bugspytkirtelkræft til gemcitabin

in vitro

in vivo. In vitro

blev curcumin vist at inhibere proliferationen af ​​forskellige pancreas cancercellelinier, potensere apoptose induceret af gemcitabin, og inhibering konstitutiv NF-KB-aktivering i cellerne.

In vivo

, tumorer fra nøgne mus injiceret med bugspytkirtelkræftceller og behandlet med en kombination af curcumin og gemcitabin viste en signifikant reduktion i volumen (

P

= 0,008 over for kontrol;

P

= 0,036 vs gemcitabin alene) [42]. I vores eksperimenter, en kombineret interaktion af betulinsyre (BA) eller thymoquinone (TQ), de to Neutraceuticals med gemcitabin (GCB), i GCB-følsomme-MIA Paca-2 og GCB-resistente-Panc-1 – bugspytkirtelkræft cellelinjer viste synergi. Den levedygtighed assay afslørede en synergistisk cytotoksisk vekselvirkning mellem GCB og BA eller GCB og TQ i både GCB-følsomme og resistente cellelinjer, som fastsat af DRI (Dosisreduktion Index) i 1 fås fra CalcuSyn [43]. Mekanistisk, GCB medierer sine cytotoksiske virkninger ved at hæmme reparationssyntese trin gennem sin indsats som en ribonucleotid-reduktase-hæmmer, nedbryder de intracellulære deoxy-nukleotid puljer, og styrke potentialet i sin egen inkorporering i nyligt syntetiseret DNA. Når inkorporeret i DNA, analogen forårsager ophør af DNA-syntese og er modstandsdygtig over for fjernelse ved exonukleaser, hvilket resulterer i DNA-strengbrud [44]. Betulinsyre (BA), en nutraceutical, er blevet vist at inducere apoptose gennem mitokondrielle veje, hvor der i denne proces både den mitochondriale ydre og indre membraner er permeabiliserede, hvilket resulterer i frigivelse af opløselige proteiner, såsom cytochrom c, Smac eller AIF, fra mitokondrie mellemrum i cytosolen [45]. BA inducerer også deathin flere forskellige cancer cellelinjer gennem flere veje, som omfatter p53-uafhængig induktion af p21 /WAF1, opregulering af død receptorer, hæmning af specificitet protein (Sp) transkriptionsfaktorer [46]. Tilsvarende Thymoquinone (TQ) inducerer apoptose i tumorceller ved adskillige mekanismer, herunder NF-kB undertrykkelse, Akt aktivering og ekstracellulære signal-regulerede kinase signalveje, og også ved at hæmme tumorangiogenese [47]. På grundlag af ED

50, ED

75 og ED

90 lægemiddelkombinationer, isobologrammer blev dannet og synergien vurderes ved brug CalcuSyn. Betulinsyre (BA) eller Thymoquinone (TQ) i kombination med gemcitabin (GCB), ved multiple lægemiddelkoncentrationer, viste, at i GCB-sensitive-MIA PaCa-2 og GCB-resistent-PANC-1 celler, kombinationen index (CI) var under 0,88 ved Fa på 0,75 (75% reduktion af cellevækst) i MIA PaCa-2-celler. Og i tilfælde af PANC-1, kombinationen indeks (Cl) var under 0,76 ved Fa på 0,5. Det biologiske grundlag for denne synergi var klart i differentierede ændringer i apoptose med både kosten molekyler. Selvom mekanisk vores kombinationer er “gensidigt ikke-eksklusive” i naturen, men begge kosten molekyler viste en signifikant forskel i quantum af cytotoksicitet induktion sammenlignet med stå alene GCB. Men hastigheden af ​​apoptose induktion ved BA i kombination med GCB var mere effektiv i både cellelinier, end TQ i kombination med GCB. Også mindske i transmembrane mitokondriepotentialet (Ψ), blev observeret, når BA alene eller i kombination med GCB blev leveret til begge cellelinier. Ingen ændring blev imidlertid observeret på transmembrane mitokondriepotentialet (Ψ), når cancercellelinier blev behandlet med GCB alene.