PLoS ONE: Undertrykkelse af kolorektal cancer levermetastaser ved Apolipoprotein (a) Kringle V i en nøgen musemodel gennem induktion af apoptose i tumor-associerede endotelceller

Abstrakt

Dannelsen af ​​levermetastaser i kolorektal cancer patienter er den primære årsag til patientens død. Aktuelle behandlinger rettet mod levermetastaser fra kolorektal cancer har haft minimal indflydelse på patientresultater. Derfor er der behov for udvikling af alternative behandlingsstrategier for levermetastaser. I den foreliggende undersøgelse påviste vi, at rekombinant humant apolipoprotein (a) kringle V, også kendt som rhLK8, inducerede den apoptotiske omsætning af endotelceller

in vitro

gennem mitokondriske apoptose pathway. Interaktionen af ​​rhLK8 med glucose-reguleret protein 78 (GRP78) kan være involveret i induktionen af ​​apoptose, fordi inhiberingen af ​​GRP78 af grp78-specifikke antistoffer eller siRNA knockdown inhiberede rhLK8-medieret apoptose af humane navlevene-endotelceller

i vitro

. Dernæst at vurdere virkningerne af rhLK8 på angiogenese og metastase, blev en eksperimentel model for levermetastaser etableret ved injektion af en human colorektal cancer cellelinie, LS174T, i milt fra BALB /c nøgne mus. Den systemiske administration af rhLK8 betydeligt undertrykt levermetastaser fra humane kolorektal cancer celler og forbedret vært overlevelse sammenlignet med kontroller. Kombinationen af ​​rhLK8 og 5-fluorouracil væsentligt forøget disse overlevelses fordele sammenlignet med enten behandling alene. Histologisk observation viste signifikant induktion af apoptose blandt tumorassocierede endotelceller i levermetastaser fra rhLK8-behandlede mus sammenlignet med kontrolmus. Kollektivt, disse resultater tyder på, at kombinationen af ​​rhLK8 med konventionel kemoterapi kan være en lovende tilgang til behandling af patienter med livstruende kolorektale kræft levermetastaser

Henvisning:. Ahn JH, Yu HK, Lee HJ, Hong SW, Kim SJ, Kim JS (2014) Undertrykkelse af kolorektal cancer levermetastaser ved Apolipoprotein (a) Kringle V i en nøgen musemodel gennem induktion af apoptose i tumor-associerede endotelceller. PLoS ONE 9 (4): e93794. doi: 10,1371 /journal.pone.0093794

Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Republikken Korea

Modtaget: December 10, 2013; Accepteret: 7 mar 2014; Udgivet: April 3, 2014

Copyright: © 2014 Ahn et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Green Cross Corporation, et tilskud fra Korea Health 21 R Sigma, St. Louis, MO, USA) i 30 minutter ved 37 ° C, og apoptose blev vurderet ved chromatinkondensering nuklear anvendelse af en fluorescens mikroskop (Olympus BX51, Olympus, center Valley, PA, USA) [22]. Tilfældige mikroskopiske felter blev undersøgt for hver forsøgsgruppe tilstand, og procentdelen af ​​celler, som blev undergår apoptose i hvert felt blev bestemt.

Western blotting af apoptose-relaterede proteiner

Celler blev lyseret i Triton lysis puffer [137 mM NaCl, 2 mM EDTA, 10% glycerol, 1% Triton X-100, og 20 mM Tris-HCI (pH 8,0)] indeholdende proteaseinhibitorer. En portion af hvert lysat blev separeret ved SDS-PAGE under anvendelse af geler polymeriseret ud fra 4-20% acrylamid i Tris /Glycine buffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), og immunoblotting blev udført med antistoffer mod procaspase-3, procaspase-9 ( cellesignalering, Beverly, MA, USA), spaltet caspase-3 og procaspase-8 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Eluerede prøver af co-immunopræcipitationsforsøg blev også udsat for SDS-PAGE, og de elektroforesebehandlede proteiner blev overført til nitrocellulosemembraner. Hver membran blev inkuberet med muse-anti-grp78 antistoffer (BD Biosciences; 1:1,000) eller kanin-anti-His antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californien, USA; 1:1,000) og derefter med peroxidase-konjugeret anti-muse eller anti-kanin-antistoffer (KPL, Gaithersburg, MD, USA; 1:5,000).

Fraktionering af Cytosolisk og membranbundne proteiner

Cytosoliske og membranfraktioner blev fremstillet ved selektiv plasma membranpermeabilisering med digitonin, efterfulgt af membranen solubilisering [23]. Kort beskrevet blev celler behandlet med 0,05% digitonin i isotonisk buffer A [10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl

2, og 1 mM EGTA (pH 7,4)] indeholdende proteaseinhibitorer [1 mM 4- (2- aminoethyl) benzensulfonylfluorid hydrochlorid, 0,8 pM aprotinin, 50 uM bestatin, 15 uM E-64, 20 uM leupeptin, og 10 uM pepstatin A] i 2 minutter ved stuetemperatur. De permeabiliserede celler blev opsamlet ved 4 ° C. Efter centrifugering ved 15.000 x g i 10 minutter, blev supernatanten (cytosol fraktion) og (membranfraktion) pelletten indsamlet særskilt. For at frigøre membran-og organel-bundne proteiner blev pelleten yderligere ekstraheret med iskold 1% Nonidet P-40 i puffer A indeholdende proteaseinhibitorer i 60 min ved 4 ° C. Både cytosol og membran fraktioner blev analyseret ved Western blotting hjælp antistoffer mod cytochrom c (BD Biosciences).

Konstruktion af Expression Vector for glucose-reguleret protein 78 (GRP78) og forbigående transfektion til HEK293 celler

GRP78

genet blev opformeret ved PCR ved hjælp af følgende primere: fremad (5′-TTT TTT GGA TCC ATG AAG CTC TCC CTG GTG GCC-3 ‘) og omvendt (5’-TTT TTT GCG GCC GCT CTA CAA CTC ATC TTT TTC TGC-3 ‘), og derefter klonet i den eukaryote ekspressionsvektor pcDNA3.1-myc-His (-) b (Invitrogen). Transient transfektion af HEK-293-celler med de

GRP78

ekspressionsvektor blev udført under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) reagenser ifølge producentens instruktioner. Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne vasket 3 gange med phosphatbufret saltvand (PBS), høstet ved skrabning, og centrifugeret i 5 min ved 500 x g. De opsamlede celler blev lyseret ved anvendelse af IP-buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCI, pH 7,6) indeholdende 1% NP-40, og celleekstrakter blev analyseret ved Western blotting.

Co-immunfældning af rhLK8- bindende Proteiner

HEK293 celler transficeret med

GRP78

ekspressionsvektorer blev opsamlet og ekstraheret under anvendelse af lysepuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 1% NP-40, 1 × proteaseinhibitor, og 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid, pH 7,6). Celleekstrakterne blev blandet natten over ved 4 ° C med 10 ug monoklonale anti-HA-antistof, 2 ug HA-mærkede rhLK8, og protein G-agarose (Sigma). De immunoadsorbenter blev udvundet ved centrifugering i 5 minutter ved 700 x g, vasket tre gange, og centrifugeret (5 minutter ved 700 x g) i IP-buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,1% NP-40, pH 7,6). Pellets blev resuspenderet i 30 pi SDS-PAGE loading buffer (Sigma) og analyseret ved Western blotting.

siRNA Transfektion

HUVEC’er blev trypsiniseret, talt og fortyndet i antibiotika-fri EGM- 2 medium til 2,5 × 10

5 celler /ml for transfektion med Dharma

fect

1 (Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO, USA), i henhold til producentens anvisninger. Kort beskrevet blev HUVEC’er udpladet i 100 mm skåle og inkuberet ved 37 ° C med 5% CO

2 natten over. En milliliter af 2 uM ON-TARGETplus SMARTpool siRNA (Thermo Fisher Scientific) mod

GRP78

fortyndet i 1 × siRNA Buffer (rør-1) og Dharma

fect

1 (tube-2) fortyndet med serum-frit medium blev sat i separate rør, inkuberet i 5 minutter ved stuetemperatur, blandet sammen, og derefter inkuberet i 20 minutter ved stuetemperatur. De inkuberede blandinger af siRNA og Dharma

fect

1 blev fortyndet i 8 ml serum-frit medium og efterfølgende tilsat til 100 mm skål med HUVEC-monolag. Efter 24 timer blev transfektionsmediet udskiftet med komplet medium indeholdende FBS og vækstfaktorer. To dage efter transfektion blev HUVEC’er splittet, og på den 4. dag, de blev høstet eller genudpladet til andre eksperimenter.

Analyse af rhLK8 Binding til GRP78 på HUVEC’er ved flowcytometri

For at måle bindingen af ​​rhLK8 til GRP78 proteinet på overfladen af ​​HUVEC’er blev rhLK8 mærket med FITC under anvendelse af et FITC-mærkning kit (Sigma) i overensstemmelse med producentens anvisninger. HUVEC’er, der var blevet transduceret med scrambled siRNA eller GRP78-specifikke siRNA blev trypsiniseret og neutraliseret med trypsin neutraliserende opløsning (Lonza). 5 × 10

5 HUVEC’er blev farvet under anvendelse af FITC-mærkede rhLK8 eller GRP78 antistoffer i 1,5 timer ved 4 ° C, vasket med PBS 3 gange, og analyseret ved flowcytometri med en FACS Caliber (BD Biosciences).

Animal Model for Experimental levermetastaser

athymiske BALB /c nøgne mus blev bedøvet med en intraperitoneal (ip) injektion af ketamin /xylazin (Sigma). Milten blev derefter blotlagt gennem en venstre laterale flanke indsnit. Ca. 3 x 10

5 LS174T humane colorektale carcinomaceller (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) i 100 pi Hanks balancerede saltopløsning blev injiceret i milten parenkym anvendelse af en 27-gauge nål. Den bughinden og hud blev lukket i to lag med metalclips. Fra dagen for tumorcelleinokulering, mus havde daglig i.p. administrationer 2, 10 og 50 mg /kg rhLK8 i to uger. Desuden kontrol og rhLK8 (2, 10 eller 50 mg /kg) -behandlede mus blev anvendt i overlevelse eksperimenter (n = 10 /hver gruppe).

For at undersøge den terapeutiske effektivitet af rhLK8 behandling i kombination med en konventionel kemoterapi, blev musene injiceret med LS174T celler randomiseret i fire grupper (n = 5 pr gruppe) og behandlet som følger: (1) daglig ip administration af vehikel (100 mM NaCl, 150 mM L-glycin, pH 4,2); (2) i.p. injektion af 5-fluoruracil (5-FU; 8 mg /kg /dag) i de første fem dage efter milten injektion; (3) dagligt i.p. injektion af rhLK8 (10 mg /kg); og (4) dagligt intraperitonealt administration af rhLK8 (10 mg /kg) og i.p. injektion af 5-FU (8 mg /kg /dag) i de første fem dage efter milten injektion. Kontrol- og rhLK8-behandlede mus blev også anvendt i overlevelse eksperimenter (n = 10 mus per gruppe) eller blev aflivet ved CO

2 inhalation 2 uger efter behandling, på hvilket tidspunkt levere blev opsamlet, vejet og analyseret for at bestemme overfladen tumor nodule numre eller blev udsat for histologisk og immunhistokemisk undersøgelse.

Etik Statement

Alle kirurgiske procedurer blev godkendt af det Dyreetiske Komité Mogam Biotechnology Research Institute eller Korea Research Institute for Bioscience og Bioteknologi (KRIBB-AEC-13011), og alle bestræbelser blev gjort for at minimere lidelse. Pleje administreres til dyrene var i overensstemmelse med retningslinjerne for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health.

Histologi og Immunhistokemi

For at tælle intra-leverknuder, det tumor- forsynet levere blev dissekeret, fikseret med 10% neutral bufret formalin natten over, indlejret i paraffin, og opdelt i 4 um skiver. Snit blev farvet med hematoxylin og eosin (H Miles, Elkhart, IN, USA) forbindelse, lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -70 ° C. Frosne væv til CD31 /PECAM-1 og /eller terminal deoxynucleotidyltransferase-medieret dUTP nick-endemærkning (TUNEL) -farvning blev fremstillet og fikseret i kold acetone. TUNEL-assayet blev udført med et kommercielt tilgængeligt apoptose afsløring kit (Promega, Madison, WI, USA) med nogle ændringer. Immunhistokemi procedurer blev udført, og alle antistoffer og midler til immunohistokemi blev erhvervet fra kilder som tidligere [24] beskrevne. Kontrolprøver udsat for sekundært antistof alene viste ingen specifik farvning. De farvede sektioner blev undersøgt under et Olympus BX51 mikroskop (Olympus) udstyret med et Olympus DP71 12.5 megapixel digitalt mikroskop kamera.

Immunfluorescerende Dobbelt Farvning for CD31 /PECAM-1 (endotelceller) og TUNEL

Den TUNEL-assayet blev udført efter CD31 /PECAM-1 immunfluorescensfarvning som tidligere [24] beskrevne. Vævsprøver blev inkuberet med 300 ug /ml Hoechst 33342 farve i 1 minut ved stuetemperatur. Propylgallat blev placeret på hver dias og derefter dækket med et dækglas (Fischer Scientific, Fair Lawn, NJ, USA). Endotelceller blev visualiseret med rød fluorescens, og fragmenteret DNA (TUNEL-assay) blev visualiseret med grøn fluorescens. Co-lokalisering af røde og grønne signaler produceret gule signaler (apoptotiske endotelceller).

Statistical Analysis

Data er præsenteret som middelværdi ± SD. Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af Students

t

-test, med undtagelse af de

in vivo

overlevelse eksperimenter, som vi brugte log-rank analyse af en Kaplan-Meier overlevelse kurve. En værdi på

s

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Effekter af rhLK8 på endotel Cell Apoptose in vitro

For at bestemme virkningerne af rhLK8 på endotelcelle apoptose, blev HUVEC-monolag inkuberet i EBM-2 indeholdende 1% FBS i nærvær eller fravær af 3 ng /ml bFGF og behandlet med forskellige koncentrationer af rhLK8 (0,1-5 uM) i 12 eller 24 timer. Apoptotiske endotelceller blev identificeret ved cellekernemorfologi efter farvning med Hoechst 33.452 (fig. 1A). Behandling med rhLK8 signifikant inducerede apoptose af HUVEC’er på en tids- og dosisafhængig måde i fravær (fig. 1B) eller nærvær (fig. 1C) af angiogene faktorer, såsom 3 ng /ml bFGF.

HUVEC monolag blev inkuberet i EBM-2 indeholdende 1% FBS i nærvær eller fravær af 3 ng /ml bFGF og behandlet med forskellige koncentrationer af rhLK8 (0,1-5 uM) i 12 eller 24 timer. Endotel apoptose blev vurderet ved nukleare morfologi efter farvning med Hoechst 33452.

(A)

Repræsentative mikrofotografier af kontrol (

venstre

) eller rhLK8 (5 uM) -behandlede HUVEC’er (

højre

) i nærvær af 3 ng /ml bFGF i 12 timer. Apoptotiske endotelceller er angivet med pile.

B

og

C

, procentdelen af ​​celler undergår apoptose blev bestemt i celler behandlet med forskellige koncentrationer af rhLK8 i fravær (

B

) eller tilstedeværelse (

C

) af bFGF efter 12 (

fyldte søjler

) eller 24 timer (

åbne barer

). Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD. (

D-F

) HUVEC’er blev inkuberet med rhLK8 (5 uM) for forskellige tidsperioder som angivet. Celler blev derefter opsamlet og lyseret, og helcelleproteiner blev separeret ved SDS-PAGE. (

D

) Aktiveringen af ​​caspase-3 blev bestemt ved Western blotting under anvendelse af antistoffer mod procaspase-3 eller en 20 kDa forarbejdet form af caspase-3, som angivet. (

E

) Western blotting under anvendelse af antistoffer mod procaspase-9 blev udført for at bestemme aktiveringen af ​​caspase-9. Actin (

nedre panel

) blev anvendt som en loading kontrol. (

F

) Cytosolisk og membranbundne proteiner blev fremstillet som beskrevet i “Materialer og metoder” og blev analyseret ved Western blotting under anvendelse af antistoffer mod cytochrom c til bestemmelse af frigivelse af cytochrom c i cytosolen. Proteinprøver lastet på

bane C-16

blev fremstillet ud fra celler inkuberet uden rhLK8 i 16 timer. De viste immunoblots er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. (Gentagelser af fig. 1D, 1E, og 1F findes i fig. S1).

Caspase-3 og caspase-9 Aktivering og cytochrom C Udledning i cytosolen ved rhLK8

for at undersøge de biokemiske karakteristika rhLK8-induceret apoptose af HUVEC’er, vi først testet effekten af ​​rhLK8 om aktivering af en effektor caspase, caspase-3, som er et vigtigt skridt i apoptose. HUVEC’er behandlet med rhLK8 (5 uM) viste reducerede niveauer af 32-kDa procaspase-3, men forøgede niveauer af det 20-kDa forarbejdet fragment af caspase-3 (fig. 1 D og fig. S1A), hvilket indikerer aktiveringen af ​​caspase-3 . Spaltning af et caspase-3 substrat, poly ADP-ribose polymerase, blev også påvist i rhLK8-behandlede HUVEC’er (data ikke vist). Effektor caspaser aktiveres nedstrøms for caspase-8 eller caspase-9, som er de initiator-caspaser, der er involveret i signalering gennem to forskellige apoptotiske veje, død receptoren og mitokondrielle veje henholdsvis [25]. At afgøre, hvilken vej er ansvarlig for rhLK8-induceret endotelcelle apoptose, testede vi virkningerne af rhLK8 (5 uM) på aktiveringen af ​​caspase-8 eller caspase-9. Niveauet af procaspase-9 blev reduceret betydeligt i rhLK8-behandlede HUVEC’er sammenlignet med kontrolceller (fig. 1 E og fig. S1B), hvorimod ingen forskel i niveauet af procaspase-8 blev observeret (data ikke vist), hvilket indikerer, at mitokondrielle pathway (også kendt som den indre vej) var involveret. Fordi mitokondrie er initieret af frigivelse af cytochrom c og andre polypeptider fra mitokondrie intermembrane plads i cytosolen, vi undersøgte cytochrom c-frigivelse i rhLK8-behandlede HUVEC’er. rhLK8 (5 uM) forårsagede en tidsafhængig reduktion i niveauet af cytochrom c i mitokondriemembranen, mens niveauet af cytosolisk cytochrom c samtidig blev øget (fig. 1 F og fig. S1c).

rhLK8 interagerer med GRP78

for nylig har plasminogen kringle V (PK5) blevet rapporteret at inducere caspase-afhængig apoptose af tumorceller og endotelceller ved at binde til GRP78 på celleoverfladen [26]. Baseret på den høje sekvenshomologi mellem PK5 og rhLK8 testede vi muligheden for, at rhLK8 kan inducere apoptose af endotelceller ved interaktion med GRP78. Vi blandede ekstrakterne fra HUVEC’er eller HEK293-celler der udtrykker His-mærket GRP78 med 10 ug af monoklonalt anti-HA-antistof, 2 ug HA-mærkede rhLK8, og protein G-agarose og de immunoprecipitants blev immunoblottet med anti-GRP78 eller anti-His antistoffer. Både endogene GRP78 i HUVEC’er (fig. 2A og fig. S2A) og His-mærket GRP78 i HEK293-celler (fig. 2B og fig. S2B) klart bundet til rhLK8 tilsat til co-immunopræcipitering blanding. Men ingen GRP78 protein blev opdaget, da co-immunopræcipitationsassay blev udført i fravær af HA-mærket rhLK8 protein.

For immunpræcipitering (

IP

) eksperimenter, celle ekstrakter af (

Et Salg) HUVEC’er eller (

B

) HEK293-celler der udtrykker 6 × His-mærket GRP78 protein blev blandet natten over ved 4 ° C med 10 ug HA monoklonale antistof, 2 ug HA-mærkede rhLK8, og protein G-agarose. Eluerede prøver blev separeret ved SDS-PAGE. GRP78 bundet til rhLK8 blev påvist ved Western blot (

WB

) anvendelse af et anti-GRP78 monoklonalt antistof eller anti-His-antistof. For at bestemme bindingen af ​​rhLK8 til GRP78 proteinet på overfladen af ​​HUVEC’er, HUVEC’er som var blevet transduceret med scrambled siRNA eller

GRP78-

specifikke siRNA blev høstet og farvet med (

C

) FITC -mærket rhLK8 eller (

D

) anti-GRP78 antistoffer og analyseret ved flowcytometri. Ufarvede celler eller celler farvet med FITC-mærket sekundært antistof kun blev anvendt som negativ kontrol. Data er repræsentative for to uafhængige forsøg. (Gentagelser af fig. 2A og 2B er tilgængelige i fig. S2).

rhLK8 Binder til GRP78 udtrykkes på overfladen af ​​HUVEC’er

For at bestemme om rhLK8 binder til GRP78 udtrykt på overfladen af ​​HUVEC’er, HUVEC’er blev behandlet med enten den specifikke siRNA for

GRP78

eller krypteret siRNA, farvet med FITC-konjugeret rhLK8 eller anti-GRP78 antistoffer, og analyseret ved flowcytometri. Både rhLK8 og GRP78 antistoffer bundet til overfladen af ​​HUVEC’er transduceret med kontrol siRNA i en dosisafhængig måde, mens bindingen af ​​rhLK8 og GRP78 antistoffer blev nedsat i HUVEC’er transduceret med

GRP78

-specifik siRNA (Fig. 2C og 2D).

rhLK8 inducerer apoptose af endotelceller in vitro ved at interagere med GRP78

for at bestemme om grp78 proteiner er involveret i rhLK8-induceret apoptose af endotelceller, HUVEC’er blev behandlet med en antistof mod GRP78 før behandling med rhLK8. Behandling med en GRP78 antistof formindskede signifikant niveau af den aktive caspase-3 i HUVEC’er sammenlignet med kontrolceller, hvilket indikerer, at GRP78 kan spille en rolle i rhLK8-medieret endotelcelle apoptose (fig. 3A og fig. S3A). Disse data støttes yderligere af resultaterne viser, at apoptose i HUVEC’er med GRP78 siRNA knockdown var ikke anderledes med eller uden behandling med rhLK8 (fig. 3B og fig. S3B-D), hvorimod apoptose af HUVEC’er transficeret med scrambled siRNA var signifikant induceret ved behandling med rhLK8, som bestemt ved stigningen i aktiv caspase-3 og faldet i procaspase-9 (fig. 3B og fig. S3B-D). Konsekvent, GRP78 antistof behandling eller

GRP78

knock-down af siRNA transfektion afskaffet rhLK8-induceret apoptose af HUVEC’er på celleniveau, som vurderet med antallet af apoptotiske celler (fig. 3C).

(

A

) at bestemme om GRP78 kan være involveret i rhLK8-medieret endotelcelle apoptose, blev HUVEC monolag behandlet med rhLK8 (1 eller 5 uM) efter forbehandling med 5 ug GRP78 antistof i 30 min. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (

B

) HUVEC’er transficeret med røræg siRNA eller

GRP78

-specifikke siRNA blev behandlet med 5 uM rhLK8. Den efterfølgende induktion af apoptose blev påvist ved antistoffer mod aktiv caspase-3 eller procaspase-9. Ekspressionen af ​​GRP78 blev påvist ved anti-GRP78 monoklonalt antistof. GAPDH blev anvendt til lastning kontrol. Data er repræsentative for to uafhængige forsøg. (C) HUVEC’er behandlet med GRP78 antistof eller transficeret med

GRP78

-specifikke siRNA blev behandlet med rhLK8 (5 uM) og endothelial apoptose blev vurderet ved cellekernemorfologi efter farvning med Hoechst 33452. Repræsentative mikrofotografier er vist. Apoptotiske endotelceller er angivet med pile. De forstørrelser × 100. (Gentagelser af fig. 3A og 3B er tilgængelige i fig. S3).

Behandling med rhLK8 Undertrykker Vækst af intramilt indsprøjtet LS174T Celler i leveren

Da angiogenese er afgørende for Actin blev anvendt som en loading kontrol.