PLoS ONE: Esophageal Cancer Metabolit biomarkører opdaget ved LC-MS og NMR Methods

Abstrakt

Baggrund

Esophageal adenocarcinom (EAC) er en sjældent helbredes sygdom og stiger hurtigt på verdensplan i forekomsten. Barret øsofagus (BE) og high-grade dysplasi (HGD) betragtes væsentlige risikofaktorer for invasiv adenokarcinom. I den aktuelle undersøgelse blev fordomsfri global metaboliske profilering metoder anvendes på serumprøver fra patienter med ØK, BE og HGD, og ​​raske personer, for at identificere metabolit baserede biomarkører forbundet med de tidlige stadier af ØK med det formål at forbedre prognosticering.

Metode /vigtigste resultater

Serum metabolit profiler fra patienter med ØK (n = 67), BE (n = 3), HGD (n = 9) og raske frivillige (n = 34) var opnået ved anvendelse af højtydende væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) metoder. Tolv metabolitter afveg signifikant (

s

0,05) mellem EAC patienter og raske kontrolpersoner. En delvis mindste kvadraters diskriminant analyse (PLS-DA) modellen havde god nøjagtighed med arealet under modtageren udløsende karakteristikken (AUROC) på 0,82. når resultaterne af LC-MS blev kombineret med 8 metabolitter påvises ved kernemagnetisk resonans (NMR) i en tidligere undersøgelse, kombinationen af ​​NMR og MS detekteret imidlertid metabolitter givet en langt bedre ydeevne, med AUROC = 0,95. Endvidere middelværdier for 12 af disse metabolitter varierede konsekvent fra raske kontrolpersoner til højrisikopersoner (BE og HGD patienter) og ØK emner. Ændrede metaboliske veje, herunder en række aminosyre veje og energiomsætning blev identificeret baseret på ændrede niveauer af talrige metabolitter.

Konklusioner /Betydning

Metaboliske profiler afledt fra kombinationen af ​​LC-MS og NMR metoder let skelne EAC patienter og potentielt lover vigtige ruter til forståelse af carcinogenese og påvisning af kræft. Forskelle i de metaboliske profiler mellem højrisikopersoner og ØK angiver muligheden for at identificere de patienter med risiko langt tidligere til udviklingen af ​​kræft

Henvisning:. Zhang J, Bowers J, Liu L, Wei S , Gowda GAN, Hammoud Z, et al. (2012) i spiserøret Kræft Metabolit biomarkører opdaget ved LC-MS og NMR metoder. PLoS ONE 7 (1): e30181. doi: 10,1371 /journal.pone.0030181

Redaktør: Philippe Rouet, I2MC INSERM UMR U1048, Frankrig

Modtaget: September 22, 2011; Accepteret: 12. december, 2011; Udgivet: 23 januar, 2012 |

Copyright: © 2012 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Purdue University center for Cancer Research og onkologisk Sciences center i Discovery Park ved Purdue. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i spiserøret er en dødelig sygdom med en anslået 16,640 nye tilfælde og 14.500 dødsfald i USA i 2010 [1]. I år 2000 de tilsvarende tal var 12.300 og 12.100, henholdsvis [2], der indikerer en betydelig stigning i forekomsten. Af de to kræfttyper, esophageal adenocarcinom (EAC) og pladecellecarcinom, ØK er mere udbredt i USA. Selv risikofaktorer forbundet med ESS ikke er klart forstået til dato, er Barretts øsofagus (BE), der anses for at være en faktor for carcinogenese i [3] spiserøret. Desuden er high-grade dysplasi (HGD) betragtes som en umiddelbar forløber for invasiv adenokarcinom [4]. findes imidlertid ingen intervention i øjeblikket, der kan forhindre progression af BE eller HGD til ØK [5]. De traditionelle fremgangsmåder til diagnosticering af esophageal cancer, herunder endoskopi og barium sluge, lider under utilstrækkelig specificitet og følsomhed, som typisk resultere i påvisning af sygdommen på et tidligt stadium [6], [7], [8], [9]. Alternativt er det håbet, at en vis delmængde af molekylære biomarkører kan karakterisere den fase af sygdommen og hjælpe med at personliggøre behandling [10]. På molekylært niveau, er carcinogenese af spiserøret menes at være en kompleks proces, der involverer multiple genetiske abnormiteter og miljømæssige faktorer. Talrige undersøgelser rapporterer specifikke ændringer i proteiner, gener og metaboliske veje i EAC der kan være nyttige til at hjælpe ved diagnose, prognose og behandling af esophageal cancer [11], [12], [13], [14]. Microarray undersøgelser har også fokuseret opdagelse af nye markører baseret på individuel tumor genetiske sammensætning [15]. Men pålidelige markører, især på et tidligt og potentielt helbredende fase, er stadig i stor efterspørgsel.

Metabolomics, også kendt som metabolisk profilering og metabonomics, er en hurtigt voksende område i systembiologi og tilbyder en kraftfuld og lovende fremgangsmåde til at identificere biomarkører associeret med cancer og andre sygdomme. Metabolomics fokuserer på at udlede af koncentrationerne og fluxe af lavmolekylære metabolitter ( ~ 1 kDa) i kropsvæsker eller væv, der giver detaljerede oplysninger om de biologiske systemer og deres aktuelle status [16], [17]. Massespektrometri (MS) og nuklear magnetisk resonans (NMR) spektroskopi er de to mest magtfulde og almindeligt anvendte analysemetoder til metabolisk fingeraftryk [17], [18]. De to metoder supplerer hinanden; mens MS er meget følsom, NMR er meget kvantitativ og reproducerbar. Udnyttelse af både MS og NMR-metoder fører til den rutinemæssige undersøgelse af over 1000 metabolitter.

Der er rapporteret Et stigende antal metabolomics undersøgelser til påvisning af forskellige kræftformer [19], [20], [21], [22 ], [23]. Men undersøgelser, der fokuserer på ØK er stadig relativt lille i antal. For nylig rapporterede to papirer på analysen af ​​væv metabolitter bruge magi-vinkel spinning (MAS) NMR og gaschromatografi (GC) MS hver kombineret med multivariate statistiske metoder [24], [25]. Begge værker rapporterede en række statistisk signifikante karakteristiske metabolitter. En anden

1H NMR studie undersøgte humant plasma og identificerede variationer i flere metabolitkoncentrationer forbundet med ØK, der afveg blandt etniske grupper [26]. har været fokuseret indsats i vores laboratorium på udviklingen af ​​metabolomics værktøjer og biomarkør kandidater til at påvise tidlige EAC og til at identificere patienter med høj risiko for at udvikle ØK. Vi har for nylig rapporteret metabolomics-baserede undersøgelser af ØK med

1H NMR-spektroskopi og viste, at otte serum metabolitter differentieret ØK fra raske kontrolpersoner [27]. Vi målrettet også en række nukleosider i serum ved hjælp af væskekromatografi-tredobbelt firedobbelt (LC-QQQ) MS og viste meget betydelige forskelle i en række normale og denatureret nukleosider i ØK [28]. Med det mål at øge følsomheden og specificiteten af ​​klassifikationen patienten samt identificere personer med risiko for at udvikle kræft, i denne undersøgelse, vi anvendte global metabolisk profilering tilgang til serumprøver fra ØK, BE og HGD patienter og raske kontrolpersoner hjælp meget følsomme og løst time-of-flight massespektrometri kombineret med væskekromatografi (LC-TOF) MS. Metaboliske profiler blev analyseret separat og i kombination med tidligere afledte metabolit markører ved hjælp NMR-metoder [27]. Vi evaluerede kombinationen af ​​NMR og MS-data i form af deres ydeevne ved klassificering EAC patienter og raske kontroller i forhold til udførelsen af ​​enten MS eller NMR-data alene. Evnen af ​​de metaboliske profiler til at skelne højrisikopersoner (BE og HGD patienter) fra ØK samt raske kontrolpersoner blev undersøgt. Vi identificerede også et antal metabolitter, der fungerede som trend markører, idet deres gennemsnitlige niveauer øges /faldt kontinuerligt fra raske kontrolpersoner til højrisiko-fag og derefter ØK patienter.

Materialer og metoder

kemikalier

Deuteriumoxid (99,9% D) blev indkøbt fra Cambridge Isotope Laboratories, Inc. (Andover, MA). Trimethylsilylpropionic syre-d

4 natriumsalt (TSP), tridecansyre, chlorphenylalanin, mælkesyre, valin, leucin, isoleucin, methionin, carnitin, tyrosin, tryptophan, myristinsyre, margarinsyre, linolensyre, linolsyre og pyroglutaminsyre blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (analytisk kvalitet, St. Louis, MO). 5-hydroxytryptophan blev købt fra Alfa-Aesar (analytisk kvalitet, Ward Hill, MA). HPLC-grade methanol og eddikesyre blev indkøbt fra Fisher Scientific (Pittsburgh, PA). Deioniseret vand blev opnået fra en EASYpure II UV vandrensningssystem (Barnstead International, Dubuque, IA).

Serum prøvetagning og opbevaring

Fastende blodprøver fra patienter med histologisk påvist ØK (n = 67), HGD (n = 9) og BE (n = 3) blev indsamlet ved Indiana University School of Medicine (Indianapolis, IN). De detaljerede clinicopathologic karakteristika EAC patienter blev beskrevet i vores tidligere papir [27], og en sammenfatning er vist i tabel S1. Vi brugte 68 ØK, 11 HGD og 5 BE prøver i den tidligere NMR studiet. Men på grund af de begrænsede mængder af nogle prøver, vi fjernet en ØK, 2 HGD og 2 BE prøver for LC-MS eksperimenter og yderligere analyse i dette arbejde; de tilsvarende NMR-data blev også udelukket fra den kombinerede analyse og diskussion. Blodprøver fra raske frivillige (n = 34) blev opnået under fastende betingelser. Hver blodprøve blev lov til at koagulere i 45 minutter og derefter centrifugeret ved 2.000 rpm i 10 min. Serummet blev opsamlet, alikvoteret i et separat hætteglas, frosset, og sendes på tøris til Purdue University (West Lafayette, IN), hvor de blev opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Alle prøver blev indsamlet efter den protokol, der er godkendt af Indiana University School of Medicine og Purdue University Institutional Review Boards. Alle fag indgår i undersøgelsen forudsat skriftligt informeret samtykke i henhold til institutionelle retningslinier.

prøveforberedelse og dataopsamling

For LC-MS-analyse, blev frosne serumprøver optøet, og proteinet blev udfældet ved blande 100 pi serum og 200 pi kold methanol. To interne standarder, tridecansyre og chlorphenylalanin var også inkluderet for at overvåge udvindingen effektivitet. Blandingen blev centrifugeret ved 13200 rpm i 10 min. Supernatanten opløsning opnået efter fjernelse af protein blev tørret under vakuum og den opnåede rest blev rekonstitueret i 15 pi methanol /vand (01:01) opløsning. Den resulterende opløsning blev igen centrifugeret ved 13200 rpm i 10 minutter til fjernelse af partikelformet stof, om noget, og supernatanten blev overført til en LC hætteglas. Separat blev en poolet prøve opnået ved at sammenblande 20 pi fra hver af 20 humane serumprøver tilfældigt udvalgt fra alle prøverne, og metabolitterne blev ekstraheret under anvendelse af samme procedure som ovenfor. Denne samleprøve, benævnt kvalitetskontrol (QC) matrix prøve blev underkastet analyse periodisk mellem hver 10 prøver. QC eksempeldata tjente også som teknisk gentagelser hele datasættet til at vurdere proces reproducerbarhed. LC-MS analyse blev udført under anvendelse af en Agilent LC-QTOF systemet (Agilent Technologies, Santa Clara, Californien) bestående af en Agilent 1200 SL væskekromatografi koblet online med en Agilent 6520 time-of-flight massespektrometer. En 3 pi alikvot af rekonstitueret prøve blev injiceret på en 2,1 x 50 mm Agilent Zorbax Extend-C18 1.8 um partikel søjle med en 2,1 x 30 mm Agilent Zorbax SB-C8 3,5 um partikel guard kolonne, som var både opvarmet til 60 ° C. Serum metabolitter blev gradient-elueres ved 600 uL /​​minut under anvendelse af mobil fase A: 0,2% eddikesyre i vand og mobil fase B: 0,2% eddikesyre i methanol (2% til 98% B i 13 min, 98% B i 6 min ). Elektrosprayionisering (ESI) blev anvendt i positiv modus. MS grænseflade kapillar blev holdt ved 325 ° C, med en kappe gasstrøm af 9 l /min. Sprayen spænding for positiv ion injektion var 4,0 kV. Massen analysator blev scannet over et område på 50-1000

m

/

z

. Agilent MassHunter Workstation LC-TOF og QTOF Acquisition software (B.02.01) blev anvendt til automatisk peak opdagelse og massespektrum udfoldning.

Detaljerede procedurer for prøveforberedelse og NMR eksperimenter blev for nylig offentliggjort andre steder [27]. Kort fortalt blev frosne serumprøver optøet, og 200 pi blev blandet med 350 pi D

2O. Resulterende opløsninger blev overført til 5 mm NMR-rør. En 60 pi opløsning af TSP (0,12 mg /ml) i en forseglet kapillær blev anvendt som en intern standard, der fungerede som det kemiske skift reference (δ = 0,00). Alle

1H NMR-forsøg blev udført ved 25 ° C på et Bruker DRX-500 spektrometer udstyret med en tredobbelt resonans

1H invers detekteringsprobe med tredobbelt akse magnetiske feltgradienter.

1H NMR-spektre blev erhvervet ved hjælp af standard endimensionale CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill) puls sekvens med vand signal Formaetning. Hver datasæt blev i gennemsnit over 64 transienter under anvendelse 16 K tid domæne peger. Dataene blev Fourier transformeret efter multiplikation med en eksponentiel vindue funktion med en linje udvidelse af 1 Hz, og spektre var fase og baseline korrigeret ved hjælp af Bruker topspin software (version 3.0).

Dataanalyse

LC-MS-data blev behandlet ved hjælp Agilents MassHunter kvalitativ analyse software (version B.03.01) for sammensatte identifikation. En liste over ionintensiteter for hvert detekteret top blev genereret under anvendelse af en retentionstid (RT) indeks og m /z-data som identifikatorer for hver ion. Agilent MassHunter Workstation Mass Profiler Professional software (version B.02.00) blev derefter anvendt for forbindelse peak tilpasning. Et filter blev indstillet til fjernelse af eventuelle metabolit signaler, havde mangler toppe (ion intensitet = 1) i mere end 10% af prøverne i nogen gruppe. Peaks fra interne standarder blev også fjernet. Endelig blev Agilent Formula Database (Agilent, 2010) anvendes for forbindelse identifikation ved at matche den nøjagtige massespektrum til en database med metabolit forbindelser. Uparret Students

t

-test analyse af dataene blev udført for at vurdere forskellene i detekterede sammensatte intensiteter blandt ØK, ​​BE og HGD prøver og raske kontrolpersoner. Metabolitter med lav

s

-værdier ( 0,05) blev udvalgt som potentielle biomarkør kandidater og verificeret fra massen spektre og RTS af autentiske kommercielle forbindelser køres separat. Fold-change (FC) for hver metabolit blev beregnet til at bestemme metabolit er variation mellem grupperne.

NMR spektrale regioner blev binned til 4 K spande af ens bredde (1,5 Hz) for at minimere fejl, som skyldes eventuelle udsving af kemiske skift skyldes pH eller ionkoncentrationen variationer. Hvert spektrum blev justeret til methyl top af alanin ved 1,48 ppm, og normaliseret ved hjælp af den integrerede TSP signalet. Spektralområder på 0,3 til 10,0 ppm blev anvendt til analysen efter sletning af vand og urinstof signaler (4,5 til 6,0 ppm). Univariate analyse blev udført ved at anvende den uparrede Students

t

-test at identificere væsentligt forskellige spektrale siloer blandt ØK, ​​BE og HGD patienter og raske kontrolpersoner. Placeringer, der viste signifikante forskelle mellem forskellige patient /styrer grupper blev derefter tildelt til de tilsvarende metabolitter ved at sammenligne kemiske skift og mangfoldigheder af toppe til litteraturen eller online databaser [29], [30], [31]. De karakteristiske spektrale områder for hver metabolit blev integreret, og

s

-værdier og fold ændringer mellem forskellige grupper blev beregnet.

MS /NMR-data for de udvalgte statistisk signifikante metabolitter (med

s

0,05) blev importeret til Matlab (R2008a, Mathworks, Natick, MA) installeret med en PLS værktøjskasse (version 4.1, egenvektor Research, Inc., Wenatchee, WA) for PLS-DA-analyser. X matrix bestående af de MS /NMR spektrale data, blev skaleres automatisk før alle statistiske analyser. Afhængigt af gruppen, blev hvert individ tildelt en “0” (dvs. patient) og “1” (dvs. sund kontrol) for at tjene som (endimensionale) Y matrix. Leave-one-out cross validering (CV) blev valgt, og antallet af latente variable (LVs) blev udvalgt efter den mindste geometriske middelværdi fejl CV procedure. Forudsigelser blev foretaget visuelt ved hjælp af en Y-forudsagt scatter plot med en cut-off værdi valgt at minimere fejl i klassen medlemskab. R statistisk pakke (version 2.8.0) blev anvendt til at generere modtager drifts- egenskaber (ROC) kurver, beregne og sammenligne sensitivitet, specificitet og arealet under ROC-kurven (AUROC).

Resultater

LC-MS-spektret for hvert serum prøve bestod af mere end 5000 funktioner, hvoraf næsten 1400 toppe blev tildelt metabolitter ved hjælp af Agilent databasen. Toppe fra spektrene, der manglede i mere end 10% af prøverne fra enhver gruppe blev udeladt fra yderligere analyse. Anvendelsen af ​​dette filter og Agilent kemisk bibliotek resulterede i en total på ca. 200, der identificeres metabolitter mest fælles for alle grupperne. Endvidere at identificere specifikke metabolitter, der bedst korreleret med forskellene i biologiske status for de forskellige sammenligninger, biblioteket-identificerede metabolitter blev analyseret ved hjælp af univariat analyse. Resultaterne viste, at 40 metabolitter varierede betydeligt (

s

0,05) mellem enten ØK og raske kontrolpersoner, ØK og højrisikopatienter (BE og HGD patienter), eller højrisiko-patienter og raske kontrolpersoner. Tretten af ​​disse metabolitter kunne efterprøves af de massespektre og retentionstid for autentiske kommercielle forbindelser. Tabel S2 viser en liste over de efterprøvede metabolitter fra LC-MS sammen med deres formler, masser og opholdstider. Ligeledes som vist i tabel S3, femten patient-klasse differentierende metabolitter med lav

s

-værdier (

s Restaurant 0,05) opnået ved at integrere de relevante NMR toppe blev bekræftet ved at matche den observerede kemiske skift og mangfoldigheder med tidligere rapporterede data [29], [30], [31]

Resuméet af metabolit biomarkør kandidater fra LC-MS og NMR med deres

s

. – værdier og fold ændringer er vist i tabel 1. ANOVA blev også udført, og resultaterne, der nøje modsvares dem fra

t

-test (tabel S4). Men da vi var interesserede i at identificere individuelle markører, der adskiller hver af de tre patientkohorter separat, brugte vi de

t

-test data til at identificere markører for modelbyggeri. Den følsomhed, specificitet og AUROC værdier fra PLS-DA modeller af hver sammenligning er anført i tabel 2. Sammenligning af MS og NMR-data ved hjælp af

t

-test, hver for sig, viste ingen signifikante forskelle på grund af køn, alder eller cancer fase (

s

0,05) mellem ØK og kontroller (tabel S5)

Sammenligning metaboliske profiler mellem EAC patienter og raske kontrolpersoner

som vist i tabel 1, tolv metabolit markør kandidater påvist ved LC-MS opdelte EAC patienter og raske kontroller, og deres identitet blev bekræftet med autentiske forbindelser. Figur S1 viser box-og-knurhår grunde til peak intensiteten af ​​de 12 differentierende biomarkør kandidater. Som det ses i tabel 1 og figur S1, niveauerne af mælkesyre, carnitin og margarinsyre syre var højere, og de af valin, leucin /isoleucin (disse strukturelle isomerer kunne ikke adskilles med den aktuelle LC-metoden), methionin, tyrosin, tryptophan , 5-hydroxytryptophan, myristinsyre, linolensyre og linolsyre var lavere i EAC patienter sammenlignet med raske kontrolpersoner.

markør kandidater fra

1H NMR-analyse er blevet rapporteret i vores tidligere undersøgelse [27]. Kort beskrevet et sæt på 8 metabolitter, herunder β-hydroxybutyrat, lysin, glutamin, citrat, kreatinin, lactat, glucose og et ukendt molekyle var statistisk signifikant (

s Restaurant 0,05), og højere niveauer af hver af disse metabolitter i EAC prøver blev observeret (tabel 1).

Figur 1 viser sammenligning af resultater af 3 metaboliske profiler mellem EAC patienter og raske kontrolpersoner. En PLS-DA model ved hjælp af de tolv LC-MS afledt metabolitter (og leave-one-out cross værdiansættelse) forudsat 77% sensitivitet og 86% specificitet med en AUROC på 0,82. Tilsvarende analyse under anvendelse af de otte NMR afledte metabolitter billede 82% følsomhed og 88% specificitet med en AUROC på 0,86. Men når metabolit blev analyseret kombinere 12 LC-MS og de 8 NMR påviste metabolitter, modellen meget overlegen ydelse med både sensitivitet og specificitet på 91%, og en AUROC på 0,95.

(A ) Venstre, resultat af PLS-DA model med 12 metabolit markører fra LC-MS-analyser; midten, ROC-kurve ved hjælp af de cross-valideret forudsagte klasse værdier (AUROC = 0,82); højre, PLS-DA forudsigelse for BE og HGD prøver fra LC-MS-modellen sammenligner ØK og raske kontrolpersoner. (B) Samme som (A) undtaget anvendelse 8 metabolit markører fra NMR-analyser, (AUROC = 0,86); (C) Samme som (A) undtaget anvendelse af kombinationen af ​​LC-MS og NMR opdaget metabolit markører, (AUROC = 0,95).

For at evaluere BE og HGD prøver, de samme PLS-DA modellen blev anvendt, og resultatet er også vist i figur 1 (til højre). BE prøver gav et blandet resultat, og ingen tillid konklusion kunne foretages på grund af det lille antal prøver. Men de fleste af de HGD prøverne blev forudsagt som ØK i dette tilfælde. PLS-DA model baseret på NMR opdaget metabolitter, og modellen er baseret på at kombinere LC-MS og NMR opdaget metabolitter begge viste, at 7 ud af 9 HGD patienter blev angivet som værende magen til ØK prøver.

Sammenligning metaboliske profiler af ØK og højrisikopatienter

data for højrisikopatienter (BE og HGD patienter) blev kombineret til analyse på grund af deres små prøvenumre. Univariate analyse af data viste, at 7 LC-MS og 8 NMR påviste metabolitter varierede betydeligt mellem ØK og højrisiko patienter, som sammen med

s

-værdier og fold ændringer er vist i tabel 1.

PLS-dA modeller blev derefter bygget ved hjælp af LC-MS og NMR afledt metabolit signaler, separat og i kombination, for at teste klassificeringen nøjagtighed for de to patientgrupper, og resultaterne er vist i figur 2. LC -MS afledte metabolitter forudsat sensitivitet og specificitet på 83% og 80% henholdsvis med en AUROC på 0,87, og NMR afledte metabolitter forudsat både sensitivitet og specificitet på 77% med en AUROC på 0,72. Når data blev analyseret kombinere LC-MS og NMR afledte metabolitter, en følsomhed og specificitet på 67% og 97% blev opnået med henholdsvis en AUROC på 0,82. Her, selv om udførelsen af ​​modellen fra den kombinerede data var lidt bedre end fra NMR-data alene, modellen afledt af LC-MS detekteret metabolitter viste den bedste ydeevne. Ved testning kontrollen med de samme PLS-DA-modeller afledt af LC-MS opdaget, NMR opdaget og kombineret metabolitter, 22, 12 og 22 af 34 kontroller var over cut-off værdi, henholdsvis og blev derfor klassificeret som ikke værende ligner ØK patienter

(A) Venstre, resultat af PLS-DA model med 7 metabolit markører fra LC-MS-analyser.; midten, ROC-kurve ved hjælp af de cross-valideret forudsagte klasse værdier (AUROC = 0,87); højre, PLS-DA forudsigelse for de sunde kontrol ved hjælp af modellen er udviklet ved hjælp af LC-MS metabolitter sammenligner EAC og højrisiko patienter. (B) Samme som (A) undtaget anvendelse af 8 metabolit markører fra NMR-analyser, (AUROC = 0,72). (C) Samme som (A) undtaget anvendelse af kombinationen af ​​LC-MS og NMR opdaget metabolit markører, (AUROC = 0,82).

Sammenligning metaboliske profiler af raske kontrolpersoner og højrisikopatienter

Kun én metabolit, pyroglutaminsyre, påvist ved LC-MS, og tre NMR opdaget metabolitter, prolin, mælkesyre og en ukendt metabolit, afveg signifikant (

s

0,05) mellem høj-risiko patienter fra raske kontroller (tabel 1). Derudover en top som følge af N-acetyleret protein i NMR-spektrene viste en signifikant forskel mellem de to grupper. Mens niveauerne af pyroglutaminsyre, prolin og mælkesyre var højere i gruppen med høj risiko, de andre var lavere.

LC-MS og NMR-data for de højrisiko-individer og raske kontroller blev sammenlignet ved hjælp af PLS-DA-analyse (figur S2). Den enlige karakteristiske metabolit detekteret ved LC-MS, pyroglutaminsyre, havde en følsomhed og specificitet på 74% og 75%, henholdsvis med en AUROC på 0,76. En PLS-DA model baseret på NMR opdaget metabolitter forudsat en sensitivitet og specificitet på 68% og 92%, henholdsvis med en AUROC på 0,80. Den kombinerede analyse af dataene fra de to analysemetoder billede resultater svarende til den for NMR alene. Men alle de modeller undladt at give en klar forudsigelse af de ØK patienter, der bruger kun den store risiko og sunde kohorter, hvilket indikerer, at (ikke uventet) ØK patientprøver er nødvendige for at opbygge en succesfuld afsløring model.

Trends markører

Niveauer af metabolitterne mellem de tre grupper, EAC, BE HGD, og ​​raske kontroller blev sammenlignet ved hjælp af box-og-knurhår plots. Interessant, de gennemsnitlige niveauer for 12 af de metabolitter herunder mælkesyre, valin, leucin /isoleucin, methionin, tyrosin, tryptophan, myristinsyre, linolsyre, β-hydroxybutyrat, lysin, glutamin og citrat gradvis ændres med de gennemsnitlige niveauer for BE og HGD patienter falder i mellem niveauerne for raske kontrolpersoner og EAC (figur 3). Mens niveauerne for mælkesyre, 3-hydroxybutyrat, lysin, glutamin og citrat steg niveauerne for valin, leucin /isoleucin, methionin, tyrosin, tryptophan, myristinsyre og linolsyre formindskedes gradvist.

vandret linje i den midterste del af feltet median; bund og top grænser bokse, nedre og øvre kvartil; whiskers, 5. og 95 percentiler; åbne cirkler, outliers. De første otte markører blev påvist ved LC-MS, og de resterende fire blev påvist ved NMR.

Brug disse 12 markører, PLS-DA modeller blev igen bygget ved hjælp af LC-MS og NMR separat og i kombination, for at teste klassificeringen nøjagtighed for hver af de to gruppesammenligninger (figur 4). Figur 4A viser PLS-DA model for ØK v. De raske kontrolpersoner og forudsiger værdier for patienter med høj risiko. Modellen leveres en sensitivitet og specificitet på 89% og 90%, henholdsvis med en AUROC på 0,92, selv om prædiktiv test for BE og HGD ikke forbedres over at bruge de tidligere PLS-DA-model (figur 1B og C). Figur 4B viser PLS-DA modellen sammenligner ØK og patienten højrisikogruppen, hvilket resulterer i en følsomhed, specificitet og AUROC på 76% 70% og 0,78 hhv. I dette tilfælde blev der opnået en forbedring af den prædiktive test af kontrolpersoner, med 30 ud af 34 kontroller vises over cut-off line (ikke-ØK lignende). Men disse 12 markører kunne ikke anvendes, til at generere en klar klassificering mellem raske kontrolpersoner og udsatte patienter ved hjælp af PLS-DA, derfor er det ikke muligt at bruge en sådan model til at forudsige ØK (data ikke vist).

(A) Ydelse sammenligning af metaboliske profiler mellem EAC patienter og raske kontrolpersoner, AUROC = 0,92. (B) Ydelse sammenligning af metaboliske profiler mellem ØK og BE /HGD patienter, AUROC = 0,78.

Diskussion

Denne undersøgelse er fokuseret på at identificere karakteristiske metabolitter til etablering af forbedret klinisk biomarkører for ØK detektion, udvikling af en mere robust model klassificering, og indsigt i de ændrede metaboliske veje i ØK.

de differentierende metabolitter afledt af det enkelte LC-MS og NMR analyser viste tydelige forskelle i en række metabolitter mellem ØK og kontroller, og opnået gode klassificering nøjagtighed. Kombinationen af ​​metaboliske profiler fra de to metoder aktiveret adgang til et øget antal skelne metabolitter. Den prædiktive effekt af modellen afledt fra kombinationen af ​​MS og NMR-metoder udføres bedre i både sensitivitet og specificitet sammenlignet med resultaterne fra de enkelte analysemetoder. Den supplerende karakter af den kombinerede metaboliske pool afledt af de to metoder har bidraget til denne forbedring af modellen. Faktisk alle de LC-MS detekteret metabolit markør kandidater undtagen mælkesyre er forskellige fra dem detekteret ved NMR. Det skal dog understreges, at mens forbedringen i klassifikation var meget klar til at skelne ØK og kontrol, når de to analysemetoder blev kombineret den forbedrede ydeevne til at skelne høj risiko (BE og HGD) patienter versus ØK var mindre mærkbar og kun i de høje specificitet region (figur 1 og 2). Denne virkning skyldes sandsynligvis det lille antal højrisikopatienter og muligvis til variation af stofskifteforandringer i højere grad fra den ene patient til den anden, som begge kan gøre modelforudsigelse mere udfordrende.

Sammenligning af den enkelte metabolitter og de statistiske modeller udviklet ved hjælp af differentierende metabolitter i de tre grupper viste, at metaboliske profiler af BE og HGD patienter var forskellige fra både EAC patienter og raske kontrolpersoner. Progressive ændringer i niveauerne af 12 metabolitter afledt af LC-MS og NMR-metoder viser potentiale værktøj til at identificere BE og HGD patienter, der kan udvikle ØK (Figur 3). Dette er især vigtigt, da BE og HGD er væsentlige risikofaktorer for udvikling af ØK. Identifikation af metabolitter i disse patienter, som er potentielt prædiktiv for udviklingen af ​​ØK er særlig vigtig for forvaltningen af ​​hos patienter i risikogruppen.

Identifikation af de metaboliske veje er forbundet med specifikke metabolitter viser ændrede niveauer kan forbedre forståelsen af biologi og patologi i bane fra normal til esophageal sygdom og ultimativt kræft. Tidligere viste vi en forenklet pathway kort baseret på metabolit markører identificeret ved NMR og sammenlignet resultaterne med andre typer af cancere [27]. Med grundlag i denne model, figur 5 viser et mere detaljeret pathway kort forbundet med metabolit markører identificeret ved hjælp af både MS og NMR-metoder. Altered veje omfatter ændringer i aminosyremetabolismen, biosyntese og nedbrydning (glutamin, lysin, carnitin, valin, leucin /isoleucin, methionin, tryptophan, 5-hydroxytrytophan og tyrosin), glycolyse (lactat og glucose), ketonstoffer syntese og nedbrydning (